甘草提取物對(duì)雷公藤甲素?fù)p傷后人肝L—02細(xì)胞中UGT1A、MRP2表達(dá)的影響

張靖　胡騫　譚親友　朱勝楠

中圖分類號(hào) R969.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）01-0065-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.01.17

摘 要 目的：考察甘草提取物（GE）對(duì)雷公藤甲素（TP）損傷后人肝L-02細(xì)胞中尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A（UGT1A）、多藥耐藥相關(guān)蛋白2（MRP2）表達(dá)的影響，研究甘草對(duì)TP的減毒機(jī)制。方法：采用MTT法測(cè)定0（空白對(duì)照）、40、80、160 nmol/L TP分別培養(yǎng)L-02細(xì)胞12、18、24 h后的細(xì)胞存活率。將L-02細(xì)胞分為空白對(duì)照組（空白培養(yǎng)基）、模型對(duì)照組（80 nmol/L TP）和GE預(yù)處理組（分別以30、60、90 mg/L GE預(yù)處理24 h后再加入80 nmol/L TP），繼續(xù)培養(yǎng)18 h后，采用MTT法檢測(cè)各組的細(xì)胞存活率。在上述分組（GE預(yù)處理組的GE濃度為60 mg/L）基礎(chǔ)上增設(shè)利福平（RIF）組（陽性對(duì)照，10 μmol/L RIF預(yù)處理24 h后再加入80 nmol/L TP），培養(yǎng)24 h后，檢測(cè)各組細(xì)胞中UGT1A、MRP2蛋白表達(dá)。結(jié)果：TP對(duì)細(xì)胞活性的抑制作用與濃度和時(shí)間呈正相關(guān)。與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組的細(xì)胞存活率明顯降低（P<0.05），細(xì)胞中MRP2蛋白表達(dá)明顯減弱（P<0.01）。與模型對(duì)照組比較，30、60、90 mg/L GE預(yù)處理組的細(xì)胞存活率均明顯升高（P<0.01）；60 mg/L GE預(yù)處理組細(xì)胞中UGT1A和MRP2蛋白表達(dá)均明顯增強(qiáng)（P<0.01）。結(jié)論：GE預(yù)處理可減輕TP對(duì)人肝L-02細(xì)胞的損傷，其減毒機(jī)制可能與提高細(xì)胞中UGT1A、MRP2的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 甘草提取物；雷公藤甲素；尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A；多藥耐藥相關(guān)蛋白2；人肝L-02細(xì)胞

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the effects of Glycyrrhiza uralensis extract （GE） on the expression of uridine diphosphate glucuronyltransferase 1A （UGT1A） and multidrug resistance associated protein 2 （MRP2） in human liver L-02 cells damaged by triptolide （TP）， and to study attenuated mechanism of G. uralensison for TP. METHODS： The survival rates of L-02 cells were determined by MTT assay after cultured with 0 （blank control）， 40， 80， 160 nmol/L TP for 12， 18， 24 h. L-02 cells were divided into blank control group （blank culture medium）， model control group （80 nmol/L TP） and GE pretreatment group （adding 80 nmol/L TP after pretreated with 30， 60， 90 mg/L GE for 24 h）； after cultured for 18 h， survival rates of L-02 cells were determined by MTT assay. Rifampin （RIF） group （positive control， adding 80 nmol/L TP after pretreated with 10 μmol/L RIF for 24 h） was added on the basis of the above grouping （GE concentration of 60 mg/L in GE pretreatment group）.After cultured for 24 h， the protein expressions of UGT1A and MRP2 were detected. RESULTS：The inhibition effect of TP on cell proliferation was positively correlated with the concentration and the time. Compared with blank control group， cell survival rate of model control group was decreased significantly （P<0.05）， and the protein expression of MRP2 was decreased significantly （P<0.01）. Compared with model control group，cell survival rates of 30， 60， 90 mg/L GE pretreatment groups were all increased significantly （P<0.01）. The protein expressions of UGT1A and MRP2 were increased significantly in 60 mg/L GE pretreatment group （P<0.01）. CONCLUSIONS： GE pretreatment can relieve TP-induced human liver L-02 cell damage， and its attenuated mechanism may be associated with the increase the expression of UGT1A and MRP2.

