外源NO及反向調(diào)控PEG脅迫下苜蓿萌發(fā)種子抗氧化酶及其同工酶動態(tài)的研究

辛夏青，魏小紅，韓廳，岳凱，趙穎

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

紫花苜蓿(Medicagosativa)是一種多年生優(yōu)質(zhì)豆科草本植物，被譽(yù)為“牧草之王”，也是我國北方等地種植面積最大的人工牧草，其營養(yǎng)價(jià)值高、適口性好，是牛羊等牲畜的重要飼料[1]。在我國苜蓿產(chǎn)區(qū)水資源緊缺已成為苜蓿高產(chǎn)的主要限制性因素之一，西北地區(qū)種植的很多苜蓿品種抗旱能力普遍不高，在灌溉不足的條件下難獲高產(chǎn)[2]。逆境脅迫使植物細(xì)胞質(zhì)中活性氧(ROS)分子包括過氧化氫(H2O2)、超氧陰離子(O2-·)和羥自由基(·OH)等大量累積，使植物受到次級氧化脅迫，最終作用到細(xì)胞核的組氨酸激酶受體蛋白(HKT)上，導(dǎo)致膜脂、蛋白質(zhì)和核酸等氧化損傷，改變細(xì)胞代謝，造成對植物的傷害[3-4]。為了降低和消除氧化脅迫，植物細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)了抗氧化防御系統(tǒng)，包括由POD、SOD及CAT等組成的抗氧化酶系統(tǒng)[5]。已有研究表明較低濃度的NO對植物細(xì)胞具有保護(hù)作用，而較高濃度卻表現(xiàn)為毒害效應(yīng)[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)0.1 mmol·L-1硝普鈉(SNP)能有效緩解鹽脅迫下紫花苜蓿的氧化損傷[8]；外源NO能提高干旱脅迫下小麥(Triticumaestivum)幼苗葉片中SOD、POD 和CAT活性，降低超氧陰離子(O2-·)和過氧化氫(H2O2)水平，緩解膜脂過氧化，穩(wěn)定生物膜的結(jié)構(gòu)和功能[9]。同工酶是植物體內(nèi)最活躍的酶之一，其合成和活性始終受到遺傳基因的控制和調(diào)節(jié)。不良環(huán)境可能會引起基因變異使酶組分及其活性發(fā)生改變，而導(dǎo)致同工酶酶譜變化，這種改變反映在同工酶的譜帶上，出現(xiàn)了不同數(shù)量及不同遷移率的譜帶[10]。酶活性和同工酶結(jié)構(gòu)從生理和分子2個(gè)水平上反映了紫花苜蓿抗氧化酶系統(tǒng)對干旱脅迫的響應(yīng)機(jī)制。

目前關(guān)于外源NO及反向調(diào)控PEG(聚乙二醇6000)脅迫下苜蓿萌發(fā)種子抗氧化酶及其同工酶動態(tài)的研究未見報(bào)道。因此本試驗(yàn)用NO及其抑制劑c-PTIO[(2-(4-羧苯基)-4,4,5,5-四甲基咪唑啉-1-烴氧基-3-氧化鈉鹽)]處理PEG脅迫下紫花苜蓿種子，通過對抗氧化酶活性及同工酶組分的研究，探討NO在干旱逆境中紫花苜蓿的抗旱性，旨在為紫花苜蓿的耐旱生理研究機(jī)制提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

供試材料為紫花苜蓿，品種為“三得利”，購買于甘肅省蘭州永豐種子公司。千粒重2.0223 g。本試驗(yàn)于2016年11月至2017年6月在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院植物生理實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

種子萌發(fā)處理：本試驗(yàn)設(shè)6個(gè)處理，T1：CK(蒸餾水)；T2：PEG(15% PEG)；T3：SNP(0.1 mmol·L-1硝普鈉)；T4：PEG+SNP(15% PEG+0.1 mmol·L-1SNP)；T5：c-PTIO(200 μmol·L-1c-PTIO)；T6：PEG+c-PTIO (15% PEG+200 μmol·L-1c-PTIO)。挑選大小一致、飽滿的紫花苜蓿種子用0.1%氯化汞溶液消毒5 min，蒸餾水沖洗5～6次。分別用蒸餾水、PEG、SNP、PEG+SNP、c-PTIO、PEG+c-PTIO浸泡苜蓿種子48 h，將種子置于墊有雙層濾紙的培養(yǎng)皿(φ=9 cm)中，每皿50粒種子，每個(gè)處理重復(fù)3次，每個(gè)培養(yǎng)皿加處理液4 mL，24 h更換一次處理液。培養(yǎng)在(25±1) ℃，12 h光照/12 h黑暗條件下，分別在處理后的2、4、6、8 d取樣，用于抗氧化酶及同工酶活性測定。

