桑葚與紅糖初始質(zhì)量比對(duì)桑葚酵素抗氧化活性的影響

何 偲，黃元霞，邱忠平，李 萍，徐 柳

（西南交通大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都 610031）

關(guān)鍵字：桑葚；酵素；紅糖；抗氧化物質(zhì)；抗氧化活性

人體因新陳代謝和外界因素的影響會(huì)不斷產(chǎn)生自由基，自由基的過量產(chǎn)生會(huì)打破人體正常平衡而引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞損傷和變異，從而加速衰老，并引發(fā)各種炎癥性疾病、糖尿病、甚至誘發(fā)癌癥[1-3]。酵素是以水果或蔬菜為原料，添加一定比例的糖發(fā)酵而成，其中富含維生素C、總酚、花色苷、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等具有抗氧化活性的物質(zhì)，能抑制或消除自由基，阻止機(jī)體細(xì)胞受到自由基的損害，減少機(jī)體的損傷和疾病的發(fā)生[4-5]。但這些抗氧化物質(zhì)穩(wěn)定性較差，容易受到pH值、溫度、有機(jī)酸、光照、氧、糖含量等影響而發(fā)生變化[6]。因此，減少抗氧化物質(zhì)的流失是未來保健食品的研究重點(diǎn)。紅糖富含蔗糖、氨基酸、微量元素、抗氧化性物質(zhì)等成分，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。適量的紅糖對(duì)保持酵素營(yíng)養(yǎng)成分含量和提升抗氧化活性具有重要意義。

目前，我國(guó)對(duì)酵素的抗氧化性研究大多集中在其發(fā)酵過程中抗氧化性能的變化規(guī)律[7-8]，關(guān)于紅糖比例對(duì)酵素抗氧化性能的影響研究未見報(bào)道。本文以不同比例的桑葚與紅糖制作的酵素為研究對(duì)象，比較其中的維生素C、總酚、花色苷等抗氧化活性物質(zhì)含量及其抗氧化活性。并應(yīng)用模糊數(shù)學(xué)綜合分析法得出最優(yōu)的桑葚與紅糖初始質(zhì)量比例，為開發(fā)具有高抗氧化性的酵素產(chǎn)品提供理論基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Eppendorf 5427R臺(tái)式高速離心機(jī)（Eppendorf）；V-1100D型可見分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)）；JY5002電子天平（上海舜宇恒平）；UV-2450紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；SHZ-B水浴恒溫振蕩器（上海躍進(jìn)）；pHS-3C+總酸計(jì)（成都世紀(jì)方舟）；發(fā)酵罐（10 L，上海安買）。

1.2 材料

桑葚，紅糖（桂林百壽元食品公司），均為市售。

2 方法

2.1 桑葚酵素的制備

用無菌水輕輕沖洗桑葚表面除去塵土，在無菌環(huán)境下自然晾干；將紅糖在紫外燈下照射殺菌1 h。將桑葚與紅糖（總質(zhì)量為12 kg）分別按質(zhì)量比1:1，3:1，5:1，7:1，9:1加入已滅菌的發(fā)酵罐中混勻，分別編號(hào)為Ⅰ#、Ⅱ#、Ⅲ#、Ⅳ#、Ⅴ#，密封后置暗處常溫發(fā)酵360 d。為防止外源微生物的污染，所有操作均在無菌環(huán)境下進(jìn)行。

2.2 測(cè)定方法

采用pH計(jì)測(cè)定pH值；NaOH滴定法測(cè)定總酸[8]；3,5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定還原糖含量[9]；重鉻酸鉀氧化法測(cè)定酒精度[10]；紫外分光光度法測(cè)定維生素C含量[11]，F(xiàn)oli-Ciocalteu’s法測(cè)定總酚含量[12]，pH試差法測(cè)定花色苷含量[13]，結(jié)果分別以等價(jià)沒食子酸、抗壞血酸、矢車菊素-3-葡糖苷表示；取酵素的10倍稀釋液1 ml測(cè)定還原力、羥自由基清除率、超氧自由基清除率進(jìn)行，方法參照文獻(xiàn)[14]。

2.3 數(shù)據(jù)處理及分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為5個(gè)平行樣的平均值，采用Excel 2007對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行基本處理，SPSS 20.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性及相關(guān)性分析，模糊數(shù)學(xué)分析法綜合評(píng)判出最優(yōu)桑葚與紅糖比例。

3 結(jié)果

3.1 5組桑葚酵素理化指標(biāo)的比較

采用pH值、總酸、還原糖含量、酒精度作為桑葚酵素理化指標(biāo)，5組桑葚酵素的理化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果見表1。

