分離純化胰島細(xì)胞超薄切片的瓊脂預(yù)包埋制備方法

首都醫(yī)科大學(xué)（100069）金良韻 姬曼 孫竹林

利用電子顯微鏡對樣品進(jìn)行觀察和研究，不僅要有先進(jìn)精密的儀器，更要有制備樣品所需的各種技術(shù)技巧[1]。由于胰島細(xì)胞體積小，分布分散，給電鏡取材造成了困難；而在人類胰島細(xì)胞數(shù)量龐大，僅占胰腺總體積的1%～2%，如常規(guī)電鏡取材則費(fèi)時(shí)費(fèi)力。本研究采用了膠原酶Ⅺ灌注法對小鼠進(jìn)行取材，避免了取不到胰島細(xì)胞的尷尬。同時(shí)采用瓊脂預(yù)包埋的方法，該方法對樣品進(jìn)行多次離心沉淀不會損傷樣品超微結(jié)構(gòu)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康C57/6J雄性小鼠

1.2 主要儀器設(shè)備與試劑 ①超薄切片機(jī)（leica UC7）,透射電鏡(HITACHI HT7700)。②戊二醛、鋨酸、乙醇、丙酮、Epon812、醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛，均購自美國EMS（Electron microscopy science）公司。瓊脂糖為美國Sigma公司產(chǎn)品。膠原酶Ⅺ(#C7657)為美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 分離、純化胰島細(xì)胞團(tuán) 將小鼠麻醉，打開腹腔充分暴露十二指腸及周邊胰腺，探查膽總管，用動脈夾夾閉靠近十二指腸的乳頭處，經(jīng)膽總管注射2.5mL膠原酶Ⅺ溶液，可見膠原酶沿胰尾順序充盈，再將其胰尾及其他部分完整摘取，放入50mL離心管中，38℃水浴箱消化10min，加入遇冷HBSS緩沖液至40mL停止消化，1400rpm離心1min，棄掉上清液，重復(fù)離心3次。加入4℃ Histopaque1077 7mL重懸，再沿離心管管壁緩慢加入4℃DMEM培養(yǎng)基7mL，可見離心管內(nèi)液體分液，2000rpm，離心10min。并緩慢吸出兩液間的胰島移至含有6mLHBSS的細(xì)胞培養(yǎng)皿（60mm）中。在體式顯微鏡下，用移液槍挑取完整胰島，將挑取出來的胰島放入另一個(gè)含有6mLHBSS的細(xì)胞培養(yǎng)皿（60mm）中，手動挑取重懸胰島3次。

1.3.2 戊二醛預(yù)固定 在培養(yǎng)皿中加入預(yù)冷的4℃戊二醛3～5mL，固定10min，再將液體移至離心管中，離心1500rmp，10min，棄掉上清，重復(fù)加入預(yù)冷的戊二醛，放入4℃冰箱固定2h。后去掉上清液，加入0.1MPB緩沖液洗3次，每次10min。待后續(xù)包埋。

1.3.3 瓊脂預(yù)包埋 用0.1MPB緩沖液配制瓊脂，將其配成2%瓊脂溶液，用酒精燈加熱至瓊脂完全溶解，待瓊脂溶液溫度降到43℃，仍然保持溶液狀態(tài)。將胰島細(xì)胞離心（1500rpm，5min），吸出離心管中的PB緩沖液，僅留少量緩沖液浸過胰島細(xì)胞，待瓊脂溶液溫度降至43℃，向胰島細(xì)胞離心管中快速加入適量液態(tài)的2%瓊脂溶液，再加入適量PB，迅速離心（1500rpm，3～5min），胰島細(xì)胞呈團(tuán)狀同瓊脂塊一同沉于離心管底，放入4℃冰箱中凝固。

1.3.4 鋨酸后固定 用1%鋨酸對其進(jìn)行后固定，時(shí)間以不超過2h為宜。固定后樣品組織呈黑色，將帶有胰島細(xì)胞的塊狀瓊脂取出，并向其修整為1mm3的小塊，再放入試管中繼續(xù)后續(xù)步驟。雙蒸水對細(xì)胞清洗3次，每次10min。

1.3.5 脫水、置換、滲透及包埋 分別對其進(jìn)行50%、70%、90%、100%酒精脫水，每次10min；環(huán)氧丙烷置換2次，每次15min；Epon812樹脂低純度（1∶1）滲透40min室溫，中純度（1∶3）滲透40min室溫，純樹脂滲透40min室溫。包埋聚合35℃5h，60℃5h，70℃9h。

