針刺對心衰模型大鼠血漿中精氨酸加壓素濃度及水通道蛋白2表達(dá)的影響

治丁銘，孫 聰

（長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117）

心力衰竭的發(fā)病率在全世界呈上升趨勢，現(xiàn)代學(xué)者在解決各種心血管病變后，發(fā)現(xiàn)心力衰竭是目前世界上最難以攻克的問題之一[1]。心力衰竭嚴(yán)重影響人們的生命健康及生活質(zhì)量，成為亟待解決的問題。針刺不良反應(yīng)及毒副作用小，操作簡便，節(jié)省藥材，并可配合其他療法提高療效和縮短療程[2]。本實驗旨在觀察針刺對心衰模型大鼠血漿中精氨酸加壓素（AVP）濃度及水通道蛋白2（AQP2）表達(dá)的影響，并探討其可能的調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康Wistar大鼠60只，180～220 g，購自吉林大學(xué)實驗動物中心。

1.1.2 試劑與儀器 SYBRGreen PCR 試劑盒（ABI公司）；Real-time PCR 檢測儀（ABI-7300 ABI美國）；PCR擴(kuò)增儀；華佗牌針灸針（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）。

1.2 模型復(fù)制 采用阿霉素誘導(dǎo)及睡眠剝奪的方式造模[3]。阿霉素按3 mg/kg的劑量溶于1 mL生理鹽水中，腹腔注射，每周1次，共6周，同時對大鼠進(jìn)行睡眠剝奪（即連續(xù)5 d，每30 min鬧鐘響鈴1次），正常對照組注射等體積生理鹽水，共6周，6周后通過觀察模型組大鼠的心衰癥狀（即活動量、食欲、紫紺、水腫、尿量）和左室舒張末壓≥15 mmHg為心衰造模成功的主要指標(biāo)。

1.3 分組 將造模成功的實驗性心衰大鼠，隨即分為模型組、對照組、針刺治療組，共3組。

1.4 針刺方法 對照組、模型組分別灌胃10 mL/kg蒸餾水，連續(xù)灌胃1個月。治療組參照《實驗針灸學(xué)》[4]選擇雙側(cè)心俞穴、雙側(cè)腎俞穴、雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴針刺，1次/d，20 min/次。10 d為1個療程。

1.5 標(biāo)本采集 灌胃4周后，將大鼠斷頭處死，腹部正中切口，切開皮膚、肌肉、筋膜、腹膜，將腎組織周圍內(nèi)臟推向兩側(cè)，迅速取近髓腎組織，切半，一半浸泡在10%甲醛中固定48 h備用；一半置于- 80 ℃冰箱中備用。

1.6 大鼠水通道蛋白2（AQP2）mRNA表達(dá)的影響 通過組織總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄cDNA，將制備好的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)展，然后分別取PCR擴(kuò)展產(chǎn)物10 μL在1.0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，電泳終止后，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描、拍照，采用儀器自帶軟件（ABI Prism 7500 SDS Software）分析產(chǎn)物CT值，計算?CT值，并以GAPDH內(nèi)參照CT值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)校正，并通過軟件計算PCR產(chǎn)物的相對表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計算資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x± s ）表示，組間比較用t檢驗，多組間用單因素方差分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對各組大鼠血漿AVP 濃度的影響 見表1。

2.2 對各組大鼠水通道蛋白2（AQP2）表達(dá)的影響 見表2，圖1（插頁一）。

2.3 水通道蛋白2（AQP2）在大鼠腎組織的表達(dá)量變化 見圖2（插頁一）。

表1 對各組大鼠血漿AVP 濃度的影響（x ± s ，n = 20） μg/L

表2 對各組大鼠水通道蛋白2（AQP2）蛋白表達(dá)的影響（x± s ，n = 20）

3 討論

心力衰竭的發(fā)病因素多而復(fù)雜，其主要包括人口老齡化，不良的生活習(xí)慣，各種心血管疾病的不良預(yù)后，例如高血壓病、動脈硬化、房顫等均可引起心力衰竭的發(fā)生，可以說心力衰竭是一切心血管疾病發(fā)生、發(fā)展的終末階段，是心血管事件鏈的最終結(jié)局[5-8]。心力衰竭是一種復(fù)雜的臨床綜合征，同時伴有神經(jīng)內(nèi)分泌異常激活以及心肌重構(gòu)等分子機(jī)制異常，結(jié)果導(dǎo)致了衰竭的心臟出現(xiàn)進(jìn)展性惡化，為各種心臟病的末期表現(xiàn)，伴有耐力、體力差、水腫、衰竭和壽命縮短，因其病人多伴有水腫、胸水、腹水等，故也屬于水液潴留性疾病之一[9-12]。心力衰竭水潴留機(jī)制的主要途徑為心輸血量下降，血管加壓素水平升高，腎臟集合管V2受體激活，水通道蛋白（AQP2）激活和（或）基因表達(dá)上調(diào)，水重吸收增加。AQP2主要受精氨酸加壓素（AVP）調(diào)控，而AVP通過腎臟V2受體調(diào)控AQP2，故AVP-V2受體-AQP2系統(tǒng)在調(diào)節(jié)機(jī)體水液代謝中起著重要作用[13-15]。

目前，大部分中醫(yī)學(xué)者將心力衰竭的病因病機(jī)分為內(nèi)因和外因，主要包括飲食不節(jié)，臟腑虛衰，氣滯血瘀，水濕內(nèi)停，痰濁閉阻等，認(rèn)為心力衰竭病因復(fù)雜，屬于虛實夾雜?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，心力衰竭屬于本虛標(biāo)實之證，且病機(jī)復(fù)雜，因病程中傳變五臟，故其癥狀和體征不完全相同，氣虛必致陽虛，虛則不能推動血液運行，血行遲滯而成瘀，水津代謝異常而成痰（飲）、成水，瘀、痰、水結(jié)于體內(nèi)，耗傷心氣、損傷心體而致心衰，故“虛”“瘀”“水”可概括心力衰竭的病機(jī)。心俞、內(nèi)關(guān)穴均為八脈交會穴，針剌心俞、內(nèi)關(guān)穴能運行氣血，調(diào)節(jié)陰陽，疏通經(jīng)絡(luò)，益氣升提?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為，針剌內(nèi)關(guān)穴對心率有雙相調(diào)節(jié)作用。

本研究結(jié)果表明，在末次針刺后60 min，針刺治療組與未治療的模型組相比AVP濃度明顯降低，并具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），針刺治療組血漿中AVP濃度低于對照組，但無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

采用免疫組化、蛋白印跡方法檢測水通道蛋白2（AQP2）蛋白表達(dá)，免疫組化結(jié)果表明，對照組大鼠腎組織中AQP2蛋白呈陰性表達(dá)（-）；模型組大鼠腎組織中AQP2蛋白呈強(qiáng)陽性表達(dá)（+++）；針刺組大鼠腎組織中AQP2蛋白呈陽性表達(dá)（+）。蛋白印跡結(jié)果顯示，各組灰度值進(jìn)行對比。針刺組與模型組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），模型組與空白組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

模型組心衰大鼠AQP2-mRNA表達(dá)明顯升高，與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；針刺治療組與模型組比較AQP2-mRNA明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。