尖尾風(fēng)藥材的HPLC指紋圖譜建立及聚類分析和主成分分析

高微 陳明生 韋廣輝 羅遠(yuǎn)秀 黃艷 劉布鳴

摘 要 目的：建立尖尾風(fēng)藥材的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并進(jìn)行聚類分析和主成分分析。方法：采用HPLC法。色譜柱為ECOSIL ODS-EXTEND C18，流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長為334 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為20 μL。以毛蕊花糖苷為參照，繪制14批藥材樣品的HPLC圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012版）進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，確定共有峰，并采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行聚類分析和主成分分析。結(jié)果：14批藥材樣品的HPLC圖譜有13個(gè)共有峰，相似度為0.674～0.996，表明14批藥材樣品相似度差異較大，部分批次相似度大于0.9（9批）。14批藥材樣品可聚為4類，S3、S5、S6、S11聚為一類，S1、S2、S4、S9、S10聚為一類，S7、S8、S13、S14聚為一類，S12為一類。經(jīng)主成分分析，主成分1和主成分2是影響藥材樣品質(zhì)量評(píng)價(jià)的主要因子，2個(gè)主成分的累積方差貢獻(xiàn)率為90.32%，以S13的主成分綜合得分最高。結(jié)論：所建指紋圖譜以及聚類分析和主成分分析結(jié)果可為尖尾風(fēng)藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

關(guān)鍵詞 尖尾風(fēng)；高效液相色譜法；指紋圖譜；聚類分析；主成分分析

中圖分類號(hào) R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）16-2215-05

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish HLPC fingerprint of Callicarpae longsissimae， and to conduct cluster analysis and principal component analysis. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on ECOSIL ODS- EXTEND C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.2% phosphoric acid solution （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 334 nm， and the column temperature was 30 ℃. The sample size was 20 μL. Using acteoside as reference， HPLC fingerprints of 14 batches of C. longsissimae were determined. The similarity of 14 batches of samples was evaluated by TCM Chromatographic Fingerprint Similarity Evaluation System （2012 edition） to confirm common peak. Cluster analysis and principal component analysis were performed by using SPSS 22.0 software. RESULTS： There were 13 common peaks in HPLC chromatograms of 14 batches of sample， the similarity of which was 0.674-0.996， indicating the similarity of 14 batches of sample was great different， but the similarity of some batches was greater than 0.9 （9 batches）. After validation， HPLC fingerprints of 14 batches of sample were in good agreement with control fingerprint. Fourteen batches of samples were clustered into 4 categories； S3，S5，S6 and S11 were clustered into one category； S1，S2，S4，S9 and S10 were clustered into one category；S7，S8，S13 and S14 were clustered into one category；S12 was clustered into one category. By principal component analysis， principal component 1 and principal component 2 were main influential factors of medcicinal material quality；accumulative variance contribution rate of them was 90.32%，and comprehensive score of S13 was the highest. CONCLUSIONS： Established fingerprint， the results of cluster analysis and principal component analysis can provide reference for quality evaluation of C. longsissimae.

KEYWORDS Callicarpae longsissimae； HPLC； Fingerprint； Cluster analysis； Principal component analysis

尖尾風(fēng)為馬鞭草科紫珠屬植物尖尾楓[Callicarpa longissima （Hemsl.） Merr.]的干燥地上部分，生產(chǎn)地區(qū)為廣西，系廣西特色瑤藥“老班藥”中的七十二風(fēng)之一，又名起瘋曬、趕風(fēng)曬、大風(fēng)藥等[1]，收載于《廣西壯族自治區(qū)瑤藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（第一卷）》[2]。該藥具有祛風(fēng)散寒、活血消毒之功效[1]，嶺南地區(qū)常以其泡酒用于祛風(fēng)、理跌打、治毒蛇咬傷[3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，其水提取物和醇提取物具有較強(qiáng)的抗補(bǔ)體活性[4]。尖尾風(fēng)與裸花紫珠等紫珠屬植物的藥材性狀極其相似[5-6]，在市場流通及臨床應(yīng)用過程中常常被混用。有學(xué)者對(duì)尖尾風(fēng)顯微[7-8]、薄層色譜[7]鑒別等方面進(jìn)行了研究，其中薄層色譜鑒別以熊果酸為對(duì)照品。由于該藥材中同時(shí)含有熊果酸和齊墩果酸[9]，二者為同分異構(gòu)體，結(jié)構(gòu)相似、性質(zhì)相近，在薄層色譜中較難分離，且許多其他藥材中也含有熊果酸，因此目前所采用的鑒別方法特異性并不明顯。