1.2 種子萌發(fā)中抗氧化酶活性的測定

酶液提?。悍Q取不同處理的樣品0.5 g，在冰浴條件下置于預(yù)冷過的研缽中，加入50 mmol·L-1pH 7.8的磷酸緩沖液(內(nèi)含1%聚乙烯吡咯烷酮)5 mL研磨至勻漿，轉(zhuǎn)入10 mL離心管，在4 ℃、10000 r·min-1條件下離心15 min，上清液即為酶液[11]。

過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚氧化法測定[11]；超氧化物歧化酶(SOD)活性采用NBT顯色法測定[12]；過氧化氫酶(CAT)活性采用紫外吸收法測定[12]。

1.3 POD、SOD、CAT同工酶電泳

1.3.1酶液的制備 待種子處理第2、4、6、8天時(shí)分別稱取紫花苜蓿0.5 g，放入研缽中加入提前預(yù)冷的樣品提取液[含EDTA(乙二胺四乙酸)、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、pH 7.8磷酸緩沖液]5 mL，充分研磨，將研磨好的混合物進(jìn)行低溫高速離心(15000 r·min-1)15 min，保留上清液即為所需酶液，-20 ℃冰箱貯藏備用。

1.3.2聚丙烯酰胺凝膠電泳 1)樣品處理。將酶液與樣品處理液(蔗糖5 g+蒸餾水14.5 mL+0.1%溴酚藍(lán)0.5 mL)1∶1混合，搖勻后靜置備用。

2)聚丙烯酰胺凝膠電泳。采用垂直不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳，略做優(yōu)化[13-14]，用核黃素為聚合引發(fā)劑替代過硫酸銨，在光照條件下30 min，凝膠即聚合。POD和CAT同工酶分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.5%，SOD同工酶分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為3.75%。POD、SOD、CAT的上樣量分別為15、20、35 μL，在4 ℃下進(jìn)行電泳。濃縮膠時(shí)電壓為80 V，電流為30 mA, 分離膠時(shí)電壓為200 V，電流為45 mA，當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑移至前沿時(shí)，停止電泳。

3)POD、SOD、CAT同工酶染色。POD同工酶染色：采用改良聯(lián)苯胺法進(jìn)行染色[14-15]。染色液：聯(lián)苯胺溶液(0.8 g聯(lián)苯胺，6 mL冰醋酸，加熱至60 ℃溶解后加入34 mL蒸餾水)，4% NH4Cl溶液，5% EDTA-Na2溶液，0.3% H2O2溶液，蒸餾水，按1∶1∶1∶1∶8比例混合。將蒸餾水漂洗過的凝膠放入POD染色液中，震蕩5 min待酶帶顯出后，立即倒去染色液，用蒸餾水沖洗，7%醋酸中保存。

SOD同工酶染色：采用氮藍(lán)四唑(NBT)法[13]。電泳結(jié)束后取出膠片，將膠片浸泡于染色液2.45 mmol·L-1NBT中，黑暗下浸泡20 min，再放入0.036 mol·L-1(pH值7.8)磷酸緩沖液(含0.028 mol·L-1TMEDA，28 μmol·L-1核黃素)，避光浸泡20 min，蒸餾水漂洗，放入0.05 mol·L-1PBS (pH值7.8含0.1 mmol·L-1EDTA)，日光燈下光照10～15 min，直至出現(xiàn)透明譜帶，拍照。

CAT同工酶染色：參照胡能書等[13]的方法，用改良的FeCl3染色法。用重蒸水沖洗膠片1～2次，0.05% H2O2溶液浸泡10～15 min 后用重蒸水沖洗幾次，再加入染色液(含有1%的氯化鐵和1%的鐵氰化鉀)，直到顯帶為止，照相。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007軟件處理數(shù)據(jù)和繪圖，SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Photoshop軟件剪輯電泳圖，凝膠成像系統(tǒng)計(jì)算遷移率(Rf)。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源NO及反向調(diào)控PEG脅迫下紫花苜蓿種子萌發(fā)中POD活性及其同工酶動態(tài)的研究

