親和層析在蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用

董志萍

摘要：親和層析是根據(jù)將相互間具有高度特異親和性的兩種物質(zhì)之一作為固定相，利用生物分子與特定的固定配基之間的親和力不同而使生物分子得以分離的層析方法。親和層析已廣泛應(yīng)用于生物分子的分離和純化，如酶、抗原、激素、糖蛋白及輔助因子以及細(xì)胞、細(xì)胞器等。特別是對(duì)于那些分離流程長(zhǎng)、雜質(zhì)多、使用常規(guī)方法難以分離的生物分子來(lái)說(shuō)，親和層析具有獨(dú)特的優(yōu)越性。本文主要介紹在生物因子、免疫幾類(lèi)常規(guī)親和層析的原理及其在蛋白質(zhì)的分離純化以及分析鑒定方面的應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：親和層析；蛋白質(zhì)；應(yīng)用與發(fā)展

親和層析是通過(guò)將具有親和力的兩個(gè)分子中一個(gè)固定在不溶性基質(zhì)上，利用分子間親和力的特異性和可逆性，對(duì)另一個(gè)分子進(jìn)行分離純化。利用偶聯(lián)親和配基的親和吸附介質(zhì)為固定相親將一對(duì)能可逆結(jié)合和解離生物分子的一方作為配基，使用親和吸附劑填充色譜柱，當(dāng)含有被分離物質(zhì)的混合物隨著流動(dòng)相流經(jīng)色譜柱時(shí)，親和吸附劑便進(jìn)行選擇吸附，它具有很高的選擇和分離性能以及較大的載量，只需要簡(jiǎn)單操作即可使某待分離的生物大分子從復(fù)雜的混合物中分離出來(lái)，達(dá)到千倍以上的純化，并保持較高的活性，是分離純化以及分析生物大分子尤其是蛋白質(zhì)的有力工具。

1 親和配基的選擇與分類(lèi)

親和層析介質(zhì)由配基和載體構(gòu)成，配體是能與目的產(chǎn)物大分子相結(jié)合、解離的生物結(jié)構(gòu)和分子，為決定親和層析成功的關(guān)鍵因素。配體必須具有以下特征：與待分離的物質(zhì)有適當(dāng)?shù)挠H和力、與待分離的物質(zhì)之間的親和力要有較強(qiáng)的特異性、與基質(zhì)穩(wěn)定的共價(jià)結(jié)合、自身應(yīng)具有較好的穩(wěn)定性。根據(jù)配體的特性并結(jié)合其與生物大分子之間相互作用體系的不同，親和配基主要分為兩大類(lèi)。

1.1 特異性配體

特異性配體只與單一或很少種類(lèi)的蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合的配體，能夠分離特定單克隆抗體或多克隆抗體，如抗原和抗體、酶和它的抑制劑等。其中免疫親和層析是利用抗原抗體中的一方為配體，親和吸附另一方的分離系統(tǒng)。免疫親和層析應(yīng)用十分廣泛，許多典型的親和層析純化蛋白質(zhì)的過(guò)程已經(jīng)使用了單克隆抗體作為親和配體。目前，利用抗體-抗原模式，有可能得到每一種目標(biāo)蛋白的單抗，然后以單抗為配基，通過(guò)親和層析技術(shù)分離純化目標(biāo)蛋白質(zhì)。此種方法的純化倍數(shù)、活性回收率非常高。免疫檢測(cè)法利用被標(biāo)記的抗體或模擬分析物來(lái)進(jìn)行間接的分析。常用標(biāo)記有熒光標(biāo)記、酶標(biāo)記、化學(xué)熒光等。脫氫酶和激酶等需要在輔酶存在的情況下才能表現(xiàn)出生物活性，即輔酶能與脫氫酶和激酶之間通過(guò)親和作用相互結(jié)合，因此這些輔酶可用作脫氫酶和激酶的親和配基。通常具有高的選擇性，典型的物質(zhì)對(duì)有酶-底物、酶-抑制劑、激素-受體等。

