鹿茸I型膠原對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞TGF-β1/Smad基因蛋白表達(dá)的影響

闞 默，石曉征，曲曉波

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春 130117）

骨質(zhì)疏松癥是一種全身代謝性骨病，與骨質(zhì)量下 降、成骨不足等原因有著密切的關(guān)聯(lián)[1-3]。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β/Smad信號(hào)通路參與了成骨細(xì)胞的增殖、分化過(guò)程，影響了成骨細(xì)胞活性與功能，成為了現(xiàn)代治療骨質(zhì)疏松藥物的研究熱點(diǎn)[4]。在此信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)的過(guò)程中，激活了轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）識(shí)別，活化了 Smad 2、 Smad 3蛋白[5-6]。Smad 2、Smad 3活化后與Smad 4形成異位復(fù)合物并進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，開(kāi)啟了細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)反應(yīng)級(jí)聯(lián)傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄，影響了成骨細(xì)胞增殖和分化，以及 I 型膠原蛋白的合成[7-8]。

鹿茸是我國(guó)珍稀名貴的動(dòng)物藥材，有“益精髓，強(qiáng)筋骨”之功效，并富含大量有助維持骨密度的膠原蛋白[9-11]。本課題組在此前的研究中成功從梅花鹿茸中提取了鹿茸I型膠原（SDC-I），同時(shí)發(fā)現(xiàn)了SDC-I可誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨的分化[12-14]。MC3T3-E1 細(xì)胞是C57BL6 乳鼠源性的成骨細(xì)胞，常用于骨細(xì)胞的機(jī)理研究[15]。本實(shí)驗(yàn)在前期工作基礎(chǔ)上，從MC3T3-E1細(xì)胞增殖和MC3T3-E1 細(xì)胞分泌的活性因子 TGF-β1、Smad2、Smad3 角度，對(duì)鹿茸I型膠原的作用機(jī)理進(jìn)行了深度研究，旨為鹿茸I型膠原抗骨質(zhì)疏松癥的治療提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑與藥品 成骨細(xì)胞株MC3T3-E1購(gòu)自于中科院上海細(xì)胞庫(kù)；SDC-I（相對(duì)分子質(zhì)量 3.1 × 104，質(zhì)量分?jǐn)?shù)56.89%）由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)分子藥理實(shí)驗(yàn)室制備；Trizol（美國(guó)Invitrogen公司）；H-DMEM 培養(yǎng)基（美國(guó) Gibco 公司）；胎牛血清（杭州天杭生物科技有限公司）；胰蛋白酶、乙二胺四乙酸（美國(guó)Sigma 公司）；青霉素、鏈霉素粉劑（華北制藥股份有限公司）；DNA Maker，Bio Teke super RT Kit，2×SYBR Real-time PCR premixture Kit（北京百泰克公司）；溴化乙錠（EB），10×loading buffer（日本Takara公司）；焦碳酸二乙酯（DEPC，北京鼎國(guó)公司）；引物由安徽通用生物系統(tǒng)有限公司合成；細(xì)胞裂解液、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、TGF-β1、Smad2、Smad3 ELISA試劑盒（美國(guó)RND公司）。

1.2 儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（日本 SHELLAB）；生物潔凈安全柜（蘇凈設(shè)備公司）； BT125D 型分析天平（德國(guó) Sartorius 公司）；5430R型冷凍離心機(jī)、倒置 顯 微 鏡 （日 本 OLYMPUS CK40）；Mastercycler 型PCR儀（德國(guó) Eppondorf 公司）；Min-Sub 型核酸電泳儀（美國(guó) Bio-Rad 公司）；FHB100 型制冰機(jī)（上海比朗公司）；Omega Lum C 型凝膠成像儀（美國(guó) Aplegen公司）；多功能酶標(biāo)儀（奧地利TECAN公司）。

2 方法

2.1 MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng) 將 MC3T3-E1細(xì)胞放置于含有10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中，青鏈素、鏈霉素各100 u/mL，于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 分組及給藥 實(shí)驗(yàn)分4組：空白對(duì)照組，只加培養(yǎng)液；SDC-I低劑量組（SDC-I-L），I 型膠原蛋白 0.2 mg/mL；SDC-I中劑量組（SDC-I-M），I 型膠原蛋白 0.4 mg/mL；SDC-I高劑量組（SDC-I-H），I 型膠原蛋白 0.6 mg/mL。

2.3 MC3T3-E1細(xì)胞活力測(cè)定 取傳代3次，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MC3T3-E1單細(xì)胞懸液，調(diào)整至細(xì)胞濃度為 5×104個(gè) /mL，接種到96孔板中，100 μL/孔 ，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)箱中孵育貼壁。分別加入不同濃度的SDC-I，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。每孔加MTT（5 mg/mL）10 μL后再次孵育4 h，棄去培養(yǎng)液，再加入DMSO溶液，150 μL/孔，振蕩混勻10 min，讓結(jié)晶溶解，通過(guò)多功能酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔吸光度，最后確定最佳給藥時(shí)間 。

