廣西凡納濱對(duì)蝦源副溶血弧菌耐藥性和耐藥基因的檢測(cè)

黃偉德，肖雙燕，黎姍梅，黃德生，張振豪，鐘昌艷，陳福彩，梁 毅，梁靜真*，黃 鈞*

(1. 廣西水生動(dòng)物病害診斷實(shí)驗(yàn)室, 廣西 南寧 530005；2. 欽州市水產(chǎn)技術(shù)推廣站, 廣西 欽州 535000；3. 廣西大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 廣西 南寧 530005；4. 廣西水產(chǎn)技術(shù)推廣總站, 廣西 南寧 530022；5. 北海市合浦縣水產(chǎn)技術(shù)推廣站, 廣西 北海 536100；6. 防城港市港口區(qū)漁業(yè)技術(shù)推廣站, 廣西 防城港 538002；7. 欽州市欽南區(qū)水產(chǎn)技術(shù)推廣站，廣西 欽州 535000；8. 東興市漁業(yè)技術(shù)推廣站，廣西 東興 538100)

【研究意義】凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)又稱南美白對(duì)蝦，具有出肉率高、營(yíng)養(yǎng)需求低、生長(zhǎng)迅速、適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。從1996年引進(jìn)廣西后，一直是廣西沿海重要的對(duì)蝦養(yǎng)殖品種。而近年來(lái)細(xì)菌性疾病常給廣大養(yǎng)殖戶造成巨大的損失，已成為制約廣西凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展的重要因素。副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)為革蘭氏陰性菌，主要分布于淡咸水交界處、沿海以及魚(yú)蝦貝類等多種水產(chǎn)動(dòng)物中，能引起對(duì)蝦的爛鰓病、紅體病、早期死亡綜合征等多種疾病，是限制我國(guó)海水對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要病原菌之一[1-3]。目前對(duì)弧菌病主要以抗生素進(jìn)行治療。但隨著抗生素的大量使用，副溶血弧菌耐藥問(wèn)題日漸突出，必需引起養(yǎng)殖及疾病防治工作者的高度重視。此外，副溶血弧菌還是夏秋季節(jié)沿海地區(qū)食物中毒和急性腹瀉的主要病原菌[4]?？梢?jiàn)副溶血弧菌病的流行不僅嚴(yán)重影響凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，還對(duì)人類健康與食品安全造成很大威脅。因此，深入探討副溶血弧菌的耐藥性及其機(jī)制，無(wú)論是對(duì)凡納濱對(duì)蝦弧菌病防控提供指導(dǎo)還是對(duì)人類的公共健康都顯得非常迫切?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】有關(guān)副溶血弧菌的耐藥性研究目前已有不少報(bào)道，如Oh等[5]和Yutaka等[6]分別對(duì)韓國(guó)魚(yú)源和泰國(guó)蝦源副溶血弧菌的耐藥性進(jìn)行了研究；國(guó)內(nèi)眾多學(xué)者也先后對(duì)浙江[7]、江蘇[8]、福建和海南[9]等地水產(chǎn)品源副溶血弧菌的耐藥表型進(jìn)行了研究，并發(fā)現(xiàn)部分菌株在一定程度上產(chǎn)生了多重耐藥性。Ceccarelli等[10]認(rèn)為，副溶血弧菌多重耐藥的形成與耐藥基因隨可移動(dòng)遺傳元件(如整合子、轉(zhuǎn)座子、質(zhì)粒等)在菌株間的水平傳播密切相關(guān)。目前已知，磺胺類耐藥基因Sul1位于I型整合子的3'末端，而整合子通常存在于可移動(dòng)的質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子上；ant(3")-I位于質(zhì)?；蛘献拥幕蚝猩辖閷?dǎo)氨基糖苷類的耐藥[11]；TEM是革蘭氏陰性菌最常見(jiàn)的β-內(nèi)酰胺類耐藥基因，由質(zhì)粒編碼[12]；tet(A)為革蘭氏陰性菌最主要的四環(huán)素類耐藥基因，通常位于轉(zhuǎn)座子或質(zhì)粒上[13]。關(guān)于水產(chǎn)動(dòng)物源副溶血弧菌的耐藥基因，Yutaka等[6]檢測(cè)了泰國(guó)蝦源副溶血弧菌β-內(nèi)酰胺類和四環(huán)素類耐藥基因的攜帶情況，婁陽(yáng)等[14]分析了上海水產(chǎn)品源副溶血弧菌β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、氯霉素類、氨基糖苷類耐藥基因的分布?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】副溶血弧菌的耐藥性和耐藥機(jī)制日益受到人們的重視。但目前副溶血弧菌耐藥性研究主要集中于耐藥表型，有關(guān)病原菌耐藥表型與耐藥基因型相關(guān)性以及廣西對(duì)蝦源副溶血弧菌耐藥基因的研究報(bào)道仍屬鮮見(jiàn)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】對(duì)分離自廣西沿海養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦的30株副溶血弧菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，并檢測(cè)4種不同類別耐藥基因的攜帶情況，分析對(duì)蝦源副溶血弧菌耐藥表型與耐藥基因之間的相關(guān)性，為凡納濱對(duì)蝦弧菌病防控提供科學(xué)指導(dǎo)，為副溶血弧菌耐藥機(jī)制的深入研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

