新型降血糖化合物G004的遺傳毒性與生殖毒性研究

蔡鳴 侯艷 喬紅群 劉晶

摘 要 目的：研究新型降血糖化合物G004的遺傳毒性與生殖毒性。方法：分別采用Ames 試驗（鼠傷寒沙門氏菌突變株回復(fù)突變試驗）、CHL細(xì)胞（中國倉鼠肺成纖維細(xì)胞）染色體畸變試驗、小鼠骨髓微核實驗考察G004的遺傳毒性；采用大鼠胚胎-胎仔發(fā)育毒性實驗，在大鼠妊娠第6～15天連續(xù)灌胃給藥G004（劑量分別為100、300、900 mg/kg），考察其對孕鼠體質(zhì)量和攝食量、胚胎形成以及胎鼠生長發(fā)育等的影響，評價其生殖毒性。結(jié)果：遺傳毒性方面，G004的Ames試驗、CHL細(xì)胞染色體畸變試驗和小鼠骨髓微核實驗結(jié)果均為陰性；生殖毒性方面，G004各劑量組孕鼠均無明顯毒性反應(yīng)，100、300 mg/kg劑量組胎鼠生長發(fā)育正常，僅900 mg/kg劑量組出現(xiàn)吸收胎數(shù)增加及胎鼠骨骼發(fā)育遲緩。結(jié)論：G004無明顯遺傳毒性；劑量≤900 mg/kg時對懷孕大鼠母體無毒性作用，劑量≤300 mg/kg時對大鼠子代無致畸作用。

關(guān)鍵詞 降血糖藥；G004；遺傳毒性；生殖毒性；胚胎；發(fā)育

中圖分類號 Q355 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）22-3078-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.22.12

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the genotoxicity and reproductive toxicity of new hypoglycemic compound G004. METHODS： The genotoxicity of G004 was investigated by Ames trial （reverse mutation test of Salmonella typhimurium mutant）， CHL cell （Chinese hamster lung fibroblasts） chromosomal aberration test and mice bone marrow micronucleus test. In embryo-fetal development toxicity test， pregnant rats were given medicine intragastrically during 6-15 days of pregnancy （G004 dose of 100， 300， 900 mg/kg）. The effects of G004 on body weight and food intake of pregnant rats， embryo formation and fetal rat growth and development were investigated to evaluate reproductive toxicity of G004. RESULTS： The negative genotoxicity results were obtained in Ames trial， CHL cell chromosomal aberration test and mice bone marrow micronucleus test. In respect of reproductive toxicity， there was no obvious toxic reaction in pregnant rats of G004 different dose groups， and rat embryos developed normally in G004 100， 300 mg/kg groups. Only resorption number increased and rat embryos developed slowly in 900 mg/kg group. CONCLUSIONS： G004 shows no obvious genotoxicity. When the doses are not more than 900 mg/kg， G004 has no toxic effect on rat； when the doses are not more than 300 mg/kg， G004 has no teratogenic effect on rat offspring.

KEYWORDS Hypoglycemic agent； G004； Genotoxicity； Reproductive toxicity； Embryo； Development

G004化學(xué)名為1-{4-[2-（4-溴苯磺酰胺基）乙基]苯磺酰}-3-（反-4-甲基環(huán)己基）脲，其是以格列美脲降血糖活性結(jié)構(gòu)部分為母體，引入抗血栓活性基團(tuán)而合成的新型降血糖化合物[1]。據(jù)報道，G004具有抗實驗性血栓和保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用，能顯著促進(jìn)糖代謝，促進(jìn)大鼠胰島原代分離培養(yǎng)細(xì)胞分泌胰島素，并可顯著改善胰島素抵抗的HepG2細(xì)胞的糖代謝功能[2-7]。從新藥的臨床前安全性評價角度出發(fā)，筆者采用遺傳毒性評價的標(biāo)準(zhǔn)試/實驗組合方法（Ames試驗、CHL細(xì)胞染色體畸變試驗、小鼠骨髓微核實驗）研究G004的遺傳毒性；同時，采用大鼠胚胎-胎仔發(fā)育毒性實驗，研究G004的生殖毒性，旨在為其臨床前毒性研究以及臨床研究的安全性評價提供基礎(chǔ)研究依據(jù)，以期為妊娠期糖尿病孕婦的安全用藥提供更多、更好的選擇。

