合江金釵石斛在不同采收期時(shí)多糖和石斛堿含量的比較

顏壽　趙庭梅　張雪琴　邢嘉懿　胡亞東　淳澤

中圖分類號(hào) R282.2；R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）01-0073-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.01.19

摘 要 目的：對(duì)不同采收年限與采收月份時(shí)合江金釵石斛的品質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行測定，為合江金釵石斛合理采收期的確定提供科學(xué)依據(jù)。方法：采收一年生、二年生和三年生金釵石斛莖，測定其折干率和多糖（比色法）、石斛堿（氣相色譜法）、總生物堿（比色法）含量以及有效成分總量率（石斛堿含量×折干率）等指標(biāo)；采收二年生秋冬季（第2年10月至第3年3月，每月15日采收）金釵石斛莖，測定其折干率和多糖、石斛堿含量。結(jié)果：二年生金釵石斛莖的折干率、多糖含量與有效成分總量率較一年生與三年生高，總生物堿、石斛堿含量為一年生（0.52%、0.48%）>二年生（0.48%、0.44%）>三年生（0.32%、0.22%）。從第2年10月至第3年3月，二年生金釵石斛莖的折干率逐月上升，多糖、石斛堿含量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，其中多糖含量在2月最高（17.32%），石斛堿含量于12月最高（0.51%）。結(jié)論：綜合植物開花特性、折干率、多糖與石斛堿含量等指標(biāo)，建議合江金釵石斛最適采收期為二年生的12月和1月（第三年開花前）。

關(guān)鍵詞 合江；金釵石斛；多糖；石斛堿；折干率；氣相色譜法；采收月份；生長年限

ABSTRACT OBJECTIVE： To determine quality indexes of Hejiang Dendrobium nobile at different harvesting time and months， and to provide scientific reference for reasonable harvesting period of Hejiang D. nobile. METHODS： The stem of annual， biennial and triennial D. nobile were collected. The drying rate， the contents of polysaccharides （colorimetry）， dendrobine （GC） and total alkaloids （colorimetry）， effective component total rate （dendrobine×drying rate） were measured. Biennial D. nobile were collected in autumn and winter （Oct. of the second year-Mar. of the third year， 15th day a month） to determine drying rate， the contents of polysaccharides and dendrobine. RESULTS： The drying rate， the contents of polysaccharides and effective component total rate were higher than annual and triennial D. nobile. The content of total alkaloids and dendrobine were in descending order： annual D. nobile （0.52%， 0.48%）>biennial D. nobile（0.48%， 0.44%）>triennial D. nobile （0.32%， 0.22%）. From Oct. of the second year to Mar. of the third year， the drying rate of biennial D. nobile was increasing month by month； the contents of polysaccharides and dendrobine increased firstly and then decreased； the content of polysaccharide was the highest in Feb. （17.32%）， and the content of dendrobine reached the highest level in Dec. （0.51%）. CONCLUSIONS： The optimal harvesting period is biennial Hejiang D. nobile in Dec. and Jan. （third years before flowering）， considering flowering characteristics， drying rate， the contents of polysaccharide and dendrobine.

KEYWORDS Hejiang； Dendrobium nobile； Polysaccharide； Dendrobine； Drying rate； Gas chromatography；Harvesting month； Growth years

金釵石斛（Dendrobium nobile Lindl）別名“吊蘭花” “扁金釵” “扁草” “扁黃草”，為蘭科多年生草本植物，因莖呈微扁形，兩頭窄、中部寬，加之表面金黃色或綠黃色，具有光澤，形如古代人頭上的發(fā)釵而得名。金釵石斛是我國傳統(tǒng)的名貴中藥，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中列為上品，其性寒，味甘、淡、微咸?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明，石斛在抑制腫瘤、抗衰老、提高人體免疫力、補(bǔ)五臟虛勞等方面有明顯效果[1]。合江縣是我國著名的金釵石斛道地產(chǎn)區(qū)之一，在明代已廣泛栽種[2]。2015年12月13日合江金釵石斛正式成為地理標(biāo)志產(chǎn)品。金釵石斛作為多年生植物，究竟應(yīng)該采收幾年生的莖一直尚未達(dá)成共識(shí)，并且未見關(guān)于合江金釵石斛合理采收期方面的文獻(xiàn)報(bào)道。傳統(tǒng)意義上的適宜采收期為秋冬季節(jié)，因此，筆者研究了合江金釵石斛不同采收期內(nèi)其品質(zhì)指標(biāo)的變化，希望能夠?yàn)楹辖疴O最佳采收期的確定提供科學(xué)依據(jù)，推動(dòng)合江金釵石斛產(chǎn)業(yè)健康有序地發(fā)展。