如圖1所示，紫花苜蓿在萌發(fā)期POD活性呈逐漸上升趨勢，第4天時(shí)增長明顯，第6、8天增長趨于平緩。隨PEG脅迫時(shí)間的延長，PEG處理POD活性逐漸增高，而PEG+SNP處理較PEG處理POD活性先升高后降低，第6天時(shí)PEG+SNP處理較PEG處理POD活性降低了32.72%，差異顯著(P<0.05)。單獨(dú)添加NO清除劑c-PTIO在第4天時(shí)作用最明顯，c-PTIO比CK處理活性高了40.22%(P<0.05)；而PEG脅迫下添加 c-PTIO在第8天時(shí)才抑制內(nèi)源NO作用，PEG+c-PTIO處理較PEG相比POD活性提高了4.6%。圖2所示，紫花苜蓿POD同工酶譜帶在不同處理和處理時(shí)間上存在著明顯的差異，其活性大小在表達(dá)量上也體現(xiàn)出差異。POD同工酶酶譜中共檢測出11條酶帶，隨處理時(shí)間的延長POD酶帶增多，第2天時(shí)只誘導(dǎo)1條P4酶帶表達(dá)；第4天時(shí)酶帶增加為9條。隨處理時(shí)間延長酶帶表達(dá)加強(qiáng)，第6、8天酶帶顏色逐漸加深，表達(dá)量增多，活力明顯加強(qiáng)。在第8、14、20泳道為PEG處理，10、16、22為PEG+SNP處理，PEG+SNP比PEG處理?xiàng)l帶顏色淺。第6、8天分別有新酶帶P10和P11產(chǎn)生。POD同工酶活性變化與其抗氧化酶活性相對應(yīng)。

2.2 外源NO及反向調(diào)控PEG脅迫下紫花苜蓿種子萌發(fā)中SOD活性及其同工酶動態(tài)的研究

由圖3可知，紫花苜蓿在萌發(fā)期SOD活性呈現(xiàn)逐漸增長變化趨勢，在第4天時(shí)SOD活性增長明顯，第6、8天時(shí)增長趨于平緩。第4天時(shí)PEG+SNP處理較15% PEG處理SOD活性升高了10.48%。NO抑制劑c-PTIO在第4天時(shí)抑制NO作用最顯著， c-PTIO處理較CK相比SOD活性下降了16.71%(P<0.05)； PEG脅迫下添加c-PTIO較PEG相比，SOD活性下降了8.34%，但在整個(gè)處理中差異不顯著。由圖4可知，在整個(gè)處理過程中紫花苜蓿SOD同工酶譜帶呈現(xiàn)3條。遷移率為0.266的S3酶帶隨處理時(shí)間的延長顏色逐漸變淺直到消失。S1，S2酶帶無明顯變化，但顏色存在深淺差異，說明其酶活性表達(dá)量有差異。從電泳圖譜可以看出第8天酶帶表達(dá)量最弱，則表達(dá)量與處理時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，隨著處理時(shí)間的延長，表達(dá)量越來越少。

圖1 外源NO及反向調(diào)控對PEG脅迫下紫花苜蓿萌發(fā)期POD活性變化的影響Fig.1 Effect of exogenous NO and reverse regulation on changes of POD activity in alfalfa during germination period under PEG stress 相同處理天數(shù)不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。The different letters in the same treatment time mean significant differences at P<0.05, the same below.

圖2 外源NO及反向調(diào)控PEG脅迫下紫花苜蓿種子萌發(fā)過程中POD同工酶的電泳圖譜Fig.2 Effects of exogenous NO and reverse regulation on the POD isoenzyme electrophoresis atlas of alfalfa germinating seeds under PEG stress 泳道1～6：處理2 d；泳道7～12：處理4 d；泳道13～18：處理6 d；泳道19～24：處理8 d。1、7、13、19為CK(蒸餾水)處理；2、8、14、20為15%PEG處理；3、9、15、21為SNP處理；4、10、16、22為PEG+SNP處理；5、11、17、23為c-PTIO處理；6、12、18、24為PEG+c-PTIO處理。按相對遷移率由大到小，酶帶排序?yàn)镻1，P2，P3，P4，P5，P6，P7，P8，P9，P10，P11。Lane 1-6: Treatment 2 d; Lane 7-12: Treatment 4 d; Lane 13-18: Treatment 6 d; Lane 19-24: Treatment 8 d. 1, 7, 13, 19 for CK (distilled water) treatment; 2, 8, 14, 20 for 15% PEG treatment; 3, 9, 15, 21 for SNP treatment; 4, 10, 16, 22 for PEG+SNP treatment; 5, 11, 17, 23 for c-PTIO treatment; 6, 12, 18, 24 for PEG+c-PTIO treatment. According to the relative mobility from big to small, the enzyme bands were ranked as P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11.