KEYWORDS Glycyrrhiza uralensis extract； Triptolide； Uridine diphosphate glucuronyltransferase 1A； Multidrug resistance associated protein 2； Human liver L-02 cells

雷公藤甲素（Triptolide，TP）為環(huán)氧二萜內(nèi)酯類化合物，是從雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook. f.）中分離的活性較強(qiáng)的有效成分之一[1]。TP在臨床主要用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腎疾病及呼吸系統(tǒng)疾病等[2]，療效顯著。但同時(shí)TP也存在治療窗窄、水溶性差等缺點(diǎn)，對(duì)多種臟器都具有毒性，其中較為常見的是TP所致肝損傷[3]，這些毒副反應(yīng)嚴(yán)重限制了其在臨床的推廣和應(yīng)用。因此， 全面了解TP對(duì)肝的毒性作用機(jī)制，對(duì)研究開發(fā)TP的減毒增效方法，提高TP在臨床應(yīng)用的安全性具有重要的實(shí)際意義。甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其性味甘、平，歸心、肺、脾、胃經(jīng)，有祛痰止咳、清熱解毒、調(diào)和諸藥等功效[4]。研究表明，甘草聯(lián)用其他藥物后，可能會(huì)改變藥物的代謝，從而影響藥物藥效，中和毒性[5]。

多藥耐藥相關(guān)蛋白2（MRP2/ABCC2）屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族，主要分布于肝、腎及十二指腸，在體內(nèi)主要介導(dǎo)結(jié)合物轉(zhuǎn)運(yùn)入膽汁或尿，將體內(nèi)有毒物質(zhì)及相關(guān)代謝產(chǎn)物迅速排出體外，從而起到解毒的作用[6]。在生物體內(nèi)，尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A（Uridine diphosphate glucuronyltransferase 1A，UGT1A）是許多內(nèi)、外源性物質(zhì)進(jìn)行相生物轉(zhuǎn)化時(shí)最重要的一種代謝酶。Ⅱ相反應(yīng)中最重要的葡萄糖醛酸結(jié)合反應(yīng)主要是在有關(guān)酶的催化下，使體內(nèi)含有羥基或羧基的有毒物質(zhì)經(jīng)結(jié)合失活生成其非活性形式[7]，之后隨尿液排出體外，從而起到保肝解毒的作用。所以，本研究擬考察甘草提取物（GE）對(duì)TP損傷后人肝L-02細(xì)胞中UGT1A和MRP2表達(dá)的影響，為闡明GE對(duì)TP肝毒性的保護(hù)作用及可能的減毒機(jī)制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

model 680酶標(biāo)儀、Mini Protean Tetra小型垂直電泳儀、Gel Doc 2000凝膠成像儀（美國Bio-Rad 公司）；IX73倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；5424R臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司）

1.2 藥品與試劑

GE（西安瑞鴻生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20150901，甘草酸鈉鹽含量：11.8%）；利福平（Rifampicin，RIF）原料藥、TP（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào)：D1601041、G1227035，純度：≥97%、≥98%）；兔UGT1A、MRP2多克隆抗體（美國Abcam 公司）；鼠β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）單克隆抗體（中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗鼠免疫球蛋白G（IgG）、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗（美國Proteintech Group公司）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：123115160511）；RPMI- 1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；胎牛血清（山西潤生血清生物材料有限公司）； MTT、青鏈霉素混合液（100×）雙抗及0.25%胰蛋白酶（北京索萊寶科技有限公司）。

1.3 細(xì)胞

正常人肝L-02細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所，由桂林醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心傳代凍存。

2 方法

2.1 溶液的制備

GE、TP和RIF均用二甲基亞砜（DMSO）充分溶解（DMSO體積比均小于1%），然后用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋以上溶液為工作液，得GE終質(zhì)量濃度分別為30、60、90 mg/L（根據(jù)本課題組前期研究及文獻(xiàn)[8-9]設(shè)置，均以提取物量計(jì)）；RIF終濃度為10 μmol/L；TP終濃度分別為40、80和160 nmol/L。將制備好的各工作液用0.22 μm過濾器過濾除菌，保存于4 ℃冰箱中，備用。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將人肝L-02細(xì)胞置于含10%胎牛血清、1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基中（約4～5 mL），然后將培養(yǎng)瓶置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，每1～2天換液1次。每天觀察細(xì)胞生長情況，當(dāng)細(xì)胞長至80%～90%融合時(shí)，按1 ∶ 4的比例傳代或凍存，選取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 MTT試驗(yàn)檢測(cè)TP對(duì)L-02細(xì)胞的毒性及GE的保護(hù)作用