表1 5組桑葚酵素的理化指標(biāo)比較（±s）

表1 5組桑葚酵素的理化指標(biāo)比較（±s）

注：**P＜0.01 vs Ⅰ#

組別 pH 蔗糖含量/mg·ml-1 還原糖含量/mg·ml-1 總酸/g·L-1 酒精度/%Ⅰ# 4.16 347.016±0.223 491.729±3.337 4.719±0.001 4.615±0.003Ⅱ# 3.63** 119.915±0.111** 186.453±1.539** 9.976±0.004** 5.849±0.003**Ⅲ# 3.91** 134.805±0.077** 89.060±0.214** 15.109±0.06** 8.342±0.006**Ⅳ# 3.77** 41.979±0.077** 33.469±0.233** 15.440±0.06** 6.858±0.005**Ⅴ# 3.78** 33.945±0.309** 3.680±0.203** 16.350±0.06** 4.833±0.003**

由表1可見，Ⅰ#的pH、蔗糖、還原糖含量最高（P＜0.01），總酸、酒精度最低（P＜0.01）。

表2 5組桑葚酵素的抗氧化活性比較（±s）

表2 5組桑葚酵素的抗氧化活性比較（±s）

注：**P＜0.01 vs Ⅰ#

組別 維生素/mg·ml-1 總酚/mg·ml-1 花色苷/mg·L-1 還原力 對(duì)羥自由基清除率/%對(duì)超氧自由基清除率/%Ⅰ# 90.348±0.879 14.935±0.606 101.553±3.654 0.283±0.003 36.142±0.115 12.171±0.061Ⅱ# 82.026±0.937** 16.244±0.610** 52.730±3.654** 0.072±0.003** 13.301±0.130** 13.675±0.558**Ⅲ# 94.727±1.573** 12.592±0.398** 46.871±3.904** 0.176±0.002** 14.338±0.167** 13.081±0.324**Ⅳ# 83.759±1.350** 12.394±0.484** 27.341±2.392** 0.157±0.003** 14.453±0.130** 16.855±0.314**Ⅴ# 82.708±0.764** 11.545±0.651** 21.482±2.392** 0.162±0.003** 16.833±0.410** 13.442±0.732**

3.2 5組桑葚酵素抗氧化活性比較

以桑葚酵素的維生素C、總酚、花色苷含量、還原力、對(duì)羥自由基清除能力和對(duì)超氧自由基的清除能力作為桑葚酵素抗氧化活性的指標(biāo)，結(jié)果見表2。

由表2可見，5組桑葚酵素的維生素C含量均高于80 mg/ml，Ⅰ#的維生素C含量略低于Ⅲ#，高于Ⅱ#、Ⅳ#、Ⅴ#（P＜0.01）。Ⅰ#的總酚含量為14.935 mg/ml，略低于Ⅱ#，高于Ⅲ#、Ⅳ#、Ⅴ#（P＜0.01）?；ㄉ蘸侩S著紅糖比例的降低逐漸降低，Ⅰ#的花色苷含量高于其余4組（P＜0.01）。由此可見，Ⅰ#即桑葚與紅糖初始質(zhì)量比為1:1時(shí)所得桑葚酵素的抗氧化物質(zhì)含量相對(duì)較高。

5組桑葚酵素中Ⅰ#的還原力、對(duì)羥自由基清除率最高，對(duì)超氧自由基清除率5組差別不大。由此可見，Ⅰ#即桑葚與紅糖初始質(zhì)量比為1:1時(shí)所得桑葚酵素的體外抗氧化活性相對(duì)較高。

3.3 模糊數(shù)學(xué)分析法評(píng)判結(jié)果

模糊數(shù)學(xué)分析法是模糊數(shù)學(xué)提供的一種解決多因素、多指標(biāo)評(píng)估問題的數(shù)學(xué)模型[15]。由于維生素C含量、總酚含量、花色苷含量等各抗氧化物質(zhì)含量和還原力、對(duì)羥自由基清除率、對(duì)超氧自由基清除率等抗氧化活性指標(biāo)在數(shù)據(jù)和單位上都有很大的差別，因此要對(duì)5組桑葚酵素的抗氧化活性進(jìn)行比較，不能單單通過比較某一個(gè)抗氧化性指標(biāo)的檢測(cè)數(shù)據(jù)，可以通過模糊數(shù)學(xué)分析法對(duì)各抗氧性指標(biāo)的檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行無因次化處理而進(jìn)行綜合分析。

首先選取五組桑葚酵素抗氧化性能評(píng)價(jià)的指標(biāo)體系U，U={uij}，其中i表示5組酵素的維生素C、總酚、花色苷、還原力、對(duì)羥自由基清除率、對(duì)超氧自由基清除率6項(xiàng)指標(biāo)，j表示組別數(shù)。uij表示i項(xiàng)指標(biāo)的第j組數(shù)值。再將表3中各抗氧化性指標(biāo)原始數(shù)據(jù)的平均值進(jìn)行極值標(biāo)準(zhǔn)化處理，構(gòu)成模糊轉(zhuǎn)化矩陣R，最大值記為1（maxij=1），最小值記為0（minij=0）。中間值（rij）根據(jù)模糊數(shù)學(xué)分析法所屬函數(shù)的定義進(jìn)行計(jì)算，即R=（rij），rij=（uij-minij）/（maxij-minij）。采用標(biāo)準(zhǔn)離差法計(jì)算權(quán)重。所得模糊轉(zhuǎn)化矩陣R結(jié)果見表3。

