白云參多糖含量測定

云南云河藥業(yè)股份有限公司，云南 個舊 661000

白云參為桔梗科金錢豹屬植物大花金錢豹(CampanumoeajavanicaBl. subsp．Javanica) ，又名土黨參，主產于云南西部、西南部。本品性甘，平，補中益氣、潤肺生津。主治病后體虛、肺結核、多汗、虛咳、神經衰弱、食欲不振、久瀉、產后乳汁不下[1-3]。該藥材是云南省彝藥、苗藥常用地方中草藥之一。多糖是白云參有效成分之一，具有抗衰老、抗氧化、抗疲勞、增強免疫功能等作用[4-6]，具有較好研究應用價值。但是，目前白云參多糖的測定方法研究較少。多糖的測定方法主要有硫酸蒽酮法、硫酸苯酚法、3，5-二硝基水楊酸法等等[7-10]。筆者采用硫酸-蒽酮法測定白云參多糖，以便為白云參質量標準的提高和藥材中多糖的深入研究和綜合利用提供一定依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 UV-2401PC紫外分光光度計(SHIMADZU)；DZF-6030A型真空干燥箱(上海恒科學儀器有限公司)；MJ-600超聲波發(fā)生器(無錫市美極超聲設備有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(鞏儀市予華儀器有限責任公司)；FA1604電子天平(上海天平儀器廠)。

1.2 試劑和樣品 蒽酮(批號：20170420，國藥集團化學試劑有限公司)；濃硫酸(批號：20160501，重慶川東化工(集團)有限公司)；D(+)葡萄糖(批號：B21882，上海源葉生物科技有限公司)；白云參(鴻翔中藥科技有限公司)。

2 方法與結果

2.1 葡萄糖標準溶液制備 稱取105 ℃干燥至恒重的D(+)葡萄糖10.00 mg，用蒸餾水溶解并定容于100 mL 容量瓶中，混合搖勻，即葡萄糖標準溶液濃度為0.1 mg/mL。

2.2 硫酸-蒽酮溶液(2 g/L)的配制 稱取蒽酮0.5 g，用濃硫酸溶解并定容于250 ml容量瓶中，混合均勻。

2.3 樣品溶液制備

2.3.1 白云參多糖提取與精制 準確稱取干燥的白云參粉末400 g，加80%乙醇3100 mL，超聲波提取2次，每次1 h，過濾。藥渣中加入3000 mL純化水，超聲波提取2次，每次1 h，合并提取液，濾過，濾液減壓濃縮至相對密度為1.15 g/mL的清膏，加乙醇使含醇量為85%，冷藏48 h，過濾，沉淀用純化水溶解，加0.6%活性炭攪拌30 min，過濾，濾液加乙醇使含醇量為85%，冷藏36 h，過濾，沉淀在60 ℃條件下真空干燥，即得到白云參粗多糖。

2.3.2 白云參多糖溶液的配制 稱取10.10 mg白云參粗多糖，加蒸餾水溶解定容至250 mL。

2.4 測定波長 分別精密量取葡萄糖標準使用液、樣品溶液各2.0 mL，加8.0 mL硫酸-蒽酮液，在沸水浴中加熱15 min，用紫外-可見分光光度計于200～700 nm 波長范圍內掃描。對照品和供試樣品溶液顯色后均在589 nm 處有最大吸收。因此，實驗時將589 nm 確定為測定波長。

2.5 硫酸-蒽酮溶液用量試驗 分別吸取供試樣品溶液 2.0 mL于試管中，分別加入硫酸-蒽酮溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mL，搖勻，在沸水浴中加熱15 min，用自來水冷卻至室溫，加濃硫酸稀釋至14.0 mL，在589 nm處測其吸光度。由圖1 可知，隨著硫酸-蒽酮溶液量增加，相應的吸光度值也隨之增加，當加入量達到8.0 mL 以后，溶液吸光度變化趨勢變緩。因此，實驗時顯色劑硫酸-蒽酮溶液用量選擇8.0 mL 。