1 材料

1.1 儀器

BB16UV型CO2培養(yǎng)箱（德國Heraeus公司）；BX45型相差顯微鏡（日本Olympus公司）；87191型倒置顯微鏡（上海光學(xué)儀器廠）；F3JN7743型超純水機（美國Millipore公司）。

1.2 藥品與試劑

G004原料藥（中國藥科大學(xué)新藥研究中心提供，批號：20100705-01，純度：99.0%；使用前以0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配制成混懸液）；哺乳動物肝臟微粒體酶（簡稱“S9”，上海西唐生物科技有限公司）；4-硝基鄰苯二胺（NPD）、2-氨基芴（2-AF）、2-氨基蒽（2-AA）（美國Sigma-Aldrich公司）；柔紅霉素（美國Pharmacia公司）；疊氮鈉（東陽市凱明特種試劑有限公司）；甲基磺酸甲酯（MMS，比利時Acros Organics公司）；1，8-二羥基蒽醌（中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司）；絲裂霉素（浙江海正藥業(yè)股份有限公司）；環(huán)磷酰胺（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司）；RPMI Medium 1640培養(yǎng)液（日本日水制藥株式會社）；其余試劑均為分析純，水為自制純化水。

1.3 動物

SPF級ICR雄性小鼠50只，體質(zhì)量22～24 g；SPF級SD大鼠225只，雌鼠體質(zhì)量為210～269 g，雄鼠體質(zhì)量在300 g以上。動物均購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2007-0005。動物均在溫度為20～26 ℃、相對濕度為40%～70%的屏障環(huán)境中進(jìn)行飼養(yǎng)。

1.4 菌株和細(xì)胞

鼠傷寒沙門氏菌組氨酸營養(yǎng)缺陷型突變株（TA97、TA98、TA100、TA102、TA1535）、中國倉鼠肺成纖維細(xì)胞（CHL細(xì)胞）均來自江蘇省食品藥品檢驗所。

2 方法

2.1 Ames試驗

Ames試驗（鼠傷寒沙門氏菌突變株回復(fù)突變試驗）采用平板摻入法[8]。根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果（G004濃度高于1 250 μg/皿時會析出固體），本試驗設(shè)置5個G004劑量組（終濃度分別62.5、125、250、500、1 000 μg/皿），同時設(shè)空白對照組（自發(fā)回復(fù)突變）、溶媒對照組和陽性對照組。每組設(shè)置3個平行皿。試驗在加或不加代謝活化系統(tǒng)即哺乳動物肝臟微粒體酶（簡稱為“±S9”）的條件下平行進(jìn)行。-S9條件下，TA97菌株的陽性對照為NPD（20 μg/皿），TA98菌株的陽性對照為柔紅霉素（10 μg/皿），TA100、TA1535菌株的陽性對照為疊氮鈉（1.5 μg/皿），TA102菌株的陽性對照為MMS（2 μL/皿）； +S9條件下，TA97、TA98、TA100菌株的陽性對照為2-AF（20 μg/皿），TA102菌株的陽性對照為1，8-二羥基蒽醌（50 μg/皿），TA1535菌株的陽性對照為2-AA（5 μg/皿）。試管中依次加入S9混合液（+S9條件下）或pH 6.8磷酸鹽緩沖液（-S9條件下）0.5 mL，G004各劑量組分別加入不同濃度的G004混懸液0.1 mL，空白對照組不加樣，溶媒對照組加入相應(yīng)溶媒0.1 mL，陽性對照組分別加入相應(yīng)陽性對照溶液0.1 mL，最后分別加入預(yù)先振蕩培養(yǎng)的5種菌株培養(yǎng)液（密度為1×109～2×109個/mL）0.1 mL。隨后加入融化并保溫在45 ℃的上層培養(yǎng)基2 mL，在振蕩器上混勻后倒入含底層培養(yǎng)基的平皿中，輕輕旋轉(zhuǎn)平皿使上層培養(yǎng)基及內(nèi)含物均勻分布在底層培養(yǎng)基表面后，置暗處于室溫下放置45 min，再翻轉(zhuǎn)放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。菌落計數(shù)前先觀察背景菌苔，選擇背景菌苔正常的平皿計數(shù)各平板的菌落數(shù)。

