淺談測序技術(shù)在各個領(lǐng)域的應(yīng)用

孫子奎

摘 要：本文首先介紹現(xiàn)有的三代測序技術(shù)的內(nèi)容、方法、原理等；其次，分析和研究了不同測序技術(shù)在生育健康、腫瘤診斷與治療、用藥指導(dǎo)等健康醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，育種領(lǐng)域及環(huán)境保護領(lǐng)域的應(yīng)用；最后，結(jié)合政策紅利不斷持續(xù)及市場需求大幅增加等因素，展望測序技術(shù)在未來各領(lǐng)域的應(yīng)用需求前景廣闊。

細胞是生命體最基本的結(jié)構(gòu)單位和功能單位，所有的細胞都含有兩種核酸： 即DNA與RNA。核酸是一種大分子化合物，由核苷酸聚合而成，是生命體存在的基礎(chǔ)，生命體內(nèi)的核酸具有易于蛋白質(zhì)結(jié)合的特性，以核蛋白的形式存在?；诨瘜W(xué)組成，可將核酸分為核糖核酸和脫氧核糖核酸，即DNA和RNA。DNA主要作為儲存、復(fù)制和傳遞遺傳信息的介質(zhì)。RNA又分為tRNA、mRNA和rRNA，其中tRNA，即轉(zhuǎn)運核糖核酸，主要通過攜帶和轉(zhuǎn)移活化氨基酸的方式，作為核糖核酸的搬運工，促進蛋白質(zhì)合成。mRNA又稱為信使核糖核酸，是蛋白質(zhì)合成的模板；rRNA，即核糖體的核糖核酸，主要作為蛋白質(zhì)合成的場所。

快速準確獲取細胞中的核酸信息或基因組遺傳信息在生命科學(xué)研究領(lǐng)域的重要性不言而喻。自上個世紀70年代第一代測序平臺的發(fā)展、成熟，到如今的第二代高通量測序平臺和第三代單分子測序平臺快速占領(lǐng)基因測序市場。本文將根據(jù)第一、二、三代測序技術(shù)的不同發(fā)展階段，結(jié)合不同測序技術(shù)的實際應(yīng)用情況，研究不同測序技術(shù)在各領(lǐng)域的應(yīng)用。

一、測序技術(shù)簡介

（一）第一代測序技術(shù)

第一代測序技術(shù)以桑格（ Sanger）等的雙脫氧測序技術(shù)為代表，并引領(lǐng)市場30年。其原理是以DNA單鏈為模板，通過PCR擴增、電泳分離、激光誘導(dǎo)熒光顏色區(qū)分及信息轉(zhuǎn)換等一系列的操作步驟后，獲得長度為1000堿基的組成序列。第一代測序技術(shù)廣泛應(yīng)用于PCR產(chǎn)物、載體克隆測序等方面，具有讀長達1000bp、準確性高達99.99%等特點，但第一代測序技術(shù)通量低、成本高的缺點，也限制了其在很多領(lǐng)域的大規(guī)模應(yīng)用，同時也激發(fā)了眾多科學(xué)研究者尋找新一代測序技術(shù)的研究浪潮。

（二）第二代測序技術(shù)

在市場需求及技術(shù)創(chuàng)新的雙重推動下，兼具高通量、低成本等優(yōu)點的第二代測序技術(shù)誕生。第二代高通量測序技術(shù)為深度測序（deep sequencing）或下一代測序技術(shù)（next generation sequencing，NGS）。第二代高通量測序技術(shù)的原理是直接通過聚合酶或連接酶的作用，進行體外測序，而無須進行體內(nèi)擴增。

1、聚合酶合成測序法

目前，行業(yè)內(nèi)從事高通量基因測序的公司，基本均與Illumina公司保持合作關(guān)系，采用其Solexa和Hiseq設(shè)備。聚合酶合成測序法是以特有的可逆終止化學(xué)反應(yīng)原理為基礎(chǔ)，對被隨機打斷的基因組DNA片段構(gòu)建文庫，經(jīng)過延伸和擴增，進行邊合成邊測序。

2、連接酶合成測序法

連接酶合成測序法，即Solid測序，其原理是應(yīng)用雙堿基編碼技術(shù)，增加堿基被閱讀次數(shù)，降低測序過程錯誤比率，便于方便區(qū)分SNP和測序錯誤，并利用DNA連接酶在連接過程之中測序，在測序過程中，儀器自動加入4種熒光標記的寡核苷酸探針，促使其與引物發(fā)生連接反應(yīng)、激發(fā)熒光標記的方式，識別堿基類型。

第二代測序技術(shù)在保持第一代測序高準確性的同時，大幅提高了測序效率，并降低了測序的成本，但其也存在讀長較第一代測序短的不足。

（三）第三代測序技術(shù)

第三代測序技術(shù)，即單分子測序技術(shù)，以SMRT和新型納米孔測序技術(shù)為代表。具有無需PCR擴增、讀長較長、CCS模式提高準確率、測序無堿基偏好性，堿基讀取無系統(tǒng)偏差，能直接讀取堿基修飾等特點。

