蜜環(huán)菌的優(yōu)化培養(yǎng)研究

梁 艷 ，蘇朝棉 ，周西貝 ，王鵬輝 ，郭 尚 ，王 華 ，張作剛

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801；2.南和縣農(nóng)業(yè)局，河北南和054400；3.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，山西太原030031）

蜜環(huán)菌（Armillaria mellea）又名榛蘑、蜜環(huán)蕈、苞谷蕈、青岡蕈等，是隸屬于擔(dān)子菌亞門的一種藥食兼用真菌，能兼性寄生于多種木本、草本植物等樹干基部、根部或倒木上[1-2]，廣泛分布于亞洲、歐洲、北美洲等地的溫帶地區(qū)，主要分布于我國20多個(gè)省區(qū)[3-5]。在傳統(tǒng)中藥材天麻、豬苓等的生長過程中，蜜環(huán)菌與它們之間存在極為特殊的營養(yǎng)關(guān)聯(lián)，是其必不可少的共生菌[6]。菌索入侵天麻的塊莖或豬苓的菌核后被其消化吸收，為它們提供營養(yǎng)[7-10]。蜜環(huán)菌菌索多生長于樹根組織中或土壤中，其功能高度分化，不僅可以運(yùn)送養(yǎng)分，還能生長分化，形成子實(shí)體，對不良環(huán)境有較強(qiáng)的抵抗力[11-14]。目前，國內(nèi)外對于蜜環(huán)菌的研究和探索，主要集中于生物學(xué)特性、化學(xué)成分、人工培養(yǎng)、與天麻的共生關(guān)系、藥理作用以及相關(guān)藥品的開發(fā)等方面[15-17]。其中，關(guān)于蜜環(huán)菌的人工培養(yǎng)是人們所關(guān)注的重要方面，進(jìn)一步研究和探索蜜環(huán)菌的培養(yǎng)，對于蜜環(huán)菌的研究和開發(fā)具有重要意義。

本試驗(yàn)研究了不同培養(yǎng)基質(zhì)對蜜環(huán)菌萌發(fā)時(shí)間、生長速度、菌索品質(zhì)和生長量的影響，以期篩選出最佳的蜜環(huán)菌生長條件，為蜜環(huán)菌的人工培養(yǎng)及工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 蜜環(huán)菌由河南盧氏提供。

1.1.2 培養(yǎng)基組分及試劑 胡蘿卜、松針、豆油、麩皮、蘋果枝、木屑、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉、蛋白胨、牛肉膏、尿素、瓊脂、乙醇、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、維生素B1。

1.2 方法

1.2.1 不同碳源、氮源、培養(yǎng)基形態(tài)及活化時(shí)間對蜜環(huán)菌萌發(fā)和生長的影響

1.2.1.1 不同碳源培養(yǎng)基的制備 基礎(chǔ)培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，磷酸氫二鉀3 g，硫酸鎂1.5 g，瓊脂粉20 g，維生素 B110 mg，水 1 000 mL，pH 自然。分別在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入葡萄糖20 g，蔗糖20 g，麥芽糖20 g，淀粉20 g，制成不同的碳源培養(yǎng)基，保持培養(yǎng)基中碳含量等量，按照編號(hào)分裝到試管中，滅菌，接入蜜環(huán)菌觀察并記錄菌種的萌發(fā)和生長情況。每個(gè)配方重復(fù)3次。

1.2.1.2 不同氮源培養(yǎng)基的制備 制備基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入蛋白胨、牛肉膏、尿素各5g，制成不同的氮源培養(yǎng)基，保持培養(yǎng)基中氮含量相等，按編號(hào)分裝到試管中，滅菌，接入蜜環(huán)菌觀察并記錄菌種的萌發(fā)和生長情況。每個(gè)配方重復(fù)3次。

1.2.1.3 不同瓊脂含量的培養(yǎng)基制備 制備基礎(chǔ)培養(yǎng)基，保持培養(yǎng)基中碳、氮含量及成分相同，瓊脂的添加量按 0，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%這 5個(gè)濃度梯度，按編號(hào)分裝到180 mL的試管中，滅菌后，接入蜜環(huán)菌觀察并記錄菌種的萌發(fā)和生長情況（表1）。每個(gè)配方重復(fù)3次。