指紋圖譜能全面表征藥材內(nèi)在的化學(xué)成分種類和數(shù)量，綜合反映和有效控制藥材整體質(zhì)量[10-11]，但目前尚未見有關(guān)尖尾風(fēng)指紋圖譜的研究報(bào)道。本課題組前期從尖尾風(fēng)中分離得到了毛蕊花糖苷等化合物[9、12-13]，并在此基礎(chǔ)上對(duì)其含量進(jìn)行了測(cè)定。本研究中，本課題組采用高效液相色譜法（HPLC）建立了尖尾風(fēng)藥材的指紋圖譜，并結(jié)合聚類分析和主成分分析對(duì)不同批次的尖尾風(fēng)藥材進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，旨在為有效控制其質(zhì)量提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1525型HPLC儀，包括1525二元梯度泵、2489紫外檢測(cè)儀、2707自動(dòng)進(jìn)樣器、Breeze 2色譜工作站（美國Waters公司）；KQ5200B型超聲波清洗器（昆山舒美超聲儀器有限公司）；XS205型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 試劑

毛蕊花糖苷對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111530-201512，純度：>98%）；乙腈、甲醇、磷酸為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

共收集藥材樣品14批，經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究院賴茂祥研究員鑒定為尖尾楓[C. longissima （Hemsl.） Merr.]的干燥地上部分。樣品收集后曬干，粉碎，過60目篩，密封，于陰涼干燥處保存。尖尾風(fēng)藥材樣品來源見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：ECOSIL ODS-EXTEND C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～20 min，11% A→12% A；20～25 min，12% A→14% A；25～65 min，14% A；65～70 min，14% A→15% A；70～85 min，15% A→17% A；85～110 min，17% A→22% A；110～115 min，22% A→11% A；115～120 min，11% A）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長：334 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液 精密稱取藥材樣品粉末0.1 g，置于100 mL錐形瓶中，精密加入50%甲醇溶液50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（功率：60 W，頻率：40 kHz）提取1 h，放冷至室溫，用50%甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 對(duì)照品溶液 精密稱取毛蕊花糖苷對(duì)照品26.7 mg，置于25 mL量瓶中，用甲醇定容，搖勻，得毛蕊花糖苷質(zhì)量濃度為1.068 mg/mL的對(duì)照品貯備液。精密吸取上述對(duì)照品貯備液1 mL，置于50 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，得毛蕊花糖苷質(zhì)量濃度為21.36 μg/mL的對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：S2）適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，以毛蕊花糖苷峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，13個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%（n=6），表明本方法精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：S2）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、12、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以毛蕊花糖苷峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，13個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取藥材樣品（編號(hào)：S2）粉末適量，共6份，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以毛蕊花糖苷峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，13個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于3%（n=6），相對(duì)峰面積的RSD均小于5%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.4 HPLC指紋圖譜的生成與相似度、共有峰相關(guān)分析

2.4.1 HPLC指紋圖譜的生成 取14批藥材樣品粉末各適量，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012版）對(duì)14批藥材樣品的HPLC圖譜進(jìn)行分析，得HPLC指紋圖譜，詳見圖1、圖2。

2.4.2 相似度分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012版），以藥材樣品的HPLC對(duì)照指紋圖譜為參照，進(jìn)行整體相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，14批藥材樣品相似度為0.674～0.996，表明14批藥材樣品相似度差異較大，部分批次相似度大于0.9（9批），詳見表2。

2.4.3 共有峰的指認(rèn)及相關(guān)分析 14批藥材樣品有13個(gè)共有峰，其峰面積合計(jì)占色譜峰總面積的90%以上，詳見表3。通過與對(duì)照品HPLC圖（詳見圖3）比對(duì)指認(rèn)10號(hào)峰為毛蕊花糖苷峰，由于其分離度良好，峰面積大且穩(wěn)定，故以其保留時(shí)間和峰面積為參照，計(jì)算其他峰相對(duì)于毛蕊花糖苷峰的相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積以及絕對(duì)峰面積的RSD，詳見表4～表6。