1.3.6 超薄切片 將聚合完成的樹脂塊在leica UC7徠卡切片機(jī)上切成70nm厚度的超薄切片。撈至100目的銅網(wǎng)，待紅外線烘干后，醋酸雙氧鈾染色20min，檸檬酸鉛染色2min，蒸餾水沖洗后于透射電鏡(HITACHI HT7700)下觀察。

2 結(jié)果

超薄電鏡下（透射電鏡HT7700）觀察胰島細(xì)胞，核為圓形，核膜清晰完整，核周間隙正常，胞質(zhì)內(nèi)可見結(jié)構(gòu)清晰的線粒體、核糖體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器，另可見較多的內(nèi)分泌顆粒，多數(shù)為胰島B細(xì)胞的分泌顆粒，內(nèi)部為胰島素，少數(shù)為其他類型的內(nèi)分泌顆粒，均獲得結(jié)構(gòu)清晰完整的胰島細(xì)胞。

附圖1、附圖2 小鼠胰腺細(xì)胞。可見細(xì)胞膜界限清晰、細(xì)胞核完整、胞漿內(nèi)見大量內(nèi)分泌顆粒。透射電鏡×2000倍、×2500倍。

附圖3、附圖4 小鼠胰腺細(xì)胞。細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)清晰、可見細(xì)胞膜間連接，胞漿內(nèi)見大量內(nèi)分泌顆粒和線粒體。透射電鏡×3000倍、×4000倍。

3 討論

要想獲得最終完美的電鏡圖像，每一個(gè)步驟都會是其影響因素，因此在制作過程中不能放過任何一個(gè)細(xì)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)的取材采取了膠原酶Ⅺ灌注法，并用瓊脂預(yù)包埋的方法，成功地得到了小鼠胰島細(xì)胞的透射電鏡樣品，獲得了良好的超微結(jié)構(gòu)。張旭東等[2]利用直接取材法也成功得到了胰島細(xì)胞的超薄切片，但本實(shí)驗(yàn)方法的優(yōu)點(diǎn)在于：①制成樹脂包埋塊以后無需半薄定位，直接超薄切片，避免反復(fù)定位，更快速，省去時(shí)間成本。②直接取材的方法，經(jīng)常定位不準(zhǔn)確，取不到有效區(qū)域，則需要重新取樣，反而費(fèi)時(shí)費(fèi)力。而本實(shí)驗(yàn)可以做到精準(zhǔn)取材，高速有效，能夠在有限的觀察視野下，看到更多的胰島細(xì)胞。而后利用瓊脂預(yù)包埋法，把相對松散又細(xì)小的胰島細(xì)胞集中在一起，更加提高了超薄切片上的有效區(qū)域，有利于實(shí)驗(yàn)人員更為全面地觀察和判斷胰島細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵不是瓊脂的濃度，而是瓊脂低熔點(diǎn)的特性，在高溫煮沸瓊脂后將溫度降至40℃時(shí)，瓊脂仍然為液體狀態(tài)，加入后與胰島細(xì)胞混合，離心，待溫度降到40℃以下時(shí)則瓊脂凝固，此時(shí)胰島細(xì)胞已經(jīng)離心、團(tuán)聚至瓊脂最下方。此外，瓊脂的低熔點(diǎn)也避免了細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)受損。除了瓊脂低熔點(diǎn)的特性以外，膠原酶Ⅺ的濃度和時(shí)間也是決定獲取胰島細(xì)胞多與少的關(guān)鍵因素：如若濃度過低或時(shí)間過短，會使胰島尚未完全分離，而外分泌腺則會混入其中；若濃度過高或時(shí)間過長，則會破壞胰島包膜，消化過度。

本實(shí)驗(yàn)方法中需要注意的細(xì)節(jié)有：①鋨酸進(jìn)行后固定以后，帶有瓊脂的胰島細(xì)胞會顯色，被氧化成黑色，需要修掉多余的瓊脂塊，最后留少量瓊脂，以便后續(xù)的脫水和滲透。如果瓊脂濃度過高也不利于脫水和滲透。②將瓊脂加入到胰島細(xì)胞時(shí)的溫度：溫度過高容易燙損細(xì)胞，溫度過低容易使瓊脂凝固，無法離心沉淀。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過膠原酶Ⅺ灌注的方法取材，后經(jīng)利用低熔點(diǎn)瓊脂預(yù)包埋，成功制備出胰島細(xì)胞的超薄切片，可有效獲得數(shù)量較多的并且超微結(jié)構(gòu)不受損傷的胰島細(xì)胞結(jié)構(gòu)。在利用膠原酶Ⅺ灌注取材的時(shí)候會相對比直接取材相對更費(fèi)事，但是這種方法可以在制樣后段有效地提高工作效率，并對胰島調(diào)節(jié)血糖的機(jī)制提供了可靠而有效的方法。