試驗(yàn)菌株為2014-2016年廣西水生動(dòng)物病害診斷實(shí)驗(yàn)室于廣西欽州市、防城港市和北海市從凡納濱對(duì)蝦肝胰腺分離并鑒定保存的30株副溶血弧菌。其中，來(lái)自欽州市14株，防城港市9株，北海市7株(表1)。

表1 株來(lái)源信息

1.2 主要試劑

PCR擴(kuò)增引物由生工生物工程技術(shù)服務(wù)(上海)有限公司合成。PCR緩沖液、dNTPs、Taq聚合酶、MgCl2、ddH2O均購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司。瓊脂糖購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。引物設(shè)計(jì)參考Bryan等[15]，序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度見(jiàn)表2。

12種藥敏片均購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司，包括β-內(nèi)酰胺類：青霉素G(PG，10 μg/片)、氨芐青霉素(AMP，10 μg/片)；四環(huán)素類：多西環(huán)素(DOX，30 μg/片)；氯霉素類：氟苯尼考(FFC，30 μg/片)；氨基糖苷類：新霉素(NEO，30 μg/片)、鏈霉素(STR，10 μg/片)、慶大霉素(GEN，10 μg/片)；喹諾酮類：恩諾沙星(ENR，30 μg/片)、環(huán)丙沙星(CLX，5 μg/片)；磺胺類：復(fù)方磺胺嘧啶(SDM，25 μg/片)、磺胺二甲嘧啶(SMD，25 μg/片)；大環(huán)內(nèi)酯類：紅霉素(ERY，15 μg/片)。所有試驗(yàn)用藥敏片均保存于4 ℃冰箱備用。

表2 4種耐藥基因PCR擴(kuò)增引物序列

表3 4種耐藥基因的PCR反應(yīng)條件

1.3 藥敏試驗(yàn)

采用Kirby-Bauer(K-B)紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)。參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)抗生素敏感試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，將每種抗生素的藥敏結(jié)果用S(敏感)、I(中介)、R(耐藥)進(jìn)行記錄。

1.4 耐藥基因的PCR檢測(cè)

按試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)菌基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?種耐藥基因的PCR反應(yīng)條件見(jiàn)表3。反應(yīng)體系(25 μl)：PCR緩沖液2.5 μl，dNTPs 0.5 μl，MgC122.5 μl，上下游引物各1 μl，Taq聚合酶0.3 μl，DNA模板3 μl，ddH2O補(bǔ)足余量。擴(kuò)增條件[15]見(jiàn)表3。PCR反應(yīng)結(jié)束后以1.0 %瓊脂糖凝膠在100 V電壓下電泳35 min，凝膠成像分析系統(tǒng)(北京六一，WD-9413B)觀察電泳結(jié)果。PCR產(chǎn)物由生工生物工程技術(shù)服務(wù)(上海)有限公司測(cè)序。采用ClustalX及DNAstar軟件進(jìn)行核苷酸序列一致性分析以及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建。

對(duì)未出現(xiàn)預(yù)期條帶的菌株，退火溫度以上述各溫度為中心溫度，±5 ℃再做梯度PCR并調(diào)試其他條件，反復(fù)試驗(yàn)仍無(wú)預(yù)期條帶出現(xiàn)者視為所檢測(cè)基因檢測(cè)結(jié)果陰性。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

耐藥表型與耐藥基因的符合率計(jì)算公式：

符合率(%)=攜帶耐藥基因并具有相應(yīng)耐藥表型菌株數(shù)÷具有相應(yīng)耐藥表型菌株總數(shù)。

使用SPSS 18.0中Fisher’s exact test進(jìn)行菌株耐藥表型和耐藥基因的相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 副溶血弧菌藥物敏感性