圖3 外源NO及反向調(diào)控對干旱脅迫下紫花苜蓿萌發(fā)期SOD活性變化的影響Fig.3 Effect of exogenous NO and reverse regulation on changes of SOD activity in alfalfa during germination period under PEG stress

2.3 外源NO及反向調(diào)控PEG脅迫下紫花苜蓿種子萌發(fā)中CAT活性及其同工酶動態(tài)的研究

從圖5可以看出，紫花苜蓿在萌發(fā)期CAT活性隨PEG脅迫時(shí)間的延長呈現(xiàn)先增高后降低的變化趨勢，各處理在第4天時(shí)CAT活性迅速上升并分別達(dá)到最大值，且各處理間差異最顯著。第4天時(shí)PEG+SNP處理較PEG處理CAT活性增加了23.60%(P<0.05)。單獨(dú)添加c-PTIO在第8天時(shí)抑制內(nèi)源NO且較CK相比CAT活性降低了3.29%，但差異不顯著。第6天時(shí)，PEG+c-PTIO處理與PEG處理相比，CAT活性降低了23.19%(P<0.05)。圖6顯示，通過CAT同工酶活性染色得到了2條不同的CAT同工酶條帶，其相對遷移率分別為0.315和0.374。紫花苜蓿CAT同工酶在處理時(shí)間內(nèi)不誘導(dǎo)新酶帶產(chǎn)生，從第2天到第8天始終保持2條酶帶，即C1和C2。各處理間酶帶表達(dá)量基本相同。

圖4 外源NO及反向調(diào)控PEG脅迫下紫花苜蓿種子萌發(fā)過程中SOD同工酶的電泳圖譜Fig.4 Effects of exogenous NO and reverse regulation on the SOD isoenzymeelectrophoresis atlas of alfalfa germinating seeds under PEG stress 泳道1～6：處理2 d；泳道7～12：處理4 d；泳道13～18：處理6 d；泳道19～24：處理8 d。1、7、13、19為CK(蒸餾水)處理；2、8、14、20為15%PEG處理；3、9、15、21為SNP處理；4、10、16、22為PEG+SNP處理；5、11、17、23為c-PTIO處理；6、12、18、24為PEG+c-PTIO處理。按相對遷移率由大到小，酶帶排序?yàn)镾1，S2，S3。Lane 1-6: Treatment 2 d; Lane 7-12: Treatment 4 d; Lane 13-18: Treatment 6 d; Lane 19-24: Treatment 8 d. 1, 7, 13, 19 for CK (distilled water) treatment; 2, 8, 14, 20 for 15% PEG treatment; 3, 9, 15, 21 for SNP treatment; 4, 10, 16, 22 for PEG+SNP treatment; 5, 11, 17, 23 for c-PTIO treatment; 6, 12, 18, 24 for PEG+c-PTIO treatment. According to the relative mobility from big to small, the enzyme bands were ranked as S1, S2, S3.

圖5 外源NO及反向調(diào)控對PEG脅迫下紫花苜蓿萌發(fā)期CAT活性變化的影響Fig.5 Effect of exogenous NO and reverse regulation on changes of CAT activity in alfalfa during germination period under PEG stress

圖6 外源NO對PEG脅迫下紫花苜蓿萌發(fā)過程中CAT同工酶電泳圖譜Fig.6 Effects of exogenous NO and reverse regulation on the CAT isoenzyme electrophoresis atlas of alfalfa germinating seeds under PEG stress 泳道1～6：處理2 d；泳道7～12：處理4 d；泳道13～18：處理6 d；泳道19～24：處理8 d。1、7、13、19為CK(蒸餾水)處理；2、8、14、20為15%PEG處理；3、9、15、21為SNP處理；4、10、16、22為PEG+SNP處理；5、11、17、23為c-PTIO處理；6、12、18、24為PEG+c-PTIO處理。按相對遷移率由大到小，酶帶排序?yàn)镃1，C2。Lane 1-6: Treatment 2 d; Lane 7-12: Treatment 4 d; Lane 13-18: Treatment 6 d; Lane 19-24: Treatment 8 d. 1, 7, 13, 19 for CK (distilled water) treatment; 2, 8, 14, 20 for 15% PEG treatment; 3, 9, 15, 21 for SNP treatment; 4, 10, 16, 22 for PEG+SNP treatment; 5, 11, 17, 23 for c-PTIO treatment; 6, 12, 18, 24 for PEG+c-PTIO treatment. According to the relative mobility from big to small, the enzyme bands were ranked as C1, C2.

