不同采收期紅旱蓮中金絲桃苷的含量測定

李 納，劉吉爽，張雅蓉，徐 犇，徐文慧，陳 新

（長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117）

紅旱蓮（Hypericum aseyron L.）為藤黃科金絲桃屬植物，藥用其全草。分布于我國東北地區(qū)及黃河、長江、珠江流域，生于荒坡、山野、路邊[1]。紅旱蓮中以金絲桃苷為代表的黃酮類化合物，其提取物具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化、組胺釋放抑制等作用[2-12]。該藥材未收載于《中華人民共和國藥典》（2015版）[13]中，藥材標(biāo)準(zhǔn)目前僅收載于《吉林省藥品標(biāo)準(zhǔn)》（1977年版）、《上海市中藥材標(biāo)準(zhǔn)》（1994年版）中，年代久遠(yuǎn)，已不能滿足市場對藥材質(zhì)量控制的需求。由于藥材質(zhì)量控制上的缺失，近年來，吉林省內(nèi)未見有醫(yī)院進(jìn)行使用，且未見有藥材商品流通?，F(xiàn)測定不同采收期紅旱蓮藥材中目標(biāo)成份含量，為確定藥材最佳采收期提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 AE 240型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司），HC-TP12B架盤藥物天平（上海醫(yī)療器械八廠），Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國Agilent公司），KQ-250B型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司），SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵（上海亞榮生化儀器廠），DZKW-4電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司），ZF-2C型暗箱式自動紫外分析儀（上海安靈電子儀器廠），硅膠G薄層板（青島海洋化工廠分廠），DFT150小型粉碎機（溫州頂歷醫(yī)療器械有限公司）。

1.2 材料與試劑 金絲桃苷對照品（批號：111521-201708，純度94.3%，中國食品藥品檢定研究院），紅旱蓮6批，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)張景龍教授鑒定均為藤黃科金絲桃屬植物黃海棠（Hypericum ascyron L.）的干燥地上部分，采集情況，見表1。

表1 試驗用紅旱蓮樣品采集情況

二氯甲烷（分析純，北京化工廠），乙醇（分析純，北京化工廠），甲醇（分析純，北京化工廠），甲酸（分析純，北京化工廠），磷酸（色譜純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所），乙腈（色譜純，德國Merck公司），三氯化鋁（分析純，沈陽市試劑三廠），娃哈哈純凈水（天津娃哈哈飲料宏振有限公司），純化水（實驗室自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 供試品溶液的制備 取本品粉末0.1 g，加甲醇10 mL，超聲處理10 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。

2.1.2 對照藥材溶液的制備 取紅旱蓮對照藥材0.1 g，加甲醇10 mL，超聲處理10 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，制成對照藥材溶液。

2.1.3 對照品溶液的制備 取金絲桃苷對照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.1.4 薄層條件 照薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液5～10 μL、對照藥材溶液5 μL、對照品溶液3 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上使成條狀，以二氯甲烷-甲醇-甲酸-水（10：6：1：2.5）下層為展開劑，薄層板置展開缸中預(yù)平衡20 min ，展開，取出，晾干，噴以5%三氯化鐵乙醇溶液。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的條斑。

2.2 高效液相供試品溶液制備法的選擇

2.2.1 紫外全波長掃描 取金絲桃苷對照品溶液，以60 %乙醇為空白溶液校正，照紫外-可見分光光度法，在200～800 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描。結(jié)果表明，金絲桃苷在360 nm處有最大吸收，故確定以金絲桃苷的檢測波長為360 nm。

2.2.2 流動相色譜條件考察 本試驗設(shè)計參考文獻(xiàn)[9-11]以及《中華人民共和國藥典》[13]中以金絲桃苷為含測指標(biāo)的方法，最終以乙腈為流動相A，以0.1%磷酸為流動相B，進(jìn)行梯度洗脫。

2.2.3 提取溶劑考察 對照品溶液的制備：取金絲桃苷對照品適量，精密稱定，加60 %乙醇制成每1 mL含25 μg的溶液，即得。供試品溶液的制備：取同一批藥材粉末（過3號篩）3份，取1 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入60 %乙醇、甲醇、30 %乙醇50 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用60 %乙醇、甲醇、30 %乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。 結(jié)果表明，60 %乙醇溶液作溶劑提取結(jié)果較高，所以選擇60 %乙醇溶液作為提取溶劑。

2.2.4 提取方式考察 取同一批藥材粉末（過3號篩）2份，每份約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入60 %乙醇50 mL，密塞，稱定重量，選擇2種方式提?。?00 ℃加熱回流提取、超聲提?。ǔ暪β?00 W，頻率45 kHz）各1 h，補足重量，搖勻，濾過，即得。結(jié)果表明，加熱回流提取效率較高，所以選擇加熱回流為提取方式。

2.2.5 提取溶劑體積考察 取同一批藥材粉末（過3號篩）3份，每份約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入60 %乙醇25、50、100 mL，密塞，稱定重量，分別回流提取2 h，補足重量，搖勻，濾過，對提取溶劑體積進(jìn)行考察。結(jié)果表明，提取溶劑為25 mL的提取率與50 mL相比提取率低，而50 mL與150 mL及100 mL無顯著性差異，所以確定提取溶劑量為50 mL。