2.3.1 TP對(duì)L-02細(xì)胞的毒性作用 取細(xì)胞混懸液100 μL，接種于96孔培養(yǎng)板中（5 000個(gè)/孔），培養(yǎng)24 h細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞分為空白對(duì)照組（僅加入空白培養(yǎng)基）和40、80、160 nmol/L TP組，每組6個(gè)復(fù)孔，將各組細(xì)胞分別培養(yǎng)12、18、24 h后，采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照，然后在培養(yǎng)板孔中分別加入MTT（5 mg/mL）溶液20 μL，置于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h；4 h后終止培養(yǎng)，吸盡上清，加DMSO（150 μL/孔）；最后在酶標(biāo)儀上490 nm波長處測(cè)定各孔吸光度（A），并計(jì)算細(xì)胞存活率（%）：（A加藥組/A空白對(duì)照組）×100%，從而選擇出誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的最佳TP濃度及作用時(shí)間。

2.3.2 GE預(yù)處理對(duì)TP所致L-02細(xì)胞損傷的保護(hù)作用 按“2.3.1”項(xiàng)下方法設(shè)置空白對(duì)照組、模型對(duì)照組（這兩組僅加入空白培養(yǎng)基）和30、60、90 mg/L GE預(yù)處理組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。將細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸盡每孔液體，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3遍。接著，空白對(duì)照組細(xì)胞繼續(xù)加入空白培養(yǎng)基，模型對(duì)照組和給藥組分別加入80 nmol/L的TP，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)18 h。結(jié)束培養(yǎng)后按照“2.3.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行MTT檢測(cè)，并計(jì)算細(xì)胞存活率。

2.4 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中UGT1A和MRP2蛋白表達(dá)

取細(xì)胞懸液100 μL，接種于6孔板中（2×105個(gè)/孔），培養(yǎng)24 h貼壁后，將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組（這兩組僅加入空白培養(yǎng)基）、RIF組（加入10 μmol/L的RIF）和GE預(yù)處理組（加入GE 60 mg/L）。將細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，吸盡孔中液體，PBS沖洗3遍；除空白對(duì)照組細(xì)胞加入培養(yǎng)基外，其余各組細(xì)胞均加入80 nmol/L的TP，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)18 h。收集細(xì)胞于EP管中，加入蛋白裂解液裂解，渦旋振蕩，低溫離心，收集上清液（即細(xì)胞總蛋白）。采用BCA 蛋白定量試劑盒測(cè)得蛋白濃度并進(jìn)行電泳操作，濕法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，分別加入兔UGT1A（1 ∶ 2 000）、MRP2（1 ∶ 500）一抗，4 ℃孵育過夜；TBST洗膜3遍后，分別加入相應(yīng)二抗（1 ∶ 5 000），室溫孵育1 h；TBST洗膜3遍后，化學(xué)發(fā)光法發(fā)光顯影。采用Image J軟件測(cè)定條帶灰度值，以目標(biāo)蛋白條帶灰度值與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值表示目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較用SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 MTT試驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 TP對(duì)L-02細(xì)胞的毒性作用測(cè)定結(jié)果 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示，空白對(duì)照細(xì)胞貼壁生長，多呈梭形且透亮，易融合成片且邊界清晰。TP作用后，細(xì)胞密度減小、細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變、脫壁細(xì)胞數(shù)增多。160 nmol/L的TP作用12 h后的細(xì)胞密度較80 nmol/L的TP作用18 h略大，但損傷程度無明顯變化；而80 nmol/L的TP作用24 h及160 nmol/L的TP作用18、24 h后細(xì)胞密度明顯減小，細(xì)胞損傷過度。結(jié)合細(xì)胞存活率測(cè)定結(jié)果，除40 nmol/L的TP作用12 h后細(xì)胞存活率降低不顯著外，其余各組細(xì)胞存活率較空白對(duì)照組均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。但在選擇最佳誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的TP濃度時(shí)，細(xì)胞存活率應(yīng)不低于60%，若細(xì)胞存活率過低，提示TP對(duì)細(xì)胞造成過度損傷，過度損傷的細(xì)胞再用保肝藥物進(jìn)行干預(yù)，效果不明顯。故本研究最終選擇80 nmol/L的TP作用18 h進(jìn)行細(xì)胞損傷。細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果見圖1，細(xì)胞存活率測(cè)定結(jié)果見表1。