2.4 TGF-β1/Smad信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)的檢測(cè) 應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)TGF-β1 、Smad2、Smad3基因的表達(dá)水平。取傳代3次，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MC3T3-E1細(xì)胞，用0.25%胰酶消化，將濃度為2×104個(gè)/mL細(xì)胞接種在24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行分組給藥，再連續(xù)培養(yǎng)48 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。收集細(xì)胞，采用Trizol一步法提取 RNA。瓊脂糖電泳檢測(cè)總RNA，取適量RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，其余加入無(wú)水乙醇1 mL混勻，置于- 80 ℃保存。按照 Bio Teke super RT Kit 說(shuō)明書配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液。設(shè)置程序：1）45 ℃，50 min；2）70 ℃，10 min。反應(yīng)結(jié)束后冰浴，4 ℃ 保存?zhèn)溆?。待反?yīng)結(jié)束后，通過(guò)超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)反轉(zhuǎn)錄液中cDNA的濃度。按照2×SYBR RT-PCR premixture Kit 說(shuō)明書配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液。采用“三步法”進(jìn)行RT-PCR 實(shí)驗(yàn)，設(shè)置反應(yīng)程序： 95 ℃，起始模板預(yù)變性。1）95 ℃，20 s；2）65 ℃，10 s；3） 72 ℃ ，30 s，循環(huán)次數(shù)為 40。記錄各組目的基因的融解曲線和擴(kuò)增曲線。內(nèi)參基因?yàn)棣?actin，記錄并分析各組目的基因的相對(duì)表達(dá)量，進(jìn)行差異性比較。引物序列，見(jiàn)表1。2.5 TGF-β1/Smad信號(hào)通路中相關(guān)蛋白含量檢測(cè) 用10 cm培養(yǎng)皿培養(yǎng)細(xì)胞（1×106個(gè)細(xì)胞），按照上述方法給藥后，用1 mL的0.01 mol/L PBS洗3次；加入300 μL的RAPI蛋白裂解液，冰上裂解30 min；將裂解液轉(zhuǎn)移到1.5 mL EP管中，12 000 r/min 4 ℃離心30 min，取上清。按BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行蛋白濃度的測(cè)定。將各組細(xì)胞總蛋白放- 80 ℃冰箱保存。利用ELISA法檢測(cè)TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白的表達(dá)，將各組成骨細(xì)胞總蛋白分別按TGF-β1、Smad2、Smad3酶聯(lián)免疫試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，通過(guò)多功能酶標(biāo)儀測(cè)定各孔OD值。

表1 RT-PCR引物堿基序列

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，進(jìn)行Student’s t檢驗(yàn)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x± s ）表示，以 P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 SDC-I對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖率影響 各組細(xì)胞給予不同濃度的SDC-I，通過(guò)MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖情況，見(jiàn)圖1（插頁(yè)二）。與空白對(duì)照組比較，SDC-I-L組、SDC-I-M組、SDC-I-H組均可以促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖，同時(shí)在48 h細(xì)胞增殖作用最為明顯（P＜0.05），所以選用SDC-I作用48 h后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3.2 各組MC3T3-E1細(xì)胞TGF-β1 mRNA、Smad2 mRNA、Smad3 mRNA 表達(dá)比較 見(jiàn)表 2。

3.3 各組MC3T3-E1細(xì)胞TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白含量比較 見(jiàn)表 3。

表2 各組 ME3T3-E1 細(xì)胞 TGF-β1 mRNA、Smad2 mRNA、Smad3 mRNA 表達(dá)比較（x± s ）

表3 各組ME3T3-E1細(xì)胞TGF-β1、Smad2、Smad3 蛋白含量比較（x± s ）

4 小結(jié)

鹿茸作為一種名貴中藥，具有壯腎陽(yáng)、益精血、強(qiáng)筋骨、調(diào)沖任的功效，含有大量與骨形成相關(guān)的I 型膠原蛋白[16-17]。前期研究發(fā)現(xiàn)，SDC-I能促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化。本研究發(fā)現(xiàn)， 經(jīng)SDC-I干預(yù)后的成骨細(xì)胞中，TGF-β1基因以及其相關(guān)Smad2/3基因表達(dá)水平明顯受到促進(jìn)，當(dāng)TGF-β1蛋白表達(dá)升高時(shí)，成骨細(xì)胞中的Smad2/3蛋白表達(dá)水平也明顯提升，這表明了通過(guò)上調(diào)TGF-β1、Smad2以及Smad3基因蛋白的表達(dá)，可以促進(jìn)成骨細(xì)胞中靶基因的表達(dá)，從而提高成骨細(xì)胞的分化，達(dá)到治療骨質(zhì)疏松癥的目的。為進(jìn)一步驗(yàn)證SDC-I治療骨質(zhì)疏松癥等代謝性骨疾病提供了新的有力依據(jù)。