基于COⅠ基因的羚羊角及其混偽品的DNA條形碼鑒定方法的研究

王桂梅　王世偉　席嘯虎　張小慧

中圖分類(lèi)號(hào) R282.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）01-0077-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.01.20

摘 要 目的：考察利用細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ（COⅠ）基因?qū)α缪蚪羌捌浠靷纹愤M(jìn)行分子鑒定的可行性。方法：收集4個(gè)地區(qū)的羊角類(lèi)整角、不完整角樣品，共7個(gè)。比較樣品骨塞部位和角質(zhì)層部位DNA的提取效果，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)，以通用引物L(fēng)COⅠ490、HCO2198擴(kuò)增樣品的COⅠ基因，通過(guò)凝膠電泳、純化（取750 bp條帶）、測(cè)序后，以COⅠ基因作為條形碼比對(duì)序列，采用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的Blast軟件在線比對(duì)，確定收集樣品的具體物種。結(jié)果：樣品以角質(zhì)層部位進(jìn)行DNA提取的效果較好（DNA濃度為15.7～22.6 ng/?L，260 nm/280 nm吸光度值為1.73～4.72）；在線比對(duì)結(jié)果顯示，所有樣品COⅠ基因的相似性均達(dá)到99%，其主要來(lái)源于賽加羚羊、藏羚羊、普氏原羚、山羊、綿羊等羊類(lèi)的角。結(jié)論：基于COⅠ基因的DNA條形碼技術(shù)可用于羚羊角及其混偽品的鑒定，該技術(shù)為羊角類(lèi)藥材的鑒定提供了一種準(zhǔn)確、客觀的方法。

關(guān)鍵詞 細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ基因；羚羊角；混偽品；序列比對(duì)；鑒定

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the feasibility of molecule identication of Saiga tatarica and its adulterants by using cytochrome C oxidase subunit Ⅰ （COⅠ） gene. METHODS：A total of 7 horns and incomplete horns were collected from 4 areas.The extraction effect of DNA from bone plug and stratum corneum were investigated； PCR technology was used to amplify COⅠ gene of samples using universal primer LCOⅠ490， HCO2198； after gel electrophoresis， purification （750 bp strip） and sequencing， using COⅠ gene as barcode alignment sequence， online comparison was conducted by using Blast software of NCBI database to determine specific species. RESULTS：The extraction of DNA from stratum corneum was better （DNA concentration was 15.7-22.6 ng/?L， the absorbance of 260 nm/280 nm was 1.73-4.72）. Online comparison showed that the similarity of COⅠ gene in all samples reached 99%， mainly from the horns of saiga antelope， Tibetan antelope， gazelle， sheep and goats. CONCLUSIONS： DNA barcode technology based on COⅠ gene can be used for the identification of S. tatarica and its adulterants. The technology can provide an accurate and objective method for the identification of horn medicinal materials.

KEYWORDS Cytochrome C oxidase subunit Ⅰ； Saiga tatarica； Adulterants； Sequence alignment； Identification

?？苿?dòng)物賽加羚羊的角是羚羊角藥材的法定來(lái)源，但是市場(chǎng)上存在多種羊角類(lèi)混偽品，如山羊角、綿羊角、黃羊角等。傳統(tǒng)鑒定主要依賴(lài)樣品的完整性及經(jīng)驗(yàn)豐富的鑒定專(zhuān)家，一般藥材驗(yàn)收人員難以鑒定?，F(xiàn)代分子學(xué)技術(shù)可通過(guò)分析樣品的遺傳物質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)物種的鑒定，不受樣品存在狀態(tài)的影響。動(dòng)物線粒體中的細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ（COⅠ）基因被認(rèn)為是全球動(dòng)物物種鑒定的通用條形碼[1]，其片段序列可作為一種新的物種身份識(shí)別系統(tǒng)，常采用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（PCR）獲得COⅠ基因序列，然后通過(guò)DNA提取、擴(kuò)增、測(cè)序、比對(duì)等步驟來(lái)分析正品及其混偽品。該技術(shù)已被證實(shí)可用于多種動(dòng)物藥材的不同組織樣本的鑒定[2-5]，并取得了較好的研究結(jié)果。然而，該技術(shù)對(duì)堅(jiān)硬樣品（如羚羊角）鑒定的可行性尚缺乏深入研究。鑒于此，筆者收集了多種羊角類(lèi)不同存在狀態(tài)（整角、絲、不完整角）的樣品，以COⅠ基因?yàn)槟康幕?，通過(guò)比較對(duì)骨塞部位與角質(zhì)層部位DNA的提取效果后，采用PCR技術(shù)，以通用引物L(fēng)COⅠ490、HCO2198擴(kuò)增樣品的COⅠ基因，通過(guò)測(cè)序序列比對(duì)確定收集樣品的具體物種來(lái)源，從而為羊角類(lèi)藥材的鑒定提供一種準(zhǔn)確、客觀的方法。