1 材料

1.1 儀器

FL9790氣相色譜儀（浙江福立分析儀器有限公司）； DB-1毛細(xì)管柱（美國安捷倫科技有限公司；以100% 二甲基聚硅氧烷為固定相，柱長為30 m，內(nèi)徑為0.25 mm，膜厚度為0.25 μm）；Varioskan Flash全波長掃描式多功能讀數(shù)儀（美國Thermo公司）；RT-02B粉碎機(jī)（香港泓荃製藥機(jī)械公司）；50目分樣篩（浙江上虞市華豐五金儀器有限公司）；101-3AB電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）。

1.2 藥材

金釵石斛采自四川省合江縣福森種養(yǎng)專業(yè)合作社。采收了一年生、二年生和三年生金釵石斛莖（北緯28°44′ 11″ ，東經(jīng)106°06′ 38″ ，海拔725 m）用于不同采收年限藥材的比較，該藥材在當(dāng)?shù)厮追Q“魚肚蘭”，采于2016年10月15日；于2016年10月至2017年3月中的每個(gè)月的15日采收了生長年齡為2年的藥材（北緯28°44′ 39″ ，東經(jīng)106°09′ 22″ ，海拔430 m）用于不同采收月份藥材的比較，該藥材當(dāng)?shù)厮追Q“大竹葉蘭”。采樣方式：每隔1 m左右隨機(jī)選取莖分蘗數(shù)大于15的單株，從同一株取莖1枝，總計(jì)取樣30枝。2種藥材均采用仿野生的栽培方式即種植于石頭上。上述藥材由中國科學(xué)院成都生物研究所淳澤研究員鑒定為蘭科石斛屬植物金釵石斛。采收的新鮮樣品切成小段置于105 ℃恒溫鼓風(fēng)干燥箱中干燥30 min，之后60 ℃烘干至恒質(zhì)量，用粉碎機(jī)粉碎并過50目分樣篩，用自封袋封存，置于陰涼干燥處。

1.3 對(duì)照品與試劑

石斛堿對(duì)照品（成都遠(yuǎn)諾天成科技有限公司，批號(hào)：YNZB0806，純度：≥98%）；D-無水葡萄糖對(duì)照品（以下簡稱葡萄糖，大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：MB6951，純度：≥98%）；萘對(duì)照品（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào)：N110796，純度：≥99.7%）。所用試劑甲酸、甲醇、苯酚、濃硫酸、乙醇、氯仿、溴甲酚綠、氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀等均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 折干率測定

參考文獻(xiàn)[3]方法測定折干率。采收金釵石斛莖后，去掉葉片并洗凈，待表面水分蒸發(fā)后，測定其鮮質(zhì)量。莖切成小段于105 ℃恒溫鼓風(fēng)干燥箱中干燥30 min，之后60 ℃烘干至恒質(zhì)量，稱量干質(zhì)量并計(jì)算折干率，折干率=（莖干質(zhì)量/莖鮮質(zhì)量）×100%。