2.6 加熱時間的確定 分別吸取供試樣品溶液 2.0 mL 于比色管中，按2.5確定的量加入硫酸-蒽酮溶液，搖勻，在沸水浴中加熱10、15、 20、25、30、35 min，用自來水冷卻至室溫，在589 nm處測其吸光度。由圖2可知，隨著加熱顯色時間的增加，白云參多糖溶液吸光度值先增加后減小，在加熱時間為15 min時，溶液的吸光度值最大。因此，將實驗加熱顯色時間確定為15 min 。

2.7 標準曲線的繪制 精密吸取葡萄糖標準溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mL ，分別加蒸餾水至2.0 mL，搖勻。加8.0 mL硫酸-蒽酮液，在沸水浴中加熱顯色15 min；以 2.0 mL 蒸餾水代替葡萄糖標準溶液，顯色后作為空白。分別在589nm處測其吸光度。以葡萄糖質量濃度(C)為橫坐標，相應的吸光度(A)為縱坐標，繪制吸光度-葡萄糖質量濃度的關系曲線圖，回歸方程式為Y=9.8159X+0.037，r=0.9999。實驗結果表明，葡萄糖質量濃度在0.0201～0.1005 mg/mL 范圍內線性關系良好，標準曲線如圖 3 所示。

2.8 方法學考察

2.8.1 精密度試驗 分別吸取6份供試樣品溶液 2.0 mL，按照標準曲線制備方法測定吸光度。結果，吸光度的平均值是0.257，RSD= 1.21%。實驗結果表明該方法的精密度良好。

2.8.2 穩(wěn)定性試驗 精密量取白云參多糖溶液 2.0 mL，按照標準曲線制備方法測定吸光度，在60 min內每間隔10 min測定吸光度，RSD=1.26%。結果表明試樣溶液在60 min內穩(wěn)定。

2.8.3 重復性試驗 精密稱取同一批次白云參粗多糖10.00mg，共6份，按照所確定條件進行平行實驗，在589nm處測定吸光度，計算白云參多糖的含量。實驗結果顯示，多糖的平均含量是578mg/g，RSD=1.16%，表明該方法重復性良好。

2.8.4 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的白云參多糖(含量：578 mg/g)6份，每份約5 mg，分別加入葡萄糖標準品溶液30 mL于100 mL容量瓶，按照標準曲線制備方法處理，在589 nm處測定吸光度，計算回收率。結果測得的平均回收率為99.85%，RSD=0.46 %，表明實驗方法的系統(tǒng)誤差較小，準確度較高。見表1。

表1 加樣回收率試驗結果

3 討論

3.1 顯色方法選擇 硫酸蒽酮法與硫酸苯酚法測多糖原理基本相似，均是多糖在強酸性條件下水解生成單糖，繼續(xù)脫水成糠醛或者糠醛類衍生物，與相應的顯色劑顯色。硫酸苯酚法進行穩(wěn)定試驗時，數據變化較大，穩(wěn)定性稍差；另外苯酚在空氣中極易氧化成淡黃色物質，在測定過程中需要避光和迅速操作。因此，本實驗選用硫酸蒽酮法作為白云參多糖測定方法。

3.2 對照品選擇 在進行測定對照品選擇時，分別選用葡萄糖、葡聚糖與硫酸蒽酮溶液顯色后，進行全波長范圍掃描，兩種樣品均在589 nm 處有最大吸收。但是，葡聚糖有多種分子量類型產品，其與硫酸蒽酮溶液顯色是否存在差異還需要進一步驗證。因此，本實驗選用葡萄糖作為對照品。

多糖類成分在藥用植物中分布廣泛，具有多種活性，白云參中含有大量的多糖類成分，但是有關白云參多糖含量測定方法的報道極少。所以，本研究以葡萄糖為對照品，硫酸蒽酮溶液為顯色劑，用紫外分光光度法測定白云參多糖含量，并進行方法學考察。實驗結果表明，該方法操作簡單，結果準確，且重現性好，可在一般實驗條件下進行白云參多糖含量測定，符合常規(guī)實驗要求，為白云參多糖類化合物開發(fā)利用提供一定的科學依據。