1 材料

1.1 儀器

BSA124S型電子天平（上海賽多利斯貿(mào)易有限公司）；LX-200型迷你離心機(jī)（海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司）；T960型PCR熱循環(huán)儀（杭州晶格科學(xué)儀器有限公司）；DYY-6B 型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京市六一儀器廠）；ZF-258型全自動(dòng)凝膠成像儀（上海嘉鵬科技有限公司）；Nano Drop 2000型DNA濃度測(cè)試儀（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）。

1.2 藥材與試劑

共收集4個(gè)不同地區(qū)的羊角類(lèi)整角、不完整角樣品7個(gè)；離心柱型血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒（批號(hào)：Q5330）、普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒（批號(hào)：DP204）均購(gòu)自天根生化科技有限公司；DL 2000 DNA Marker（100～2 000 bp）（大連寶生物工程有限公司，批號(hào)：A1801A）；6倍濃度的核酸樣品用上樣緩沖液[大連寶生物工程（大連）有限公司，批號(hào)：A301A]；2×Easy Taq SuperMix PCR反應(yīng)預(yù)混液（北京全式金生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：J11122）；Gold View I型核酸染色劑、二硫蘇糖醇（DTT）、葡聚糖凝膠、三羥甲基氨基甲烷（TRIS）、二水合乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2·2H2O）等均購(gòu)自北京索來(lái)寶生物科技有限公司（批號(hào)分別為20160217、20160603、20150902、121750709、308D061）。樣品信息詳見(jiàn)表1，實(shí)物圖詳見(jiàn)圖1。

2 方法與結(jié)果

2.1 骨塞部位DNA的提取

2.1.1 脫鈣液的制備 稱(chēng)取186.1 g的EDTA-Na2·2H2O，加入800 mL蒸餾水中，磁力攪拌器攪拌，滴管滴加NaOH溶液（1mol/L），用pH計(jì)調(diào)節(jié)pH至8.0，然后用蒸餾水定容至1 L，配成0.5 mol/L的EDTA（pH 8.0）脫鈣液，高壓滅菌后備用[6]。

2.1.2 脫鈣時(shí)間及脫鈣次數(shù)的考察 取樣品3，用電鋸切割橫截面，將骨塞部位取出，用干凈刀片削取骨塞成粉末。然后稱(chēng)取樣品粉末5份（編號(hào)1～5），每份25 mg，加入5倍取樣量的EDTA（pH 8.0）脫鈣液，分別在4 ℃下脫鈣12、24、48、72、84 h（每24 h更換1次脫鈣液），5 000×g離心3 min，棄脫鈣液，其余按試劑盒提取步驟提取樣品總DNA，并測(cè)定DNA的濃度及純度，以260 nm/280 nm波長(zhǎng)樣品吸光度（A）的比值（A260/A280）考察提取DNA的質(zhì)量，純DNA的A260/A280≈1.8。A260/A280<1.8，提示有蛋白質(zhì)或苯酚污染；A260/A280>1.8，說(shuō)明樣品中含有RNA[7]。樣品3骨塞部位不同脫鈣時(shí)間的DNA提取效果見(jiàn)表2。

結(jié)果，脫鈣12～48 h，樣品未完全裂解，但隨著脫鈣時(shí)間延長(zhǎng)，DNA濃度升高；脫鈣48～84 h，樣品裂解透徹，但提取的DNA濃度降低。提示選擇骨塞部位提取DNA，易受提取時(shí)間和提取次數(shù)的影響，提取時(shí)間過(guò)短，樣品裂解不完全；提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)和提取次數(shù)過(guò)多，DNA被破壞，提取的DNA濃度低，無(wú)法進(jìn)行下一步的PCR操作。所以，角類(lèi)藥材的DNA提取研究，應(yīng)避免取骨塞部位。為有效提取角類(lèi)藥材的DNA，筆者取角質(zhì)層部位，進(jìn)一步研究其DNA的提取方法。

