HPLC測(cè)定黃精的指紋圖譜

李松濤，于 曉，耿翠翠，劉志萍，車 勇，孔 青

（山東醫(yī)藥技師學(xué)院，山東 泰安 271000）

黃精為百合科黃精屬植物，是中國(guó)常見的中藥材之一[1]，主要用于治療心血管疾病、糖尿病和提高免疫力、抗腫瘤等方面。黃精分布于華東、華北、西北、中南等區(qū)域，其藥材質(zhì)量隨生長(zhǎng)地理環(huán)境的不同差別很大[2]，加之黃精屬植物外觀上形狀相似，難以區(qū)分，嚴(yán)重阻礙高質(zhì)量黃精產(chǎn)業(yè)的發(fā)展及應(yīng)用[3]。已有研究通過測(cè)定單一成分葡萄糖含量評(píng)價(jià)黃精的質(zhì)量，但該指標(biāo)成分評(píng)價(jià)方法無法精確、全面地反映藥材質(zhì)量，其他對(duì)黃精藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方面的研究鮮有報(bào)道。

中藥色譜指紋圖譜方法是一種完整性、綜合性質(zhì)量控制方法，具有均一性和穩(wěn)定性[4]，在中藥如雪飛、丹參質(zhì)量控制方面廣泛應(yīng)用。本研究擬通過收集泰安不同地理位置的黃精，利用HPLC建立山東泰安的黃精指紋圖譜，并與其他區(qū)域黃精指紋圖譜進(jìn)行對(duì)比，以期為泰安黃精藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1 儀器與試材

1.1 儀器與試劑

安捷倫1260二元高效液相色譜儀，安捷倫G4212B 二極管列陣檢測(cè)器，安捷倫 Eclipse XDB-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），KH500B型超聲清洗器（昆山GRAD），明澈D24UV超純水系統(tǒng)（密理博中國(guó)），HH-W420水浴鍋（江蘇榮華），DHG-9076A電熱干燥箱（上海精宏），加熱回流設(shè)備；無水乙醇（COMIO），色譜級(jí)乙腈（Fisher Scientific）。

1.2 供試材料

山東黃精采于山東泰安，共10個(gè)批次。對(duì)照黃精采于河北，共2個(gè)批次（見表1）。標(biāo)準(zhǔn)品薯蕷皂苷元（111539）、薯蕷皂苷（111707）、人參皂苷Rb1（110704），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢驗(yàn)研究院。

表1 12批次黃精產(chǎn)地及采集信息

2 黃精指紋圖譜的建立與結(jié)果分析

2.1 色譜條件

安捷倫1260二元高效液相色譜儀，安捷倫G4212B二極管列陣檢測(cè)器，安捷倫Eclipse XDB-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流速1 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量40 μl，以乙腈（下文用體積分?jǐn)?shù)）和水為流動(dòng)相，采用二元梯度洗脫，梯度洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫程序

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精確稱取薯蕷皂苷元、薯蕷皂苷、人參皂苷Rb1標(biāo)準(zhǔn)品適量，用80 %乙醇溶解后通過0.45 μm濾膜過濾即得對(duì)照品溶液,對(duì)照品溶液濃度分別為薯蕷皂苷元（0.306 mg/ml）、薯蕷皂苷（0.304 mg/ml）、參皂苷Rb1（0.304 mg/ml）。