檢測(cè)的副溶血弧菌對(duì)12種抗生素存在不同程度的多重耐藥現(xiàn)象(表4)，其中，6重耐藥1株(3.3 %)，5重耐藥3株(10.0 %)，4重耐藥10株(33.3 %)，3重耐藥13株(43.3 %)。30株副溶血弧菌的優(yōu)勢(shì)耐藥譜是SDM/SMD/PG/AMP和SMD/PG/AMP，所含菌株數(shù)分別占被檢菌株數(shù)的23.3 %和20.0 %，其余依次為DOX/SDM/SMD/PG/AMP、SDM/SMD/PG、DOX/SMD/PG、SMD/PG(各占6.7 %)，PG/AMP/ERY、SMD、STR/SMD/PG、STR/SMD/PG/AMP、SMD/PG/CLX、GEM/SMD/PG/AMP、GEN/SDM/SMD/PG/AMP、GEN/DOX/SDM/SMD/PG/AMP、DOX/SMD/PG/AMP(各占3.3 %)。

表4 30株副溶血弧菌菌株的藥物敏感性

續(xù)表4 Continued table 4

菌株Strain氨基糖苷類Aminoglycoside四環(huán)素類Tetracycline磺胺類Sulfanilamideβ-內(nèi)酰胺類β-lactam氯霉素類Chloram-phenicol喹諾酮類Quinolone大環(huán)內(nèi)酯類Macrolide新霉素Neomycin鏈霉素Streptomycin慶大霉素Genta-mycin多西環(huán)素Doxyc-ycline復(fù)方磺胺嘧啶Sulfadiazine磺胺二甲嘧啶Sulfadimidine青霉素Penicillin G氨芐青霉素Ampicillin氟苯尼考Florfenicol恩諾沙星Enrofloxacin環(huán)丙沙星Ciprofloxacin紅霉素ErythromycinQZ08SSSSIRRRSSSSQZ09SISSIRRRSSSSQZ10ISSSRRRISSSSQZ11SSSSIRRRSSSSQZ12ISIRIRRSSSSSQZ13SSSSIRIISSSSQZ14SSSRRRRRSSSSFCG01SSSSIRRRSSSSFCG02SSSSRRRRSSSSFCG03SSSRIRRRSSSSFCG04SSSRIRRISSSSFCG05ISRSIRRRSIISFCG06IRSIIRRRSSSSFCG07SRSIIRRISSSSFCG08SSSSIRRISSSSFCG09SSSSIRRRSSSSBH01SSISIRRSSSSIBH02SSISIRRISSRSBH03ISRIRRRRIIIIBH04ISRRRRRRSSSSBH05SSSSRRRRSISIBH06SSISRRRRSSSIBH07SSSSRRRISSSS

PG：青霉素；G；AMP：氨芐青霉素；SDM：復(fù)方磺胺嘧啶；SMD：磺胺二甲嘧啶；DOX：多西環(huán)素；ERY：紅霉素；FFC：氟苯尼考；NEO：新霉素；STR：鏈霉素；GEN：慶大霉素；ENR：恩諾沙星；CLX：環(huán)丙沙星PG:Penicillin G; AMP:Ampicillin; SDM:Sulfadiazine; SMD:Sulfadimidine; DOX:Doxycycline; ERY:Erythromycin; FFC:Florfenicol; NEO:Neomycin; STR:Streptomycin; GEN:Gentamycin; ENR:Enrofloxacin; CLX:Ciprofloxacin圖1 副溶血弧菌菌株對(duì)抗生素的耐藥情況比較Fig.1 Comparison of resistant situation of Vibrio parahaemolyticus strains against antibiotics

M為100 bp DNA ladder，N為陰性對(duì)照;1～9為被檢測(cè)的部分菌株M indicates the 100 bp DNA ladder, N indicates the negative control; Lane 1-9 indicate some strains detected圖2 部分菌株4種耐藥基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results of four kinds of antibiotics resistance genes in some strains

30株副溶血弧菌對(duì)12種抗生素的耐藥程度也不同(圖1)，對(duì)β-內(nèi)酰胺類和磺胺類抗生素的耐藥性相對(duì)較高，對(duì)青霉素G、氨芐青霉素的耐藥率分別為96.7 %和70.0 %，對(duì)磺胺二甲嘧啶、復(fù)方磺胺嘧啶的耐藥率分別為96.7 %和43.3 %，遠(yuǎn)超過(guò)其他類抗生素的耐藥率。所有菌株對(duì)新霉素、氟苯尼考、恩諾沙星均為敏感或中介；其中，對(duì)氟苯尼考的敏感率最高，達(dá)96.7 %，對(duì)新霉素、鏈霉素、慶大霉素、多西環(huán)素、恩諾沙星、環(huán)丙沙星和紅霉素的敏感率為70.0 %～90.0 %。