1.2.1.4 不同活化時(shí)間 將在冰箱冷藏的蜜環(huán)菌菌種放到25℃的恒溫培養(yǎng)箱中活化，設(shè)置活化時(shí)間為 12，24，36，48，60 h，并進(jìn)行編號(hào)。將活化好的菌種接種到不同培養(yǎng)基，3次重復(fù)，并放到25℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔12 h觀察并記錄菌種的萌發(fā)和生長情況一次，共記錄5次。

1.2.2 不同母種培養(yǎng)基對蜜環(huán)菌生長的影響 按表2制作7種培養(yǎng)基，高壓滅菌后，接種蜜環(huán)菌，25℃避光培養(yǎng)，14 d后沖洗掉蜜環(huán)菌索上附著的瓊脂，70℃下烘干至恒質(zhì)量，稱取質(zhì)量即為每瓶收獲的生物量。觀察記載蜜環(huán)菌菌索萌發(fā)所需時(shí)間、菌索密度、菌索頂端整齊度及生長滿瓶所需的天數(shù)。同上，制作7種培養(yǎng)基，將等量的培養(yǎng)基分裝在試管內(nèi)，滅菌后接種蜜環(huán)菌，25℃避光培養(yǎng)，每3 d測量蜜環(huán)菌菌索的生長長度。每個(gè)配方重復(fù)3次。

表2 不同母種培養(yǎng)基的配方

1.2.3 不同栽培種培養(yǎng)基對蜜環(huán)菌生長的影響選擇直徑1 cm左右的蘋果樹枝，截成長6 cm的枝段，并將兩端削成斜面。將蘋果枝、玉米芯在0.25%硝酸銨溶液中浸泡2 h，將胡蘿卜搗成泥。如表3制作4種培養(yǎng)基各250 mL，加入營養(yǎng)液至剛好淹沒固體。高壓滅菌，接種于三角瓶中，25℃避光培養(yǎng)14 d。菌索長滿瓶后，用溫水沖洗蜜環(huán)菌索，挑去雜質(zhì)木屑，70℃下烘干至恒質(zhì)量，稱取質(zhì)量即為每瓶收獲的生物量。每個(gè)配方重復(fù)3次。

表3 不同栽培種培養(yǎng)基的配方 %

1.2.4 不同添加物對蜜環(huán)菌生長的影響 在1000mL蒸餾水中加入100 g胡蘿卜小塊，煮20 min，過濾后制成胡蘿卜提取液。按體積計(jì)算分別添加0，1%，2%，5%，10%的胡蘿卜提取液作為處理 1，2，3，4，5，滅菌后，進(jìn)行接種培養(yǎng)。分別將胡蘿卜、乙醇、豆油添加物按表4加入培養(yǎng)基，滅菌，接種蜜環(huán)菌菌塊后置于搖床，在110 r/min，25℃避光條件下培養(yǎng)14 d。培養(yǎng)出的發(fā)酵產(chǎn)物過濾后放入烘干箱中干燥至恒質(zhì)量，用天平稱量。

將松針洗凈，60℃烘干并研磨，然后與水以1∶10的比例放入水浴鍋，90℃浸提1 h，提取2次，合并提取液，過濾，即制成松針浸提液。分別向PDA培養(yǎng)基添加0，5%，10%，20%，30%的松針浸提液制成培養(yǎng)基，高壓滅菌后，將蜜環(huán)菌菌塊接種于三角瓶中，25℃避光培養(yǎng)7 d后，沖洗掉蜜環(huán)菌索上附著的瓊脂，70℃下烘干至恒質(zhì)量，稱取質(zhì)量即為每瓶收獲的生物量，觀察不同濃度松針浸提液培養(yǎng)基對蜜環(huán)菌生長的影響。每種處理3次重復(fù)。

表4 液體發(fā)酵培養(yǎng)基不同添加物的量 %

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源、氮源、培養(yǎng)基形態(tài)及不同活化時(shí)間對蜜環(huán)菌萌發(fā)和生長的影響

2.1.1 對蜜環(huán)菌萌發(fā)時(shí)間的影響 不同碳源、氮源、培養(yǎng)基形態(tài)及不同活化時(shí)間對蜜環(huán)菌萌發(fā)時(shí)間的影響如表5所示。