2.3 指紋圖譜供試品溶液的制備

黃精清洗后置于55 ℃烘箱烘干至恒重（約30 h），經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過篩（40目），將精密稱取的1 g黃精粉末加乙醇（φ=80 %）20 ml搖勻，于86℃水浴裝置中回流提取3 h，熱過濾取濾液，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過即得樣品。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 精密稱取HJ-1批次黃精1 g，依照“2.3”方法制備樣品溶液，用HPLC按照“2.1”色譜條件連續(xù)測(cè)定5次記錄指紋圖譜，以14號(hào)峰為內(nèi)參照峰，得各共有峰相對(duì)峰面積RSD為0.134 %～1.633 %，相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.022 %～0.182 %，結(jié)果表明，儀器具有良好的精密度[5]。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取5 份同一藥材的粉末樣品，依照“2.3”方法制備樣品溶液，用HPLC按照“2.1”色譜條件測(cè)定, 以14號(hào)峰為內(nèi)參照峰，計(jì)算16個(gè)分離度好的主組分峰的相對(duì)峰面積RSD為0.266 %～1.742 %，相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.037 %～0.435 %之間，結(jié)果表明，該提取方法具有良好的重復(fù)性[5]。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批次黃精藥材粉末，按照“2.1”色譜條件，分別于 0，3，6，9，12，24 h 依次進(jìn)行進(jìn)樣測(cè)定，以峰14為內(nèi)參比，計(jì)算出16個(gè)分離度好的主要組分的相對(duì)峰面積RSD為0.136 %～1.633 %，相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.026 %～0.286 %，結(jié)果表明，樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性好[5]。

2.5 指紋圖譜的建立與分析

對(duì)采集的10批山東泰安的黃精樣品分別按“2.3”方法處理制成供試品溶液，注入高效液相色譜儀按“2.1”色譜條件測(cè)定。通過分析比較10批次樣品的HPLC色譜圖，將吸收強(qiáng)、穩(wěn)定性好的16個(gè)峰標(biāo)定為共有特征峰，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.21 %～1.86 %，表明以此為基準(zhǔn)建立的黃精藥材主要成分對(duì)照指紋圖結(jié)果可靠。通過共有模式生成法即將10批黃精樣品的指紋圖譜測(cè)定結(jié)果導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件中進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，設(shè)置參照?qǐng)D譜后多點(diǎn)校正生成對(duì)照?qǐng)D譜[6]（見圖1），各共有峰相對(duì)保留時(shí)間為0.2239，0.2544，0.276，0.3538，0.3765，0.4194，0.4848，0.51，0.5298，0.7616，0.8059，0.9363，0.9823，1，1.0762，1.1523。各批次間的相似性均在0.9以上,表明這10批次黃精藥材間相似性良好。通過查閱文獻(xiàn)，以薯蕷皂苷元、薯蕷皂苷、人參皂苷Rb1為標(biāo)準(zhǔn)品分別注入液相色譜儀進(jìn)行比對(duì)[7-8]，結(jié)果表明，6號(hào)峰為薯蕷皂苷元，13號(hào)峰為人參皂苷Rb1。

圖1 山東泰安黃精參照峰圖譜

2.6 不同批次黃精指紋圖譜的比較

山東泰安黃精確定的16個(gè)共有峰在這10個(gè)不同批次的黃精藥材中均能檢測(cè)到（見圖2），表明10批藥材主要活性成分相似。各產(chǎn)地黃精樣品中5，7，8，9，14峰的峰面積較大，表明5個(gè)指紋峰對(duì)應(yīng)的成分在泰安黃精中占比較大為主要成分。不同批次間相同成分含量有明顯差異，5，7，8，9號(hào)峰在各批次的差異明顯。將10批黃精藥材指紋圖譜分析結(jié)果導(dǎo)入中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)體系中以16個(gè)共有指紋峰的峰面積為基本參數(shù)，對(duì)10個(gè)批次黃精的相似性進(jìn)行評(píng)價(jià)，各批次黃精間相似性均在0.9以上，批次1，2，5，6四個(gè)批次的相似性在0.99以上，批次3，4，7，8，9，10六個(gè)批次的相似性在0.99以上。批次1，2和批次5，6的成分明顯低于其他6個(gè)批次，初步推斷海拔高度造成的地理位置差異影響藥材成分含量差異，有待進(jìn)一步研究。