2.2 多糖含量測定

參考文獻(xiàn)[4-5]方法測定多糖含量。

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取105 ℃干燥至恒質(zhì)量的葡萄糖對(duì)照品0.025 g溶解于250 mL量瓶中，即得0.1 mg/mL葡萄糖對(duì)照品溶液。精密量取葡萄糖對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于10 mL具塞試管中，再分別加水補(bǔ)至2 mL，各試管中分別加入5%的苯酚溶液1 mL（臨用配制），充分震蕩搖勻，迅速精密加入濃硫酸5 mL，搖勻。置于沸水浴中加熱20 min，取出，置于冷水中自然冷卻5 min，取出后用全波長掃描式多功能讀數(shù)儀于490 nm波長處測定其吸光度。以測試品中葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、相應(yīng)的吸光度值為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y=9.306 8x+0.040 2（R2=0.992 8），表明葡萄糖檢測質(zhì)量濃度線性范圍為0.01～0.05 mg/mL。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱定樣品粉末0.25 g，置于250 mL圓底燒瓶中，加入80%乙醇100 mL，加熱回流提取1 h，趁熱過濾，濾渣與濾器用40 ℃ 80%熱乙醇10 mL洗滌3次，濾渣連同濾紙置于燒瓶中，加水100 mL回流提取2 h，趁熱過濾，用少量熱水洗滌濾器，重復(fù)提取1次，合并濾液與洗液，放冷，轉(zhuǎn)移至500 mL量瓶中，加水至刻度，混勻備用。

2.2.3 精密度試驗(yàn) 取葡萄糖對(duì)照品溶液0.5 mL置于10 mL具塞試管中，按照“2.2.1”項(xiàng)中“再分別加入水補(bǔ)至2 mL” 起，制備測試品溶液。取該測試品溶液，用全波長掃描式多功能讀數(shù)儀于490 nm波長處測定其吸光度，連續(xù)進(jìn)樣測定5次。計(jì)算吸光度值的RSD為0.34%（n=5），表明精密度良好。

2.2.4 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 精密稱取同一批已知多糖含量（9.52%）的金釵石斛樣品約0.25 g，9份，分別精密加入低、中、高水平（80%、100%、120%）的葡萄糖對(duì)照品各3份，按照“2.2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，依法測定吸光度并計(jì)算平均回收率為98.67%（RSD=2.13%，n=9），表明準(zhǔn)確度良好。

2.2.5 樣品含量測定方法 精密量取供試品溶液2 mL，照“2.2.1”項(xiàng)下的方法，自“分別加入5%苯酚溶液1 mL”起，依法測定吸光度，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，多糖含量以無水葡萄糖（C6H12O6）計(jì)。

2.3 總生物堿含量測定

參考文獻(xiàn)[6]方法測定總生物堿含量。

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取石斛堿對(duì)照品1 mg，置于100 mL量瓶中，用氯仿定容至100 mL，作為對(duì)照品溶液。取對(duì)照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于分液漏斗中，用氯仿稀釋至10 mL，加入pH 4.5的醋酸鹽緩沖溶液5 mL和0.04%溴甲酚綠溶液1 mL，劇烈震搖5 min，靜置30 min。取濾液5 mL加0.01 mol/L氫氧化鈉乙醇溶液1 mL，搖勻，用全波長掃描式多功能讀數(shù)儀于620 nm波長處測得吸光度值。以測試品中石斛堿質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），對(duì)應(yīng)的吸光度值為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程為y=0.044 5x+0.070 5（R2=0.995 6）。表明石斛堿檢測質(zhì)量濃度線性范圍為1.0～5.0 μg/mL。

2.3.2 供試品溶液的制備 精密稱定樣品粉末0.25 g，置于100 mL圓底燒瓶中，用適量氨水浸潤，密封放置30 min。加入氯仿25 mL，稱質(zhì)量，加熱回流2 h，冷卻后稱質(zhì)量，用氯仿補(bǔ)足減少的質(zhì)量，過濾。準(zhǔn)確量取續(xù)濾液1mL置于100 mL量瓶中，用氯仿稀釋至刻度，混勻備用。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取“2.3.1”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液3.0 mL，置于分液漏斗中，用氯仿稀釋至10 mL，同“2.3.1”項(xiàng)下方法制備測試品溶液，于620 nm波長處測吸光度，連續(xù)進(jìn)樣測定5次。計(jì)算吸光度值的RSD為0.59%（n=5），表明精密度良好。

2.3.4 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 精密稱取同一批已知總生物堿含量（0.48%）的金釵石斛樣品約0.25 g，9份，分別精密加入低、中、高水平（80%、100%、120%）的石斛堿對(duì)照品各3份，按照“2.3.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，測定并計(jì)算平均回收率為97.83%（RSD=2.87%，n=9），表明準(zhǔn)確度良好。