表3 模糊轉(zhuǎn)化矩陣R

通過等權(quán)和加權(quán)法分別對(duì)5組桑葚酵素的抗氧化活性進(jìn)行比較，數(shù)值越大表明其抗氧化性能越優(yōu)，所得結(jié)果見表4。

表4 模糊數(shù)學(xué)分析法結(jié)果及排序

綜合分析結(jié)果取等權(quán)和加權(quán)的和值，數(shù)值越大表明抗氧化活性越高。從表4可見，抗氧化活性排序依次為Ⅰ#＞Ⅲ#＞Ⅱ#＞Ⅳ#＞Ⅴ#。即桑葚與紅糖的初始質(zhì)量比為1:1時(shí)所得桑葚酵素的抗氧化活性最高。

3.4 抗氧化物質(zhì)與抗氧化體系之間的相關(guān)性分析

采用SPSS 20.0 對(duì)維生素C、總酚、花色苷3種抗氧化物質(zhì)和還原力、對(duì)羥自由基清除率和超氧自由基清除率3種抗氧化體系進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見表5。

表5 抗氧化物質(zhì)與抗氧化體系之間的相關(guān)性分析

由表5可見，抗氧化物質(zhì)與抗氧化體系間呈不同相關(guān)性。其中，花色苷與還原力、對(duì)羥自由基清除率和超氧自由基清除率呈顯著相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)r分別為0.631，0.853，0.589（P＜0.01）。

4 討論

4.1 初始糖含量與酵母菌對(duì)糖的轉(zhuǎn)化有直接聯(lián)系。酵素發(fā)酵過程中酵母菌利用桑葚和紅糖完成自身繁殖并將糖轉(zhuǎn)化為酒精等代謝產(chǎn)物。研究發(fā)現(xiàn)，5組桑葚酵素的酒精含量大小順序?yàn)椋?:1＞7:1＞3:1＞9:1＞1:1。這與馬兆瑞等[16]的研究結(jié)果一致，發(fā)酵產(chǎn)物的酒精含量隨著糖含量的增加而增加，但糖含量過高會(huì)抑制酵母菌的發(fā)酵，導(dǎo)致殘余蔗糖含量增加。因此，5組桑葚酵素的殘余蔗糖、還原糖含量隨著桑葚與紅糖比例的增加而逐漸減少。

4.2 酵素中高濃度的糖能阻止抗氧化物質(zhì)的氧化，有利于維生素C、總酚和花色苷的保存。維生素C、總酚、花色苷等抗氧化物質(zhì)隨著存放時(shí)間的延長(zhǎng)極易氧化損失。王亞楠等[17]發(fā)現(xiàn)，添加蔗糖能降低溶液中的含氧量，從而提高維生素C的保存率；樊金玲等[18]發(fā)現(xiàn)，蔗糖抑制花色苷的降解，從而提高了花色苷的貯藏穩(wěn)定性，且抑制程度與蔗糖濃度呈正相關(guān)。因此，雖然桑葚與紅糖初始比例為1:1時(shí)的桑葚質(zhì)量最少，但殘余蔗糖含量最高，所得酵素的維生素C、總酚、花色苷含量高。

4.3 還原力、對(duì)羥自由基清除率、對(duì)超氧自由基清除率通常是體外抗氧化活性的常用體系。維生素C、總酚、花色苷等抗氧化物質(zhì)具有抑制自由基產(chǎn)生或直接清除自由基、激活抗氧化酶體系等作用[19]。但各種抗氧化物質(zhì)在抗氧化活性體系中呈現(xiàn)不同的相關(guān)性[20-21]。本文通過SPSS 22.0對(duì)抗氧化物質(zhì)與體外抗氧化活性的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，花色苷與還原力、對(duì)羥自由基清除率和超氧自由基清除率呈顯著正相關(guān)，而維生素C、總酚與其無明顯相關(guān)性，表明花色苷含量對(duì)體外抗氧化活性影響最大。因此，初始質(zhì)量比為1:1時(shí)所得桑葚酵素的花色苷含量最高，其還原力、對(duì)羥自由基清除率也最強(qiáng)。

5 結(jié)論

應(yīng)用模糊數(shù)學(xué)分析法對(duì)桑葚酵素抗氧化活性進(jìn)行綜合評(píng)判，排序依次為：1:1＞5:1＞3:1＞7:1＞9:1。表明桑葚與紅糖初始質(zhì)量比為1:1時(shí)，所得桑葚酵素的抗氧化活性最高。