圖2 不同批次的泰安黃精指紋圖譜比較

2.7 不同產(chǎn)地黃精指紋圖譜的比較

由圖3可見，山東泰安黃精中共鑒定出16個(gè)共有峰，河北黃精中共鑒定出12個(gè)共有峰。山東泰安黃精中的1，2，3，6，10號(hào)峰在河北黃精中未檢測(cè)到，河北黃精的3號(hào)峰在山東泰安黃精中沒有檢測(cè)到，其余11個(gè)峰在泰安黃精和河北黃精中均能檢測(cè)到，為共有峰。綜合對(duì)比，泰安黃精和河北黃精的指紋圖譜差異明顯，可用指紋圖譜對(duì)泰安黃精和河北黃精進(jìn)行區(qū)分。

圖3 山東黃精和河北黃精指紋圖譜對(duì)比

3 結(jié)論與討論

3.1 黃精成分的定量評(píng)價(jià)

黃精藥材在陜西、河北等地分布較為廣泛，通過綜合對(duì)比山東泰安黃精和河北主產(chǎn)區(qū)黃精指紋圖譜，表明可通過指紋圖譜區(qū)分兩個(gè)產(chǎn)地的黃精。標(biāo)準(zhǔn)品匹配確定6號(hào)峰為薯蕷皂苷元，13號(hào)峰為人參皂苷Rb1，由于此兩種成分在各批次中含量較少，未做指標(biāo)成分評(píng)價(jià)。本研究發(fā)現(xiàn)5，9，14號(hào)峰在12個(gè)批次黃精指紋圖譜中峰面積均較大，但仍不清楚其成分，可進(jìn)一步研究其結(jié)構(gòu)和物質(zhì)確定以完善黃精質(zhì)量評(píng)價(jià)。本研究?jī)H通過對(duì)比指紋圖譜評(píng)價(jià)黃精質(zhì)量存在一定局限性，還需結(jié)合多糖多指標(biāo)成分等進(jìn)行定量分析以做出綜合評(píng)價(jià)[9-10]。

3.2 黃精質(zhì)量的影響因素

通過泰安黃精10個(gè)批次指紋圖譜的對(duì)比分析，采集于海拔較高的山區(qū)的4個(gè)黃精批次和其余6個(gè)采集于平地的黃精成分含量存在明顯差異，表明海拔是影響黃精成分的因素之一。由于本研究采集樣品數(shù)量有限，其他生長(zhǎng)地理環(huán)境對(duì)黃精成分的影響有待進(jìn)一步展開研究。

3.3 提取方法及色譜條件的改進(jìn)

分別對(duì)比了超聲提取和加熱回流提取兩種提取方式，超聲提取的樣品峰較少，本試驗(yàn)選定加熱回流方法作為黃精藥材指紋圖譜供試品溶液的提取方法。取多份同一產(chǎn)地黃精藥材各1 g，以相同色譜條件下的色譜峰數(shù)目作為考察指標(biāo)，提取溶液（乙醇φ=50 %，60 %，70 %，80 %，90 %，無水乙醇），提取溶液與樣品量比（10倍，15倍，20倍，25倍），加熱回流時(shí)間（30，60，90，120，150，180，210 min），結(jié)果表明，黃精藥材用φ=80 %乙醇，20倍其質(zhì)量條件下加熱回流提取3 h，提取效果較好。用安捷倫1260二元高效液相色譜儀，安捷倫 G4212B 二極管列陣檢測(cè)器經(jīng)多波長(zhǎng)（190～400 nm）考察后確定203 nm為本實(shí)驗(yàn)方法的檢測(cè)波長(zhǎng)。同時(shí)還考察了不同柱溫對(duì)分離的影響，結(jié)果表明，30 ℃時(shí)分離最好。同時(shí)用甲醇-水和乙腈-水兩種體系等梯度和不同梯度進(jìn)行洗脫，結(jié)果表明，乙腈-水溶液作為流動(dòng)相，峰形較好，分離度好。在樣品處理過程中，熱過濾效果明顯高于冷卻后過濾的效果，初步推測(cè)是黃精成分中多糖物質(zhì)的干擾，有待進(jìn)一步探討。