2.2 CHL細(xì)胞染色體畸變試驗

根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果[G004對細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）=4 099.8 μg/mL]，并按照《藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[8]要求，本試驗設(shè)置3個G004劑量組（終質(zhì)量濃度分別為250、500、1 000 μg/mL），另設(shè)空白對照組、溶媒對照組和陽性對照組。-S9條件下陽性對照為絲裂霉素（0.4 μg/mL），+S9條件下陽性對照為環(huán)磷酰胺（20 μg/mL）。將CHL細(xì)胞制成細(xì)胞懸液（5×104個/mL），在細(xì)胞瓶中按1 mL/瓶接種，在1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)72 h后，G004各劑量組分別加入不同質(zhì)量濃度的G004混懸液100 μL，空白對照組不加樣，溶媒對照組加入相應(yīng)溶媒100 μL，陽性對照組分別加入相應(yīng)陽性對照溶液100 μL。-S9條件下，各組細(xì)胞在37 ℃分別培養(yǎng)24、48 h后收獲細(xì)胞；+S9條件下，各組細(xì)胞另加S9混合液0.5 mL，37 ℃培養(yǎng)6 h后，更換新鮮1640培養(yǎng)液再繼續(xù)培養(yǎng)18 h后收獲細(xì)胞。在收獲細(xì)胞前4 h加入秋水仙堿（0.2 μg/mL），按常規(guī)方法制備染色體標(biāo)本，Giemsa染色。顯微鏡下觀察各組100個中期分裂相細(xì)胞，記錄細(xì)胞染色體的數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常情況，計算細(xì)胞畸變率。

2.3 小鼠骨髓微核實驗

取雄性ICR小鼠50只，隨機分為5組，每組10只。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果[小鼠灌胃給予G004的半數(shù)致死量（LD50）大于5 000 mg/kg]，并按照《藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[8]要求，本試驗設(shè)置3個G004劑量組（625、1 250、2 500 mg/kg），并設(shè)溶媒對照組（0.5%羧甲基纖維素溶液）和陽性對照組（環(huán)磷酰胺，40 mg/kg）。G004各劑量組與溶媒對照組小鼠均灌胃給藥，陽性對照組小鼠腹腔注射給藥，給藥體積均為20 mL/kg，連續(xù)給藥3 d。在給藥期間及給藥結(jié)束后觀察各組小鼠外觀和行為活動等一般情況。末次給藥后24 h采集小鼠骨髓，常規(guī)制片，在顯微鏡油鏡下觀察2 000個嗜多染紅細(xì)胞（PCE），記錄含微核細(xì)胞數(shù)，計算PCE微核率；在觀察PCE的同時記錄相同視野下的正染紅細(xì)胞（NCE）數(shù)，當(dāng)PCE計數(shù)達(dá)到200個時，計算PCE占總紅細(xì)胞的比例[PCE個數(shù)/（NCE個數(shù)+PCE個數(shù)）]。