表5 不同碳源、氮源、培養(yǎng)基形態(tài)及活化時(shí)間對蜜環(huán)菌萌發(fā)時(shí)間的影響 d

由表5可知，接種在不含瓊脂的1號(hào)培養(yǎng)基上的蜜環(huán)菌，當(dāng)活化時(shí)間為48 h時(shí)，蜜環(huán)菌的萌發(fā)時(shí)間較其他處理顯著縮短，為3.8 d。在其他不同瓊脂濃度的培養(yǎng)基上，48 h處理的平均萌發(fā)時(shí)間都最短。在2號(hào)（0.5%瓊脂）中36 h處理與24，48，60 h處理存在顯著性差異，但48 h處理與其他處理相比萌發(fā)時(shí)間顯著縮短；在3號(hào)（1.0%瓊脂）培養(yǎng)基中，24 h處理與48 h處理存在顯著差異，但48 h處理與其他處理相比萌發(fā)時(shí)間顯著縮短；在4號(hào)（1.5%瓊脂）培養(yǎng)基中，48，60 h處理無顯著差異，但48 h處理與其他處理相比萌發(fā)時(shí)間顯著縮短；在5號(hào)（2.0%瓊脂）培養(yǎng)基中，處理48 h較其他處理萌發(fā)時(shí)間顯著縮短，僅為4.8 d；在6號(hào)（蔗糖）培養(yǎng)基中，處理48 h時(shí)的蜜環(huán)菌萌發(fā)時(shí)間最短，僅為4.2 d；在7號(hào)（麥芽糖）、8號(hào)（淀粉）培養(yǎng)基中，36 h處理與48，60 h處理間存在顯著差異，48 h處理的蜜環(huán)菌較其他處理萌發(fā)時(shí)間縮短；在9號(hào)（蛋白胨）中，12 h處理與36，60 h處理存在差異，60 h處理蜜環(huán)菌較其他處理萌發(fā)時(shí)間縮短；在10號(hào)（牛肉膏）培養(yǎng)基中，60 h處理的蜜環(huán)菌與其他處理相比萌發(fā)時(shí)間顯著縮短，僅為4.1d；在11（尿素）培養(yǎng)基中各時(shí)間梯度不存在顯著差異。

2.1.2 對蜜環(huán)菌生長狀況的影響 把蜜環(huán)菌菌種活化48 h后接種到不同培養(yǎng)基上，通過分析得出，隨著瓊脂的濃度增加，菌索的分支在減少，菌索顏色由白逐漸變黃，菌索形態(tài)由纖細(xì)逐漸變粗，菌索密度增加；以淀粉為碳源的培養(yǎng)基前期萌發(fā)時(shí)菌索分支與葡萄糖、麥芽糖、蔗糖相比較多，菌索顏色在加深，菌索形態(tài)細(xì)弱，菌索密度也很?。灰耘Ｈ飧?、蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基菌索分支很多，三者的菌索顏色都較深，牛肉膏的菌索形態(tài)較粗，菌索密度也較大；而尿素為氮源的培養(yǎng)基菌索分支很少，形態(tài)纖細(xì)，密度較?。ū?）。

表6 蜜環(huán)菌在不同碳源、氮源及形態(tài)培養(yǎng)基上的生長情況

2.2 不同母種培養(yǎng)基對蜜環(huán)菌生長的影響

2.2.1 對蜜環(huán)菌菌索生長速度的影響 由表7可知，蜜環(huán)菌菌索前12 d生長速度快慢依次為：松針、胡蘿卜＋PDA、麥麩、牛肉膏、PDA加富、胡蘿卜培養(yǎng)基，蜜環(huán)菌菌絲生長速度最快的是松針培養(yǎng)基，前12 d平均高達(dá)9.88 cm，生長速度最慢的是木屑培養(yǎng)基，前12 d平均長度僅為3.33 cm，松針培養(yǎng)基生長長度是木屑培養(yǎng)基的3倍左右。

表7 不同母種培養(yǎng)基的蜜環(huán)菌菌索生長長度 cm

2.2.2 對蜜環(huán)菌菌索生物特性的影響 從表8可以看出，蜜環(huán)菌菌索萌發(fā)所需時(shí)間最短的是松針培養(yǎng)基，為3 d；最長的是PDA培養(yǎng)基和胡蘿卜培養(yǎng)基，為7 d。蜜環(huán)菌生物量最高的是松針培養(yǎng)基，然后依次是牛肉膏培養(yǎng)基、胡蘿卜＋PDA復(fù)合培養(yǎng)基、木屑培養(yǎng)基、麥麩培養(yǎng)基、PDA加富培養(yǎng)基和胡蘿卜培養(yǎng)基。其中，松針培養(yǎng)基的生物量是PDA加富培養(yǎng)基和胡蘿卜培養(yǎng)基的9倍。