2.2 角質(zhì)層部位DNA的提取方法研究

2.2.1 取樣 整角樣品用電鋸切割橫截面成片狀，取片狀橫截面，用小刀刮去外層污染后，削成細(xì)薄片，備用；絲狀樣品用75%乙醇清洗3次，雙蒸水沖洗至無(wú)醇味，紫外光下照射，晾干，消毒剪剪成碎片，備用。

2.2.2 DTT對(duì)角質(zhì)層部位DNA提取效果的影響 稱(chēng)取羚羊角細(xì)薄片（樣品3）30 mg，加入蛋白酶K 20 ?L及裂解緩沖液200 ?L后，56 ℃金屬浴過(guò)夜裂解，此時(shí)樣品幾無(wú)變化。稱(chēng)取羚羊角細(xì)薄片（樣品3）30 mg，加入DTT 100 ?L、蛋白酶K 20 ?L及裂解緩沖液200 ?L，56 ℃金屬浴裂解30 min后，樣品裂解明顯?？梢?jiàn)，加入DTT可促進(jìn)樣品裂解。

2.2.3 樣品3角質(zhì)層部位DNA提取效果 在預(yù)試基礎(chǔ)上，稱(chēng)取羚羊角細(xì)薄片（樣品3）25 mg，加入DTT 20 ?L、蛋白酶K 20 ?L及裂解緩沖液200 ?L，56 ℃金屬浴裂解3 h，裂解透徹后，按試劑盒提取步驟提取角質(zhì)層樣品總DNA。結(jié)果，DNA濃度為16.2 ng/?L，遠(yuǎn)高于骨塞部位的DNA濃度，且提取時(shí)間短，故后文選取骨質(zhì)層部位進(jìn)行DNA提取。

2.2.4 所有樣品角質(zhì)層部位DNA提取效果 分別取7種樣品各25 mg，按“2.2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行DNA提取。結(jié)果，所有樣品DNA濃度均高于15.0 ng/?L，樣品1和樣品5的A260/A280接近1.8，證明蛋白質(zhì)去除干凈，其余樣品的A260/A280>1.8，說(shuō)明樣品中可能含有降解的RNA，所有樣品的提取結(jié)果見(jiàn)表3。

2.3 PCR擴(kuò)增、純化和測(cè)序

PCR擴(kuò)增程序參考文獻(xiàn)[8]。反應(yīng)體系總體積為25 ?L，包括DNA模板10 ?L，正、反向引物各1 ?L（濃度均為10 mmol/L），2×Easy Taq SuperMix預(yù)混液12.5 ?L，最后用雙蒸水補(bǔ)足體系體積至25 ?L。用含有Gold View I 型核酸染色劑的1.5%瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣，在TBE緩沖液（由TRIS、硼酸、EDTA混合配制而成）中電泳；凝膠成像儀成像，割取750 bp的條帶，按純化試劑盒說(shuō)明書(shū)操作純化后送上海桑尼公司測(cè)序。7種樣品PCR擴(kuò)增的電泳圖見(jiàn)圖2。

2.4 序列比對(duì)與鑒定

所有樣品均成功測(cè)序后，采用DNAStar軟件中的MegAlign進(jìn)行多序列比對(duì)，分析所收集的7個(gè)樣品的COⅠ基因序列的相似與差異。其中，羚羊角、未知角絲、未知角塊的序列相同，并與其余角類(lèi)序列有差異。進(jìn)一步用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的Blast軟件在線比對(duì)各序列在數(shù)據(jù)庫(kù)所對(duì)應(yīng)的物種來(lái)源。結(jié)果，各樣品序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列相似性均達(dá)到99%，確定了未知不完整樣品的具體物種，鑒定了黃羊角的原動(dòng)物為普氏原羚角，同時(shí)證明收集的其余樣品的物種名稱(chēng)均是正確的。7種樣品多序列比對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖3，鑒定結(jié)果見(jiàn)表4。