3 討論

3.1 外源NO及反向調(diào)控對PEG脅迫下紫花苜蓿萌發(fā)中種子抗氧化酶活性的影響

種子萌發(fā)期是植物生活史中的重要階段，也是進(jìn)行植物抗旱性研究的重要時(shí)期[16]。NO作為一種信號分子和活性氧清除劑，能調(diào)節(jié)植物對生物和非生物脅迫的適應(yīng)及反應(yīng)[17]。植物的保護(hù)酶體系在緩解脅迫方面起著重要作用，它可以清除體內(nèi)的活性氧，以避免過量活性氧對植物的傷害[18]。一般來講，干旱脅迫下植物體內(nèi)POD等酶的活性與植物抗氧化脅迫能力呈正相關(guān)。姜義寶等[19]研究發(fā)現(xiàn)，NO能明顯緩解干旱脅迫造成的氧化損傷,提高了苜蓿葉片葉綠素含量和光合能力，增強(qiáng)了苜蓿的抗旱性。本試驗(yàn)結(jié)果表明,外施SNP可提高抗氧化酶POD、SOD、CAT活性和緩解PEG脅迫下紫花苜蓿的氧化損傷。在干旱條件下外源添加0.1 mmol·L-1SNP時(shí)，紫花苜蓿的POD活性降低，第6天時(shí)最顯著；而SOD、CAT活性都表現(xiàn)為增加，在第4天時(shí)，SOD和CAT活性增加較顯著。NOS(nitric oxide synthase)和NR(nitrate reductase)是植物體內(nèi)源NO的最主要來源，但仍存在爭議[20]。為明確苜蓿根系內(nèi)源NO的來源和其對苜蓿根系耐旱性的影響，本試驗(yàn)用NO 特異清除劑c-PTIO處理紫花苜蓿種子。結(jié)果表明,在PEG脅迫下添加NO特異清除劑較PEG處理相比，可提高POD活性，降低了SOD及CAT活性，說明c-PTIO可抑制紫花苜蓿種子萌發(fā)的內(nèi)源NO。表明依賴于NOS活性或NR活性產(chǎn)生的內(nèi)源NO也參與干旱脅迫下苜蓿萌發(fā)耐旱性的調(diào)節(jié)。

3.2 外源NO及反向調(diào)控對PEG脅迫下紫花苜蓿萌發(fā)中種子抗氧化酶同工酶活性的影響

同工酶是具有催化相同的化學(xué)反應(yīng)，但其理化性質(zhì)、蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)等有明顯差異的一組酶。植物隨自身生長和外界環(huán)境的改變，同工酶譜帶會發(fā)生相應(yīng)的變化。逆境脅迫可導(dǎo)致抗氧化同工酶的改變[21]，本試驗(yàn)結(jié)果表明,PEG脅迫下紫花苜蓿種子萌發(fā)期的POD同工酶表達(dá)在譜帶數(shù)及表達(dá)量上都發(fā)生了明顯的變化，具體表現(xiàn)為處理第4天時(shí)酶帶明顯增多至9條，第6、8天仍有新酶帶產(chǎn)生，且隨著處理時(shí)間的延長POD酶帶表達(dá)量逐漸增多。PEG處理較PEG+SNP處理同工酶表達(dá)量多，這說明植物受到脅迫后酶組分及其活性發(fā)生改變以適應(yīng)不良環(huán)境，但由于防御措施的加強(qiáng)，最終導(dǎo)致POD酶帶數(shù)及其表達(dá)量相應(yīng)增加[22]。SOD在控制脂質(zhì)過氧化和防止膜系統(tǒng)受傷等方面有一定的保護(hù)作用，與植物的抗旱性有關(guān)[23]。PEG脅迫下不影響SOD同工酶帶數(shù)但影響其活性，隨著處理時(shí)間的延長，SOD同工酶S3表達(dá)量逐漸減弱，直到第8天時(shí)幾乎消失，這與莫饒等[24]的研究一致。栗淑媛等[25]的研究發(fā)現(xiàn)，CAT等抗氧化酶的同工酶表達(dá)與植物的脅迫適應(yīng)和進(jìn)化水平有密切的關(guān)系。不同的同工酶基因?qū)Σ煌潭饶婢趁{迫的表達(dá)響應(yīng)不同[26]。與酶活性變化對應(yīng)，紫花苜蓿CAT同工酶在PEG脅迫下表達(dá)量微弱，可能是由于干旱脅迫對紫花苜蓿萌發(fā)期CAT同工酶表達(dá)嚴(yán)重脅迫，無法通過CAT同工酶表達(dá)量增加來抵御，這與魯振強(qiáng)[27]的研究相一致。