2.4 大鼠胚胎-胎仔發(fā)育毒性實驗

參照文獻(xiàn)[9-10]方法，將大鼠按雌性/雄性2∶1的比例合籠，每天早上對雌鼠進(jìn)行陰道涂片檢查，顯微鏡下查見精子視為交配成功，并將當(dāng)天定為妊娠第0天。取交配成功的雌性大鼠100只按體質(zhì)量分層隨機分為5組，每組20只。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果（G004單次灌胃5 000 mg/kg后未引起大鼠死亡），并按照《藥物生殖毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[11]要求，本實驗設(shè)置G004低、中、高劑量組（100、300、900 mg/kg），另設(shè)溶媒對照組（0.5%羧甲基纖維素鈉溶液）和陽性對照組（環(huán)磷酰胺，3.5 mg/kg）。各組大鼠均灌胃給藥，給藥體積均為10 mL/kg，連續(xù)給藥10 d（妊娠第6～15天）。給藥期間觀察孕鼠外觀和行為活動等一般情況。于妊娠第0、3、6、10、13、16、20天時稱定大鼠體質(zhì)量，并稱定前一日加食量與當(dāng)日剩食量以計算當(dāng)日攝食量。于妊娠第20天時處死孕鼠，剖取胎鼠，記錄黃體數(shù)、著床數(shù)、死胎數(shù)、活胎數(shù)、體質(zhì)量、性別、外觀異常情況等。取約半數(shù)胎鼠固定于Bouin氏液中進(jìn)行內(nèi)臟檢查，另外的胎鼠固定于75%乙醇中制作骨骼標(biāo)本后進(jìn)行骨骼畸形檢查。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以x±s表示，先進(jìn)行各組間方差齊性檢驗，若方差齊則進(jìn)行單因素方差分析，如有統(tǒng)計學(xué)差異則進(jìn)行Tukey檢驗；若方差不齊則進(jìn)行非參數(shù)檢驗（Kruskal-Wallis檢驗），如有統(tǒng)計學(xué)差異則各劑量組與對照組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。計數(shù)資料采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 G004對鼠傷寒沙門氏菌突變株回復(fù)突變菌落數(shù)的影響

與溶媒對照組比較，陽性對照組回復(fù)突變菌落數(shù)顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。G004各劑量組平板背景菌苔均正常；與溶媒對照組比較，在±S9條件下，G004各劑量組的TA97、TA98、TA100、TA102、TA1535菌株的回復(fù)突變菌落數(shù)均未顯著增加，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。G004的Ames試驗結(jié)果為陰性，即G004對鼠傷寒沙門氏菌突變株回復(fù)突變試驗無明顯影響。G004對鼠傷寒沙門氏菌突變株回復(fù)突變菌落數(shù)的影響見表1。

3.2 G004對CHL細(xì)胞染色體畸變的影響

與溶媒對照組比較，陽性對照組CHL細(xì)胞染色體畸變率顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；在±S9條件下，G004 各劑量組CHL細(xì)胞在藥物作用不同時間后，其染色體畸變率均未顯著升高，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。G004的CHL細(xì)胞染色體畸變試驗結(jié)果為陰性，即G004對CHL細(xì)胞染色體畸變試驗無明顯影響。

3.3 G004對小鼠骨髓微核的影響

給藥期間及給藥結(jié)束后，G004各劑量組、溶媒對照組和陽性對照組小鼠的外觀和行為活動均未出現(xiàn)異常。骨髓涂片結(jié)果顯示，與溶媒對照組比較，陽性對照組小鼠骨髓PCE微核率顯著升高，PCE占總紅細(xì)胞的比例顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）；G004各劑量組小鼠骨髓PCE微核率、PCE占總紅細(xì)胞的比例差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。G004的小鼠骨髓微核試驗結(jié)果為陰性，即G004對小鼠骨髓微核試驗無明顯影響。G004對小鼠骨髓微核的影響見表2。

3.4 G004對大鼠胚胎-胎仔發(fā)育的影響

3.4.1 G004對孕鼠的影響 給藥期間，各組孕鼠外觀和行為活動均未見異常，均未表現(xiàn)出明顯毒性癥狀。與溶媒對照組比較，G004各劑量組、陽性對照組孕鼠的攝食量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；陽性對照組孕鼠實驗后期體質(zhì)量增加明顯減緩，從妊娠第10天起體質(zhì)量均顯著較低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）；G004各劑量組孕鼠體質(zhì)量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。這表明G004對孕鼠攝食量和體質(zhì)量均無明顯影響。G004對孕鼠體質(zhì)量的影響見表3。

3.4.2 G004對大鼠妊娠結(jié)局的影響 與溶媒對照組比較，陽性對照組大鼠活胎數(shù)顯著減少，吸收胎數(shù)顯著增加，子宮總質(zhì)量、胎盤總質(zhì)量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）；G004高劑量組的吸收胎數(shù)顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），該組其他各項指標(biāo)及G004低、中劑量組各項指標(biāo)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。這表明G004劑量為900 mg/kg時可對大鼠妊娠結(jié)局產(chǎn)生一定的影響。G004對大鼠妊娠結(jié)局的影響見表4。