3 討論

線粒體基因中的細(xì)胞色素氧化酶基因有3個(gè)亞基：COⅠ、COⅡ、COⅢ基因，其中COⅠ基因相對(duì)保守，其序列能夠區(qū)分物種差異，已用在魚(yú)類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)、兩棲類(lèi)等物種的鑒定與識(shí)別上，是動(dòng)物物種鑒定的通用條形碼。近年用COⅠ基因鑒定的動(dòng)物藥材品種有廣地龍[3]、蛤蚧[9]、藥用軟體動(dòng)物[10]、金錢(qián)白花蛇[4]等，并取得較好的鑒定結(jié)果。本文分析用該基因鑒別羊角類(lèi)藥材的可行性，首先分別對(duì)骨塞部位和角質(zhì)部位研究其DNA提取效果，因骨塞部位的DNA提取受脫鈣次數(shù)和脫鈣時(shí)間影響，耗時(shí)長(zhǎng)，且所得DNA濃度較低，因此，角類(lèi)藥材的DNA提取應(yīng)避免取骨塞部位。當(dāng)選擇采用角質(zhì)層部位提取DNA時(shí)，在提取時(shí)間段內(nèi)，可獲得更高的DNA濃度，雖然羚羊角整角和黃羊角整角的A260/A280值分別為1.73和1.79，但是接近1.80，即使有少量蛋白質(zhì)或苯酚污染對(duì)常規(guī)PCR測(cè)定也影響不大。雖然純的DNA樣品要求 A260/A280≈1.8，但在本研究實(shí)例中比值大于1.8的DNA提取樣品PCR均能成功擴(kuò)增，且不影響測(cè)序。本研究在通過(guò)PCR擴(kuò)增，凝膠電泳、純化，測(cè)序，得出樣品的COⅠ基因序列，通過(guò)序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)各樣品序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中序列的相似性達(dá)到99%。根據(jù)文獻(xiàn)[11-12]對(duì)11門(mén)13 320個(gè)物種的COⅠ基因序列進(jìn)行比較分析，表明所研究物種的種間平均遺傳距離為11.3%，其中79%的物種間遺傳距離均大于8%。本研究在線比對(duì)結(jié)果相似性為99%，差異性小于1%，可確定與數(shù)據(jù)庫(kù)中為同一物種。本研究鑒定了羊角類(lèi)完整樣品與不完整樣品的物種來(lái)源?？梢?jiàn)，基于COⅠ基因的DNA條形碼技術(shù)可用于羚羊角及其混偽品的鑒定，該技術(shù)為羊角類(lèi)藥材的鑒定提供了一種準(zhǔn)確、客觀的方法。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] RAMADAN HAI，BAESHEN NA. Biological identifications through DNA barcodes[J]. Proc Biol Sci，2003，270（1512）：313-321.

[ 2 ] 胡嶸，杜鶴，崔麗娜，等.海馬、海龍基于COⅠ條形碼的DNA分子鑒定[J].吉林中醫(yī)藥，2012，32（3）：272-276.

[ 3 ] 韋健紅，李薇，吳文如，等.基于COⅠ與16S rRNA基因?qū)V地龍的DNA分子鑒定研究[J].中國(guó)藥房，2012，23（35）：3274-3278.

[ 4 ] 崔麗娜，杜鶴，張輝，等.基于COⅠ條形碼序列的金錢(qián)白花蛇及其混偽品的DNA分子鑒定[J].世界科學(xué)技術(shù)：中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2011，13（2）：424-427.

[ 5 ] 杜鶴，孫佳明，崔麗娜，等.基于COⅠ條形碼的麝香及其混偽品的DNA分子鑒定[J].吉林中醫(yī)藥，2011，31（5）：451-452.

[ 6 ] 李花，凃政，石屹，等.骨骼脫鈣后DNA含量損失問(wèn)題初探[J].中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志，2014，29（2）：141-144.

[ 7 ] 陳士林.中藥DNA條形碼分子鑒定[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2012：13.

[ 8 ] FOLMER O，BLACK M，HOEC W，et al. DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit Ⅰ from diverse metazoan invertebrates[J]. Mol Mar Biol Biotechnoly，1994，3（5）：294-299.

[ 9 ] 顧海豐，夏云，徐永莉，等.中藥材蛤蚧的特異性PCR鑒定[J].四川動(dòng)物，2012，31（2）：226-231.

[10] 高曉晨，孫佳明，杜鶴，等.中國(guó)藥用軟體動(dòng)物養(yǎng)殖與DNA條碼鑒定[J].吉林中醫(yī)藥，2012，32（8）：820-823.

[11] HEBER PDN， CYWINSKA A， BALL L， et al. Biological identifications through DNA barcodes[J]. Proc R Soc Lond B，2003.DOI：10.1098/rspb.2002.2218.

[12] HEBER PDN，RATNASINGHAM S，DEWAARD JR. Barcoding animal life：cytochrome coxidase subunit I divergences among closely related species[J]. Proc Biol Sci，2003.DOI：10.1098/rsbl.2003.0025.

（收稿日期：2017-05-19 修回日期：2017-10-13）

（編輯：林 靜）