SMRT測序技術(shù)采用熒光標記脫氧核苷酸，用顯微鏡實時記錄熒光的強度變化的方式進行。當(dāng)被標記的脫氧核苷酸混入DNA鏈時，DNA鏈上就能探測到該熒光。當(dāng)被熒光標記的脫氧核苷酸與DNA鏈形成化學(xué)鍵時，DNA聚合酶將切除該熒光基團。在此過程中，DNA聚合酶的活性不受熒光標記物影響。因此，熒光基團被切除后，能產(chǎn)生與天然DNA鏈完全一樣的合成的DNA鏈。

新型納米孔測序法的實驗原理是依據(jù)ATCG單個堿基具有的不同帶電性質(zhì)，采用電泳技術(shù)，通過信號差異促使不同的單個堿基逐一通過直徑非常細小的納米孔的方式實現(xiàn)測序。

二、測序技術(shù)在各領(lǐng)域的應(yīng)用。

（一）測序技術(shù)在健康領(lǐng)域的應(yīng)用

各種疾病的產(chǎn)生，均與基因序列的異變有著密不可分的關(guān)系?；驕y序即在分子水平通過對基因序列進行精準測定，從而提供早期篩查和治療建議的一種生物科技技術(shù)。隨著科學(xué)研究的不斷深入，測序技術(shù)不斷演進，人們對眾多基因的結(jié)構(gòu)和功能更加了解，加速了測序技術(shù)在生育健康領(lǐng)域（含親子檢測）、腫瘤診斷治療領(lǐng)域、以高血壓、糖尿病為代表的慢病、遺傳性疾病、乙肝基因檢測等多種疾病的臨床用藥指導(dǎo)領(lǐng)域內(nèi)的廣泛應(yīng)用。

1、生育健康領(lǐng)域

市場需求助力測序技術(shù)在生育健康領(lǐng)域的應(yīng)用。一方面，二胎政策放開、高齡產(chǎn)婦數(shù)量增加，將大幅增加孕后產(chǎn)前篩查和新生兒疾病檢測的需求。另一方面，由于環(huán)境污染等各種因素的影響，我國不孕不育率逐年上升，這也將加速試管嬰兒胚胎植入前的測序需求。

測序技術(shù)可以通過遺傳咨詢方式，基于測序結(jié)果，結(jié)合疾病的不同遺傳模式進行生育指導(dǎo)。通過孕后產(chǎn)前診斷技術(shù)、試管嬰兒胚胎植入前篩查等技術(shù)，檢查胎兒的基因序列，進而判斷其健康狀況，提高新生寶寶的健康率。無創(chuàng)產(chǎn)前檢測（NIPT）是基因測序所應(yīng)用的產(chǎn)業(yè)化程度較高的生育健康市場細分領(lǐng)域。與傳統(tǒng)的孕后產(chǎn)前臨床檢測技術(shù)相比，NIPT具有安全性好、準確率高、周期短等優(yōu)勢。

2、腫瘤診斷治療領(lǐng)域

國家癌癥中心2017年公布的我國腫瘤發(fā)病率和死亡率的現(xiàn)狀和趨勢數(shù)據(jù)顯示，目前肺癌、胃癌、肝癌、食管癌和結(jié)直腸癌位居我國腫瘤發(fā)病前五位。其中，肺癌的高致死性多發(fā)生在男性患者群體中，而乳腺癌在女性患者中則高居榜首。目前，C：＼Users＼Administrator＼Desktop＼50019265414022609_？-？？-？？￥？_？μ？è°？？μ？？o？？？？？？ˉ？？¨？？？？？aé￠？？？？？？？？o？？？¨pp＼PaperPass-？？？è？°？？？-？￡？？μ？？？￥？？？＼htmls＼sentence_detail＼75.html肺癌、胃癌、肝癌、食管癌和結(jié)直腸癌位居我國腫瘤死亡前五位。綜合來看，肺癌居發(fā)病率和死因率均居榜首。預(yù)防難、發(fā)現(xiàn)晚和難治療是我國腫瘤防控的難點。面對結(jié)直腸癌、胃癌、肺癌等腫瘤的發(fā)病及死亡率均居前列的嚴峻形勢，結(jié)合基因測序具有早期篩查疾病發(fā)生、精準定位差異信息并指導(dǎo)精準、安全用藥、輔助臨床診斷治療等作用。因此，通過基因測序手段進行癌癥的早期篩查、診斷、治療就顯得至關(guān)重要。

目前，基于特定突變，通過對血液樣本DNA進行分析的方式確定腫瘤存在并能指導(dǎo)干預(yù)治療的液體活檢技術(shù)備受科學(xué)研究者的關(guān)注，未來液體活檢檢查必將像當(dāng)前市場上的Pap涂片和結(jié)腸鏡檢查一樣，成為癌癥篩查的重要工具。此外，部分慢病如糖尿病、高血壓、心腦血管等疾病的發(fā)生與基因表達有著密切的聯(lián)系，利用基因測序技術(shù)能通過連鎖分析等手段尋找對應(yīng)基因、鑒定基因功能等方式，鎖定疾病相關(guān)基因，確定提前預(yù)知疾病發(fā)生的風(fēng)險，并能針對基因差異性情況，提供個性化的預(yù)防、診斷、治療及健康管理方案。