松針培養(yǎng)基滿瓶所需時(shí)間最短，為15 d，其次依次是胡蘿卜＋PDA、牛肉膏、木屑、麥麩、PDA加富（胡蘿卜）培養(yǎng)基。松針培養(yǎng)基和牛肉膏培養(yǎng)基上的菌索濃密大、生長勢強(qiáng)、菌索頂端整齊程度高，木屑培養(yǎng)基的生長勢弱于松針培養(yǎng)基和牛肉膏培養(yǎng)基，麥麩培養(yǎng)基和PDA加富培養(yǎng)基上的菌索稀少、生長速度慢、菌索頂端整齊程度較差。

表8 不同母種培養(yǎng)基上蜜環(huán)菌菌索的生物特性

2.3 不同栽培種培養(yǎng)基對蜜環(huán)菌生長的影響

從表9可以看出，4號(hào)培養(yǎng)基上的蜜環(huán)菌平均生物量為17.07 g/L，明顯高于其他培養(yǎng)基，分別是1，2，3 號(hào)培養(yǎng)基生物量的 2.91，2.90，1.93 倍，說明4號(hào)培養(yǎng)基最適合培養(yǎng)蜜環(huán)菌的生長。

表9 不同栽培種培養(yǎng)基對蜜環(huán)菌生長的影響

2.4 不同添加物對蜜環(huán)菌生長的影響

從表10可以看出，從4種添加物對蜜環(huán)菌促長的最大生物量來看，松針浸提液促進(jìn)蜜環(huán)菌生長效果最強(qiáng)，添加量為30%（處理5）時(shí)，蜜環(huán)菌生物量最高，達(dá)30.97 g/L；豆油和乙醇次之，添加量分別在0.2%（處理3）和0.8%（處理4）時(shí)，二者蜜環(huán)菌生物量最高，分別為13.38，18.23 g/L；胡蘿卜添加物的蜜環(huán)菌生物量最小，濃度為5%（處理4）時(shí)，蜜環(huán)菌生物量最高，為7.76 g/L。

表10 培養(yǎng)基添加物對蜜環(huán)菌平均生物量的影響 g/L

3 結(jié)論與討論

國內(nèi)外對蜜環(huán)菌的探索主要集中在菌絲、菌索等發(fā)酵液的藥理成分研究及功效的研究上[18-22]，對人工栽培等方面的相關(guān)研究報(bào)道較少。本試驗(yàn)結(jié)果闡述不同培養(yǎng)物質(zhì)對蜜環(huán)菌菌株萌發(fā)及生長性狀的影響，從蜜環(huán)菌的4種不同培養(yǎng)條件中篩選出在培養(yǎng)基中添加一定量的松針液，更有利于促進(jìn)蜜環(huán)菌的生長。

從不同瓊脂添加量對蜜環(huán)菌生長的影響情況來看，蜜環(huán)菌更適合在菌索生長阻力小的液態(tài)培養(yǎng)基中生長。在不同氮源條件培養(yǎng)中，相比尿素培養(yǎng)基，蜜環(huán)菌更適合在以牛肉膏和蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基環(huán)境中生長，說明菌株在生長初期更適合利用牛肉膏和蛋白胨等多種氨基酸蛋白質(zhì)為營養(yǎng)物質(zhì)，尿素類單一有機(jī)化合物不能充分提供蜜環(huán)菌生長所需營養(yǎng)。通過添加松針或松針浸提液，發(fā)現(xiàn)能大幅度提高蜜環(huán)菌的生長速度和生物量，說明松針當(dāng)中含有某種物質(zhì)能夠促進(jìn)蜜環(huán)菌生長，因此，還需要對松針提取物中有效成分進(jìn)行分析。同時(shí)，本試驗(yàn)還存在一些需要完善的條件設(shè)置，比如不同的溫度、光照、pH值以及環(huán)境的含氧量高低對蜜環(huán)菌生長的影響還需進(jìn)一步試驗(yàn)探究。