2.3.5 樣品含量測定方法 精密量取供試品溶液10 mL置于分液漏斗中，參照“2.3.1”項(xiàng)下的方法，自“加入pH 4.5的醋酸鹽緩沖溶液5 mL”起，依法測定吸光度，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算即得。

2.4 石斛堿含量測定

參考文獻(xiàn)[5]方法測定石斛堿含量。

2.4.1 色譜條件 色譜柱：DB-1毛細(xì)管柱；程序升溫：初始溫度為80 ℃，保持1 min，之后以10 ℃/min的速率升溫至250 ℃，保持5 min；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；火焰離子化檢測器（FID）溫度：250 ℃；載氣：N2；分流比：5 ∶ 1；氫氣流速：30 mL/min ；空氣流速：300 mL/min ；尾吹氣流速：30 mL/min。理論板數(shù)按石斛堿峰計(jì)不低于10 000。取供試品（10月中旬“大竹葉蘭”樣品）和對(duì)照品溶液按照上述色譜條件進(jìn)樣分析，色譜圖見圖1。

2.4.2 校正因子測定 取萘對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含25 μg的溶液，作為內(nèi)標(biāo)溶液。取石斛堿對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含50 μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。精密量取對(duì)照品溶液2 mL，置于5 mL量瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液1 mL，加甲醇至刻度，搖勻，吸取1 μL，注人氣相色譜儀，計(jì)算校正因子，F(xiàn)=2.47。

2.4.3 方法學(xué)考察 （1）精密度試驗(yàn)。取同一份對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄色譜峰面積比值（石斛堿峰面積/萘峰面積），計(jì)算RSD=1.78%（n=5），表明儀器精密度良好。（2）重復(fù)性試驗(yàn)。取同一批樣品，按照“2.4.3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液5份，依法測定石斛堿的含量，計(jì)算其RSD=2.1%（n=5），表明重復(fù)性良好。（3）穩(wěn)定性試驗(yàn)。取同一份樣品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)行分析，測得石斛堿與萘的峰面積比值，計(jì)算其RSD=2.9%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。（4）準(zhǔn)確度試驗(yàn)。精密稱取同一批已知石斛堿含量（0.38%）的金釵石斛樣品9份，分別精密加入低、中、高水平（80%、100%、120%）的石斛堿對(duì)照品各3份，按照“2.4.3”項(xiàng)下的方法測定并計(jì)算平均回收率為97.95%（RSD=2.81%，n=9）。

2.4.4 樣品含量測定方法 取樣品粉末0.25 g，精密稱定，置于100 mL圓底燒瓶中，精密加入含0.05% 甲酸的甲醇溶液25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流3 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用含0.05 %甲酸的甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液2 mL，置于5 mL量瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液1 mL，加甲醇至刻度，搖勻，吸取1 μL，注入氣相色譜儀，測定，即得。

2.5 不同樣品各指標(biāo)測定結(jié)果

2.5.1 不同采收年限 不同采收年限樣品的折干率、多糖含量、石斛堿含量、總生物堿含量、有效成分總量率（以石斛堿含量×折干率代表）等指標(biāo)測定結(jié)果見表1。

由表1可知，不同生長年限的金釵石斛其品質(zhì)評(píng)價(jià)指標(biāo)變化具有一定的規(guī)律性：折干率與多糖含量均呈現(xiàn)為二年生樣品>一年生與三年生樣品；石斛堿含量與總生物堿含量均呈現(xiàn)為一年生樣品>二年生樣品>三年生樣品。石斛堿是總生物堿中的成分之一，在各樣品中總生物堿含量略微高于石斛堿含量，表明在各樣品中石斛堿在總生物堿中占有極高的比例。用折干率的大小表征產(chǎn)量，以石斛堿含量與折干率之積代表有效成分總量率。雖然一年生石斛堿含量最高，但折干率偏低，所以，最終有效成分總量率為二年生樣品>一年生樣品>三年生樣品。多糖含量與折干率變化趨勢一致，也以二年生最高。綜合考慮石斛堿與多糖含量，建議采收生長期為兩年的金釵石斛。