3.1.2 GE對(duì)TP所致L-02細(xì)胞損傷的保護(hù)作用測(cè)定結(jié)果 與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組細(xì)胞存活率顯著降低（P<0.01）；與模型對(duì)照組比較，不同質(zhì)量濃度GE預(yù)處理組細(xì)胞存活率均顯著升高（P<0.01），且具有一定的濃度依賴性，結(jié)果見表2。

3.2 Western blot試驗(yàn)結(jié)果

與空白對(duì)照組比較，其余各組細(xì)胞中MRP2蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.01），GE預(yù)處理組和RIF組細(xì)胞中UGT1A蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.01）；與模型對(duì)照組比較，GE預(yù)處理組和RIF組細(xì)胞中UGT1A、MRP2蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01）。電泳圖見圖2，測(cè)定結(jié)果見表3。

4 討論

中藥單體TP在臨床上應(yīng)用廣泛，但長期用藥毒性易蓄積，對(duì)消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)及血液系統(tǒng)等都有毒性作用[10]，其中以TP所致急性肝損傷較為突出。以往研究表明，TP可誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞中谷胱甘肽和抗氧化酶活性，使得細(xì)胞中活性氧簇（ROS）相應(yīng)地增多，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞變性壞死、膜通透性增強(qiáng)，血清中轉(zhuǎn)氨酶含量升高[11-12]。中藥方劑中多配伍甘草以緩其性。研究表明[13]，甘草酸二銨可誘導(dǎo)細(xì)胞色素P4503A4（CYP3A4）上調(diào)和降低ROS水平，對(duì)減輕TP誘導(dǎo)的正常肝細(xì)胞毒性起到重要作用。也有研究表明，甘草乙醇提取物通過調(diào)控核因子相關(guān)因子2（Nrf2）/抗氧化反應(yīng)元件（ARE）信號(hào)通路，減輕TP誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激[9]。同時(shí)Ⅱ相解毒酶——葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（UGTs）、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（GSTs）與轉(zhuǎn)運(yùn)體G蛋白耦聯(lián)受體（MRPs）在去除毒代謝物和排泄等方面起著重要的作用，并且協(xié)同作用密切，其有可能同時(shí)受到Nrf2/ARE 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控，加強(qiáng)毒物的外排。因此，考察GE對(duì)TP誘導(dǎo)的肝細(xì)胞毒性及對(duì)相關(guān)蛋白的影響具有實(shí)際意義。RIF臨床主要用于各種結(jié)核病的治療，同時(shí)其是一個(gè)具有選擇性和多向性的藥物代謝酶誘導(dǎo)劑，具有誘導(dǎo)肝多種代謝酶的作用，能加速肝藥酶的合成并增強(qiáng)其活性[14]，故在本研究中以其為陽性對(duì)照藥。

本研究通過采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率來研究GE對(duì)TP所致L-02細(xì)胞損傷的影響。研究結(jié)果顯示，在培養(yǎng)時(shí)間為18 h的情況下，TP可顯著降低細(xì)胞存活率（P<0.01），并且TP的作用具有一定的時(shí)間和濃度依賴性，此結(jié)果與兩項(xiàng)研究[15-16]報(bào)道的結(jié)果一致。TP致肝細(xì)胞損傷18 h后，GE預(yù)處理24 h可顯著提高細(xì)胞存活率，這說明GE可降低TP引起的肝毒性。本研究采用Western blot法通過體外細(xì)胞試驗(yàn)，探討了GE對(duì)TP損傷后L-02細(xì)胞中UGT1A和MRP2的影響。結(jié)果顯示，雖TP組細(xì)胞中UGT1A蛋白表達(dá)水平較空白對(duì)照組略有增加，但差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。此結(jié)果與課題組前期研究結(jié)果略有差異，考慮差異的引起與細(xì)胞接種的密度可能有一定關(guān)系，但還需后期進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證和探索。GE預(yù)處理組細(xì)胞中UGT1A和MRP2表達(dá)水平升高，可加速有毒物質(zhì)從體內(nèi)代謝和消除，減少膽汁中有害成分的蓄積，從而降低TP引起的肝毒性。

綜上所述，GE預(yù)處理可減輕TP對(duì)人肝L-02細(xì)胞的損傷，其減毒機(jī)制可能與誘導(dǎo)細(xì)胞中UGT1A和MRP2蛋白的表達(dá)有關(guān)，但確切的作用機(jī)制有待進(jìn)一步證實(shí)。

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（收稿日期：2017-03-13 修回日期：2017-11-07）

（編輯：林 靜）