2.2.6 提取時間考察 取同一批藥材粉末（過3號篩）3份，每份約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入60 %乙醇50 mL密塞，稱定重量，分別選擇：分別回流提取0.5、1、2 h，補足重量，搖勻，濾過，對提取時間進(jìn)行考察，結(jié)果以1 h為最佳提取時間。

2.2.7 供試品制備方法確立 對照品溶液的制備：取金絲桃苷對照品適量，精密稱定，加60 %乙醇制成每1 mL含25 μg的溶液，即得。供試品溶液的制備：取本品，研細(xì)（過3號篩），取1 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入60 %乙醇50 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用60 %乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)驗證

2.3.1 線性及范圍 精密稱取金絲桃苷對照品適量，加60 %乙醇溶液溶制成每1 mL含金絲桃苷140 μg的溶液，即得。分別精密吸取上述金絲桃苷對照品溶液1.0、2.0、4.0、6.0、7.0、10.0 mL于25 mL量瓶中，用60 %乙醇定容，即得。以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動相A，以0.1%磷酸為流動相B，進(jìn)行梯度洗脫；檢測波長為360 nm；理論板數(shù)按金絲桃苷峰計算應(yīng)不低于3 000。

2.3.2 測定方法 精密吸取上述對照品溶液10 μL，分別注入液相色譜儀，依法測定，以對照品的濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以對照品的峰面積為縱坐標(biāo)（Y），對照品的濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程金絲桃苷Y = 21.919 X + 7.584 6，r = 0.999 7，線性范圍5.476 9～54.769 4 μg/mL，結(jié)果表明，在5.4769～54.769 4 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.3.3 專屬性試驗 為進(jìn)一步考察試驗的合理性，按照供試品溶液制法制得不含樣品的陰性對照溶液，依法測定，結(jié)果陰性對照液在與對照品峰相應(yīng)的保留時間處無色譜峰，表明無干擾，專屬性好。

2.3.4 重復(fù)性試驗 取同一份紅旱蓮藥材（HHL3），按正文擬定的方法制備供試品溶液6份，測定金絲桃苷的含量，結(jié)果金絲桃苷平均含量為0.13%，RSD為1.72%（n = 6）；說明本方法的重復(fù)性良好。

2.3.5 溶液穩(wěn)定性試驗 同一份供試品溶液（HHL3），按正文擬定的色譜條件，每隔一定時間測定1次，共考察24 h，測定6次，結(jié)果6次測定金絲桃苷平均峰面積為539.025 9，RSD % 為 0.45 %（n = 6）。

2.3.6 準(zhǔn)確度試驗 精密量取同法測定已知含量的供試品（HHL3）6份，每份約1 g，精密稱定，分別精密加入金絲桃苷對照品60 %乙醇溶液50 mL（濃度20.30 μg/mL），按供試品溶液制備方法制備，依法測定，計算回收率，平均回收率為96.75 %。

2.3.7 精密度試驗 對同一份供試品溶液（HHL3），按正文擬定的色譜條件，連續(xù)測定6次，結(jié)果金絲桃苷的平均峰面積為537.498 8，RSD %為0.20%（n = 6）。

2.3.8 耐用性試驗 不同柱溫、不同流速、不同廠家色譜柱的考察：取樣品溶液分別在兩根不同廠家的C18色譜柱上，在柱溫25、30、35 ℃，在流速0.8、0.9、1.0 mL/min，按正文的方法，進(jìn)樣，測定，結(jié)果見表2。

表2 耐用性試驗結(jié)果（n = 2）

2.3.9 樣品測定及限度確定 取6批不同產(chǎn)地的紅旱蓮藥材，按“含量測定”項下方法操作，測定含量，見表3。

結(jié)果表明，金絲桃苷含量為0.053%～0.132%，平均值為0.092%，考慮藥材采收時間不同，生長狀態(tài)不同，所以目標(biāo)產(chǎn)物含量差異較大。

表3 樣品測定結(jié)果（n = 2）

3 小結(jié)

本研究依據(jù)中醫(yī)藥基本理論，選擇以金絲桃苷為含測指標(biāo)對紅旱蓮藥材進(jìn)行含量測定。通過對紅旱蓮藥材功能主治的研究，發(fā)現(xiàn)紅旱蓮具有平肝、清肝火之效；其中作為主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)之一的金絲桃苷具有明顯的抗抑郁作用[14-15]。中醫(yī)很早就將抑郁癥的發(fā)病與肝臟聯(lián)系在一起，其認(rèn)為“世人因郁而致血病者多，凡郁皆肝病也，木中有火，郁甚則火不得舒，血不得藏而妄行”。這一觀點為后世治療肝郁之癥奠定了理論基礎(chǔ)[16-17]。因此，本研究選取金絲桃苷為紅旱蓮藥材的質(zhì)控指標(biāo)。

對以上6批不同采收期的紅旱蓮藥材含量測定結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)采收期為6、9月的2批紅旱蓮藥材中金絲桃苷的含量相對較低，而7、8月份等4批紅旱蓮藥材中含量測定指標(biāo)金絲桃苷的含量較高，均在0.13%左右。該結(jié)論為確立紅旱蓮藥材最佳采收期提供了科學(xué)依據(jù)。