3.4.3 G004對胎鼠生長發(fā)育的影響 與溶媒對照組比較，陽性對照組胎鼠體質(zhì)量、頂臀長均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；G004各劑量組上述指標(biāo)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。這表明G004對胎鼠生長發(fā)育無明顯影響。G004對胎鼠生長發(fā)育的影響見表5。

3.4.4 G004對胎鼠外觀、內(nèi)臟和骨骼的影響 G004各劑量組和溶媒對照組胎鼠外觀均未見畸形；G004高劑量組胎鼠的內(nèi)臟檢查亦未見畸形，中、低劑量組未作檢查并保留標(biāo)本；陽性對照組除1例胎鼠樣本出現(xiàn)腎積水外，其他樣本的外觀、內(nèi)臟等指標(biāo)亦未見明顯異常。

與溶媒對照組比較，陽性對照組102例胎鼠樣本中有枕骨骨化不全30例（其中Ⅰ級骨化不全19例、Ⅱ級骨化不全9例、Ⅲ級骨化不全2例）、胸骨畸形42例，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；另有肋骨畸形2例（1例第13肋短小，1例第7肋變長）、尾骨缺失1例，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與溶媒對照組比較，G004高劑量組118例胎鼠樣本中有枕骨骨化不全21例（其中Ⅰ級骨化不全13例、Ⅱ級骨化不全7例、Ⅲ級骨化不全1例），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），而該組其余指標(biāo)及G004低、中劑量組各項指標(biāo)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。這表明G004劑量為900 mg/kg時可對大鼠子代的骨骼發(fā)育產(chǎn)生明顯影響。G004對胎鼠骨骼發(fā)育的影響見表6。

4 討論

雖然多數(shù)妊娠期糖尿病患者可通過控制飲食來調(diào)節(jié)血糖水平，但仍有部分患者需要通過藥物治療來控制血糖。過去臨床上認(rèn)為，胰島素為治療妊娠期糖尿病的唯一選擇，因為其他口服降糖藥有可能會透過胎盤導(dǎo)致胎兒畸形。但近年來研制的第二代磺脲類藥物及阿卡波糖等口服降糖藥在臨床上未發(fā)現(xiàn)有致畸作用[12]。第一代磺脲類藥物的胎盤通透性較大，可自由透過胎盤，由此可能造成死胎或胎兒畸形；而第二代磺脲類藥物的胎盤通透性小，即便在母體血藥濃度很高時，胎兒的血藥濃度仍不超過母體的2%[13]。

G004是由中國藥科大學(xué)新藥研究中心研發(fā)的新型降血糖化合物，以具有降糖活性的磺酰脲結(jié)構(gòu)為母核連接具有抗血小板聚集活性的化學(xué)基團(tuán)設(shè)計而成，除有顯著的降血糖作用外，尚可對抗糖尿病患者的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血小板聚集、凝血及纖溶功能異常等，有利于糖尿病血管并發(fā)癥的防治[2-7，14]。G004的相對分子量大、血漿蛋白結(jié)合率高、半衰期較短，與其他第二代磺脲類藥物有相似的藥動學(xué)特性[15]，因此推測其遺傳毒性和生殖毒性較傳統(tǒng)口服降糖藥明顯降低。本文首次報道了G004的遺傳毒性和生殖毒性。G004的遺傳毒性3項試/實驗（Ames試驗、CHL細(xì)胞染色體畸變試驗、小鼠骨髓微核實驗）結(jié)果均為陰性，表明在本試驗條件和用藥劑量下，G004無致基因突變或染色體畸變作用，即無明顯致突變性。大鼠胚胎-胎仔發(fā)育毒性實驗結(jié)果顯示，G004劑量≤900 mg/kg時對懷孕大鼠母體無毒性作用，劑量≤300 mg/kg時對大鼠子代無致畸作用，表明G004在一定劑量下無明顯生殖毒性。

綜上所述，G004無明顯遺傳毒性，在一定劑量下也無明顯生殖毒性，總體安全性較好。但此結(jié)論仍有待于后續(xù)深入開展G004毒動學(xué)研究進(jìn)行證實。

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（收稿日期：2018-05-30 修回日期：2018-10-05）

（編輯：段思怡）