3、用藥指導(dǎo)領(lǐng)域

基因檢測用于臨床用藥指導(dǎo)的原理是基于患者體內(nèi)影響藥物代謝的酶的差異，通過基因檢測結(jié)果，分析其代謝水平，進而了解其對藥物反應(yīng)相關(guān)的基因是否存在異變，從而判斷其對藥物的不良反應(yīng)程度，輔助醫(yī)生在藥品選擇、劑量控制及聯(lián)合用藥等方面提供精準、個性化的用藥方案，確保精準用藥的同時，降低過度攝入藥物的毒副作用。

（二）農(nóng)業(yè)育種領(lǐng)域

高通量測序技術(shù)低成本的特性、可擁有參考基因組序列物種的增多、以及全基因組從頭測序和深度重測序、分子標記開發(fā)、遺傳差異及連鎖分析、表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄組分析等方法的不斷推出，為新品種選育、品質(zhì)改良提供了前所未有的方案，縮短了新品種的育種周期，加速了高通量測序技術(shù)在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究領(lǐng)域的充分應(yīng)用。在全基因組水平上掃描并檢測相關(guān)重要位點，對育種領(lǐng)域的研究具有極大的科研與產(chǎn)業(yè)價值。

（三）環(huán)境保護領(lǐng)域

1、土壤保護領(lǐng)域

土壤微生物種類繁多，約達數(shù)萬種，在土壤生態(tài)系統(tǒng)扮演著舉足輕重的角色。通過多種不同代謝方式和生理功能實現(xiàn)的微生物的功能多樣性是評價土壤變化原因的重要指示因子。

基于高通量測序技術(shù)通量較高的特點，土壤微生物在物種、結(jié)構(gòu)、功能和遺傳多樣性等領(lǐng)域的研究內(nèi)容及信息更加豐富。通過高通量測序技術(shù)檢測土壤中微生物細胞內(nèi)特定遺傳物質(zhì)的保守序列中可變區(qū)域的測定和比對，可分析探究土壤微生物物種和群落結(jié)構(gòu)的多樣性特征。

2、污水治理領(lǐng)域

隨著我國工業(yè)化水平的不斷提高，工業(yè)廢水已成為污水排放比的主要排放源，占我國工業(yè)污水排放總量的比例超過1/3以上。同時，由于多數(shù)企業(yè)無證排污、偷排和超排情況嚴重，排放量大、達標率低、回用率低是我國污水治理面臨的重要現(xiàn)狀。

通過基因測序技術(shù)，對污水中的菌群的結(jié)構(gòu)和功能進行分析，配合采用生物菌劑及微生態(tài)營養(yǎng)制劑作為添加劑等方式，增強有利細胞的代謝強度，加速增殖，促使高效氧化分解毒性污染物，提高系統(tǒng)抗沖擊性和穩(wěn)定性，以較低的運行成本、高效的處理效率、較低的管理難度進行污水治理。

三、展望

政府支持和鼓勵以基因測序為基礎(chǔ)的精準醫(yī)療行業(yè)迎來政策紅利。2015年，《關(guān)于產(chǎn)前診斷機構(gòu)開展高通量基因測序產(chǎn)前篩查與診斷臨床應(yīng)用試點工作的通知》和《關(guān)于開展高通量基因測序技術(shù)臨床應(yīng)用試點工作的通知》相繼出臺，審批通過百余家醫(yī)療機構(gòu)作為高通量基因測序NIPT臨床試點單位，從國家層面肯定高通量測序技術(shù)在臨床檢測中的重要作用。2016年，《關(guān)于發(fā)布國家重點研發(fā)計劃精準醫(yī)學(xué)研究重點專項2016年度項目申報指南的通知》頒布，將精準醫(yī)療列為2016年優(yōu)先啟動的重點專項之一。2017年，地球生物基因組計劃（EBP）正式提出，對地球上所有真核生物進行測序。地球物種基因組計劃的啟動、實施得益于基因測序技術(shù)的進步，同時也能推進測序技術(shù)的發(fā)展，提高技術(shù)人員的能力，進而促進基因測序行業(yè)的爆發(fā)式發(fā)展。

政策持續(xù)利好、產(chǎn)業(yè)潛在需求巨大、測序技術(shù)的不斷更新將加速基因測序在各個領(lǐng)域的應(yīng)用推廣。利用高通量二代和三代測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)基因的細微差異；利用一代基因測序的精確度，深入探究微生物演進。相信未來，基因測序技術(shù)能為人類的健康和疾病預(yù)防和治療和地球的生態(tài)平衡等帶來質(zhì)的飛躍。

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