1.2 通用性配體

一般通用性配體特異性不是很強(qiáng)，是能和某一類(lèi)的蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合的配體，如凝集素可以結(jié)合各種糖蛋白，凝集素是在自然界廣泛存在的一大類(lèi)糖結(jié)合蛋白。它們具有不同的糖結(jié)合專(zhuān)一性。利用天然存在的一些多糖和被固定化的不同糖鏈結(jié)構(gòu)的糖蛋白，可以有效地分離純化不同型的凝集素，也可應(yīng)用固定化的凝集素分離純化各種糖蛋白。固定化金屬離子親和層析是利用金屬離子的絡(luò)合物或形成螯合物的能力吸附蛋白質(zhì)的分離系統(tǒng)。目的蛋白質(zhì)表面暴露的供電子氨基酸殘基，如組氨酸的咪唑基，半胱氨酸的巰基和色氨酸的吲哚基，十分有利于蛋白質(zhì)與固定化金屬離子結(jié)合。過(guò)度金屬離子通過(guò)亞氨基二乙酸被固定在固定相載體表面，用作親和吸附蛋白質(zhì)的配基。

2 親和層析的應(yīng)用

2.1 親和層析法分離純化蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)組學(xué)中親和層析主要被用作選擇性地預(yù)處理和濃縮待處理樣品，應(yīng)用A蛋白親和層析法，從采集的小鼠腹水中純化抗凝血因子Ⅶ單克隆抗體，能夠得到純度較高的單克隆抗體，適用于高純度單克隆抗體的制備。另外，親和層析也可濃縮蛋白，將所有蛋白分類(lèi)成多個(gè)組群以便進(jìn)一步分析鑒定。

在對(duì)樣品分析鑒定前，可借助親和層析進(jìn)行預(yù)處理，減輕樣品的復(fù)雜程度。同時(shí)親和層析能被用在蛋白水解消化之前或之后的蛋白以及肽鏈的分離。親和層析分析糖蛋白是利用目標(biāo)聚糖甚至在蛋白質(zhì)水解以后都能被凝集素識(shí)別而進(jìn)行的，利用抗體和某些IMAC的親和層析可用來(lái)分離并濃縮糖肽。

2.2 親和色譜純化生長(zhǎng)因子

親和層析也被用來(lái)研究生長(zhǎng)因子間的相互作用如如初分離純化舟山眼鏡蛇毒，獲得的蛇毒粗毒進(jìn)行分子篩色譜，對(duì)含NGF部分進(jìn)行離子交換色譜，分步洗脫。用0.02mol/L pH7.0 PBS平衡親和色譜柱，取2g舟山眼鏡蛇毒，用同樣緩沖液溶解，離心去除沉淀，緩慢加樣，然后用PBS洗去雜蛋白。親和色譜純化舟山眼鏡蛇毒的洗脫曲線(xiàn)中，分隔帶明顯，親和色譜分離NGF得率比傳統(tǒng)分離方法提高將近50%。

2.4 親和層析與其他分析技術(shù)相結(jié)合

生物分子的分離純化，有時(shí)需要多種分離手段同時(shí)使用，在進(jìn)行重組蛋白的純化時(shí)，綜合使用多種技術(shù)，一般來(lái)說(shuō)，在選擇分離純化方法時(shí)應(yīng)遵循下列原則：應(yīng)選擇不同分離純化機(jī)理的方法聯(lián)合使用、應(yīng)首先選擇能除去含量最多雜質(zhì)的方法、應(yīng)盡量選擇高效的分離方法、應(yīng)將最費(fèi)時(shí)、成本最高的分離純化方法安排在最后階段。近年來(lái)的另一發(fā)展趨勢(shì)是尋求更加優(yōu)化的系統(tǒng)設(shè)計(jì)和安排形式，從而獲得快速、優(yōu)良的選擇性以及很大數(shù)量被檢測(cè)的樣品。親和層析與其他分析技術(shù)串聯(lián)結(jié)合即可很好地達(dá)到這一目的，色譜技術(shù)是目前所知的最好的分離方法之一，而親和層析在其中也發(fā)揮著不可替代的作用，相信其在未來(lái)的發(fā)展也必將大有可為。

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