2.5.2 不同采收月份 二年生金釵石斛不同采收月份樣品的折干率、多糖含量與石斛堿含量變化情況見圖2。

由圖2可見，從2016年10月-2017年3月，折干率持續(xù)上升，其中2016年10月-2017年1月變化趨勢比較一致，每個(gè)月遞增1.5%左右。2017年2、3月份折干率急劇升高，最終折干率達(dá)到19%以上，這可能與開花有關(guān)，2月中旬合江金釵石斛莖上可見綠豆大小的花芽，3月中旬花芽已有黃豆般大。在多糖含量方面，從2016年10月-2017年2月含量呈上升趨勢，2月中旬多糖含量達(dá)到頂峰，為17.32%，3月多糖含量開始降低。就石斛堿含量而言，從2016年10月-2017年3月，石斛堿含量先上升后下降，12月中旬石斛堿含量最高，達(dá)0.51%。其中2016年12月、2017年1、2月石斛堿含量超過0.40%，符合2015年版《中國藥典》（一部）相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[5]。由于2月份金釵石斛已見花芽，內(nèi)部成分含量發(fā)生了極大的變化，故2016年12月與2017年1月樣品的折干率、多糖含量與石斛堿含量均較高，故本研究認(rèn)為第2年的12月與第3年的1月為合江金釵石斛的最適采收月份。

3 討論

蔡偉[7]、梁歡等[8]研究得出采收年限1～4 年中金釵石斛中石斛堿的含量大小為一年生>二年生>四年生>三年生樣品，與本文石斛堿含量一年生>二年生>三年生樣品的研究結(jié)果基本一致。徐云燕等得出一年生金釵石斛總生物堿含量最高，總生物堿含量也為一年生>二年生>三年生樣品[9]。劉寧[10]研究得出二年生金釵石斛多糖含量與折干率均明顯高于一年生與三年生樣品，與本文研究結(jié)果一致。在鐵皮石斛方面，也曾得出類似的結(jié)論：包英華研究得出二年生鐵皮石斛的折干率、多糖含量、石斛堿含量均高于三年生樣品，建議采收二年生的藥材[11]；諸燕關(guān)于浙江產(chǎn)區(qū)鐵皮石斛的研究得出二年生多糖含量高于一年生與三年生樣品，建議應(yīng)在二年生冬季至三年生開花前采收[12]；俞巧仙等[13]也得出鐵皮石斛二年生多糖含量最高；還有研究認(rèn)為美花石斛也是二年生多糖含量高于三年生[14]。

張善寶等[15]研究結(jié)果表明，云南鐵皮石斛折干率從第1年的10月至次年3月持續(xù)升高，從4月開始逐漸降低，與本文折干率變化趨勢一致。蔡偉等[7]得出1月份石斛堿含量最高，而本研究結(jié)果認(rèn)為12月份石斛堿含量最高，分析原因可能與蔡偉等研究并未對(duì)12月份的藥材進(jìn)行檢測所致，但也可能與金釵石斛產(chǎn)地不同有關(guān)。

瀕危藥用植物的采收應(yīng)堅(jiān)持“最大持續(xù)產(chǎn)量”原則。有效成分含量與產(chǎn)量高峰不一致時(shí)，應(yīng)以有效成分總量率為指標(biāo)確定，總量率最大值時(shí)即為適宜采收期。從金釵石斛生物學(xué)特性來看，一年生石斛莖于3月左右開始進(jìn)行新芽萌發(fā)及新芽的養(yǎng)分供給，每年生長1～3個(gè)新芽，且一年生莖越健壯，養(yǎng)分含量越多，新芽長勢越好[16]。若將一年生石斛莖采收，便不會(huì)萌發(fā)新芽，不利于可持續(xù)采收。一年生石斛莖有效成分總量率低于二年生，同時(shí)折干率相對(duì)于二、三年生也較低，不利于常溫下長時(shí)間儲(chǔ)存運(yùn)輸。大量已有研究[7，9]認(rèn)為因一年生石斛堿含量高而將其確定為最適采收年限是不合理的。本研究綜合折干率、多糖含量、總生物堿含量與石斛堿含量，并考慮到植物的開花特性，得出合江金釵石斛二年生12月和1月（第三年開花前）為最適采收期。

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（收稿日期：2017-05-23 修回日期：2017-06-28）

（編輯：劉 萍）