大腸菌群測試菌片法在細菌性食物中毒快速檢測中的應用研究

廣東省肇慶市廣寧縣疾病預防控制中心（526300）朱素芬

大腸埃希菌是常見的條件致病菌，當出現(xiàn)腸屏障功能受損、抵抗能力受損時，容易出現(xiàn)菌群移位，引起機會感染，常引起切口感染、腸道感染、泌尿系統(tǒng)感染等疾病[1][2][3]。平皿培養(yǎng)法是進行細菌鑒定的“金標準”，但該方法耗費時間長，無法進行快速檢測，特別是在戶外，無法推廣[4]。測試片檢測技術操作簡單、速度快，在食品安全和食源性細菌性食物中毒污染指示中的應用前景越來越廣闊。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株及樣品來源 大腸菌群測試片，3M有限公司生產(chǎn)，大腸埃希氏菌標準株（ATCC25922）為中國普通微生物菌種保存中心提供，部分大腸埃希氏菌菌株為本實驗室分離和保存。以2016年1月～2017年5月，疾病控制中心獲得懷疑為細菌感染食源性疾病的對象食物與食具表面樣品174份，其中食物110例、食具64例。

1.2 方法

1.2.1 大腸艾希氏測試菌片法最低檢出限試驗 刮取大腸埃希氏菌標準株（ATCC25922）新鮮過夜培養(yǎng)的純菌苔，在生理鹽水中制備0.5麥氏單位的菌懸液，并10倍梯度稀釋至10-8稀釋度，分別取10-6、10-7、10-8的稀釋度菌懸液各1ml，分別采用平皿計數(shù)以及測試片法進行試驗，判斷最低檢出限。

1.2.2 實際樣本處理 對于懷疑為細菌性食物中毒疫情，參照食物中毒診斷標準及技術處理總則中《食品安全事故流行病學調(diào)查技術指南》（2012年版）（以下簡稱《指南》）推薦的樣品采集方法[5]，無菌操作采集食品和食具涂抹拭子，2℃～8℃條件下2h內(nèi)送至實驗室進行預處理，用PBS緩沖液處理制備成為懸液，-80℃冰箱保存。

1.2.3 大腸艾希氏測試菌片法在實際樣本中的應用 25g樣品放入225ml生理鹽水中制備1：10樣品稀釋液，取10-2、10-3稀釋液接種2個平皿，澆注VRBA瓊脂，36℃培養(yǎng)18-24后計數(shù)。挑取10個不同類型的菌落移植BGLB肉湯，36℃培養(yǎng)48h，排除陽性桿菌，計算樣本大腸菌群數(shù)。同步將10-2、10-3稀釋液接種到測試片上，每個稀釋度做兩個平行，36℃培養(yǎng)24h，計算平行測試片菌落數(shù)，取均值，將菌落接種到營養(yǎng)瓊脂平板，革蘭染色鏡檢，送全自動分析系統(tǒng)鑒定。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計學計算，最低檢出限服從正態(tài)分布的采用（Mena±SD）符號（±s）表示，組間比較采用t檢驗，敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值、符合率采用百分比表示，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大腸艾希氏測試菌片法 測試片法10-6、10-7稀釋度條件下的最低檢出限低于平皿計數(shù)法，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見附表。

2.2 大腸艾希氏測試菌片法在實際樣本中的應用結果 在174份細菌性食物中毒采集的樣本中，采用平板計數(shù)法檢出大腸菌群陽性的有103份，結果陰性的有71例。而大腸艾希氏測試菌片法對實際樣本應用的敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值、符合率分別為99.03%（102/103）、92.96%（66/71）、95.32%（102/107）、98.51%（66/67）、96.55%（168/174）。

附表 平皿計數(shù)法、測試片法不同稀釋度條件下最低檢出限對比[(±s),cfu/m]

附表 平皿計數(shù)法、測試片法不同稀釋度條件下最低檢出限對比[(±s),cfu/m]

注：與平皿計數(shù)法相比，*P＜0.05。

方法 10-6 10-7 10-8平皿計數(shù)法 45.0±3.4 11.0±2.2 1.0±0.7測試片法 42.4±2.6* 9.5±1.5* 1.0±0.5

3 討論

測試片法特異性強，試劑對其他細菌的抑制效果較好，不顯色，對大腸菌群的下限可達到1cfu/ml，即使是無菌體液，也可能會檢出陽性，可能與實驗室污染、未感染的樣本[6]。從檢出的效率來看，測試片法敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值、符合率分別為99.03%、92.96%、95.32%、98.51%、96.55%，均在92%以上，達到較高水平，誤漏診主要與標本處理不合格、菌液濃度差異有關有關。測試片法當前不僅僅用于糞便污染指示重要工具，還可進行菌群失調(diào)狀態(tài)分析，從而判斷腸道生態(tài)環(huán)境。一般而言，腸道菌群紊亂與感染、腸黏膜屏障功能障礙、抗生素應用等因素有關。測試片不僅速度快，還能夠省去培養(yǎng)基、殺菌消毒等繁瑣的工作，這對于工作任務比較重的實驗室而言，具有重要意義，可提高樣品檢驗工作效率，縮短檢驗前的停留時間，縮短診斷的流程，為疫情處置和臨床治療提供的及時病原學依據(jù)[7][8]。

測試片法可以避免平皿培養(yǎng)過程中污染所致檢驗差錯，在細菌感染中的診斷價值較高，提高抗生素合理應用水平。當然，需注意的是，不同廠商制造的測試片其質(zhì)量可能存在一定的差異，從而影響檢驗的精度、效率，實驗室自身還需要做好測試片的保存管理。

測試片法在細菌檢測中的檢出限度更低，同時診斷效率與平板計數(shù)法相近，適合食源性疾病病原菌的分析。