2.5 聚類分析

以各共有峰的相對(duì)峰面積為指標(biāo)，采用SPSS 22.0軟件，應(yīng)用組間連接法以相關(guān)系數(shù)作為樣品相似度的距離測(cè)度進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖4。由圖4可知，14批藥材樣品可聚為4類：S3、S5、S6、S11聚為一類，S1、S2、S4、S9、S10聚為一類，S7、S8、S13、S14聚為一類，S12為一類。

2.6 主成分分析

以各共有峰的相對(duì)峰面積為指標(biāo)，將14批藥材樣品13個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見表7。由表7可知，2個(gè)主成分因子（分別為色譜峰1和色譜峰2）的特征值分別為9.256、2.486，均>1，是影響尖尾風(fēng)藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)的主要因子；2個(gè)主成分因子的累積方差貢獻(xiàn)率為90.32%，故選擇提取該2個(gè)主成分因子對(duì)14批藥材樣品進(jìn)行評(píng)分。以方差貢獻(xiàn)率為分配系數(shù)，線性組合2個(gè)主成分因子，計(jì)算各批樣品的主成分因子得分及綜合得分，并對(duì)綜合得分進(jìn)行排序，結(jié)果見表8（綜合得分越高表明對(duì)尖尾風(fēng)藥材中有效成分的統(tǒng)計(jì)質(zhì)量越好）。由表8可知，綜合得分由高到低依次為S13、S8、S7、S12、S14、S3、S6、S11、S5、S10、S2、S1、S9、S4。

3 討論

紫珠屬植物葉及枝均具有止血、解毒等功效[14-15]。楊先國等[5]對(duì)包括尖尾風(fēng)在內(nèi)的不同種的紫珠屬植物藥材中的毛蕊花糖苷、木犀草素的含量進(jìn)行比較后，發(fā)現(xiàn)其含量差異較大，在臨床應(yīng)用過程中不應(yīng)混用。

本研究顯示，不同批次的尖尾風(fēng)藥材樣品的主要成分基本相同，有13個(gè)共有峰，其相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1%，表明13個(gè)共有峰的相對(duì)出峰時(shí)間穩(wěn)定，可作為定性鑒別的指標(biāo)。

尖尾風(fēng)藥材的化學(xué)成分較復(fù)雜，不同組分含量差異較大，13個(gè)指標(biāo)成分峰是從14批藥材樣品中選出的相對(duì)含量較大、特征性較強(qiáng)的共有峰，13個(gè)共有峰面積合計(jì)占色譜峰總面積的90%以上，具有代表性。14批藥材樣品的色譜整體圖貌基本一致，所建立的HPLC指紋圖譜可有效鑒別尖尾鳳藥材真?zhèn)危玫乜刂圃撍幉牡馁|(zhì)量。

14批藥材樣品的13個(gè)共有峰中，7號(hào)和10號(hào)（毛蕊花糖苷）絕對(duì)峰面積的RSD分別為92.1%、84.6%，在13個(gè)共有峰中較高，其次為2、6、9、11、13號(hào)峰， RSD為63.3%～79.0%，表明不同批次的尖尾風(fēng)藥材樣品中各成分含量差異相對(duì)較大，峰面積穩(wěn)定性較差。1、3、4、5、8、12號(hào)峰的RSD均小于60%，峰面積相對(duì)穩(wěn)定。這提示，不同產(chǎn)地或不同采收季節(jié)的尖尾風(fēng)藥材主要化學(xué)成分基本相似，但不同藥材樣品各成分的相對(duì)含量存在差異。其原因可能為尖尾風(fēng)藥材的種植受溫度、土壤、降雨量等生態(tài)環(huán)境的影響較大。

本研究中14批藥材樣品中有9批的相似度大于0.9，這可能與藥材樣品的產(chǎn)地、采集時(shí)間、不同植株年份累積不同有關(guān)。

14批藥材樣品主要聚為4類，S3、S5、S6、S11聚為一類，S1、S2、S4、S9、S10聚為一類，S7、S8、S13、S14聚為一類，S12為一類；主成分1和主成分2是影響藥材樣品質(zhì)量評(píng)價(jià)的主要因子。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，部分同一產(chǎn)地不同采集月份的藥材樣品，聚為不同類別，其原因有待后續(xù)進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2018-04-07 修回日期：2018-06-20）

（編輯：陳 宏）