2.2 副溶血弧菌的耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

以30株副溶血弧菌的總DNA為模板，采用PCR方法擴(kuò)增4種耐藥基因。4種耐藥基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖2。部分受試菌株能擴(kuò)增出大小約為284 bp的ant(3")-I基因、408 bp的Sul1基因和800 bp的TEM基因片段，與預(yù)期產(chǎn)物大小相符。將陽(yáng)性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并將所得序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的相應(yīng)基因序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，PCR陽(yáng)性樣品測(cè)序片段與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的對(duì)應(yīng)基因序列相似性高。經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，均未擴(kuò)增出tet(A)目的條帶，表明所有供試菌株均不攜帶tet(A)基因。

根據(jù)檢測(cè)結(jié)果(表5)，30株受試菌株的ant(3")-I、Sul1、tet(A)、TEM基因的檢出率分別為6.7 %(2/30)、43.3 %(13/30)、0.0 %(0/30)和13.3 %(4/30)。共包含5種耐藥基因型，即ant(3")-I-Sul1+tet(A)-TEM-、ant(3")-I-Sul1-tet(A)-TEM-、ant(3")-I-Sul1-tet(A)-TEM+、ant(3")-I+Sul1-tet(A)-TEM-和ant(3")-I-Sul1+tet(A)-TEM+，分布率依次為40.0 %(12/30)、40.0 %(12/30)、10.0 %(3/30)、6.7 %(2/30)、3.3 %(1/30)。

表5 副溶血弧菌菌株耐藥基因的檢測(cè)結(jié)果

圖3 基于ant(3")-I部分序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of partial sequences of ant(3")-I

在30株受試菌株中，只有FCG01和FCG03菌株攜帶ant(3")-I基因，GenBank登錄號(hào)分別為MG870346和MG870347?；?84 bp的ant(3")-I部分序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3)，可見(jiàn)菌株FCG01和FCG03的ant(3")-I部分序列與副溶血弧菌(V.parahaemolyticus，MF627445.1)、霍亂弧菌(V.cholerae，HM015625.1)、殺鮭氣單胞菌(Aeromonassalmonicida，MF495478.1)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae，MF582638.1)、銅綠色假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，MF144194.1)聚為一支，在進(jìn)化關(guān)系上比較近；與弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii，AF458081.1)、鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonellatyphimurium，AF203817.1)在進(jìn)化關(guān)系上距離較遠(yuǎn)?；赼nt(3")-I部分序列，與副溶血弧菌、殺鮭氣單胞菌、肺炎克雷伯氏菌、銅綠色假單胞菌、霍亂弧菌、鼠傷寒沙門氏桿菌、弗氏檸檬酸桿菌的核苷酸一致性：FCG01分別為98.2 %、98.2 %、98.2 %、98.2 %、97.9 %、88.8 %和88.4 %；FCG03分別為99.6 %、99.6 %、99.6 %、99.6 %、99.3 %、89.9 %和89.5 %。

有4株菌株(QZ14、BH02、BH03和BH04)攜帶TEM基因，GenBank登錄號(hào)依次為MG870348、MG931979、MG931980和MG931981?；赥EM部分序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖4。根據(jù)圖4，4株菌株的TEM部分序列與副溶血弧菌(V.parahaemolyticus，JF327791.1)、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila，F(xiàn)J767900.1)、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens，GU733416.1)聚為一支，在進(jìn)化關(guān)系上比較近；與摩氏摩根氏菌(Morganellamorganii，GU011973.1)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae，LNIM01000067.1)、粘質(zhì)沙雷菌(Serratiamarcescens，AY538699.1)、大腸桿菌(Escherichiacoli，KU664682)在進(jìn)化關(guān)系上距離較遠(yuǎn)。基于TEM部分序列，與副溶血弧菌、嗜水氣單胞菌、熒光假單胞菌、摩氏摩根氏菌、肺炎克雷伯氏菌、粘質(zhì)沙雷菌、大腸桿菌的核苷酸一致性：QZ14分別為100 %、100 %、100 %、99.7 %、99.6 %、99.3 %和99.3 %；BH02分別為99.7 %、99.9 %、99.9 %、99.6 %、99.6 %、99.4 %、99.1 %和99.1 %；BH03分別為100 %、100 %、99.9 %、99.7 %、99.6 %、99.3 %和99.3 %；BH04分別為99.9 %、99.9 %、99.9 %、99.6 %、99.6 %、99.1 %和99.1 %。

檢測(cè)到Sul1基因的菌株有13株，分別為QZ01、QZ02、QZ03、QZ05、QZ06、QZ07、QZ08、QZ10、FCG02、FCG04、FCG06、BH01和BH03，GenBank登錄號(hào)依次為MG870352～MG870362、MG931977、MG931978。根據(jù)基于Sul1部分序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖5)可知，上述菌株的Sul1部分序列與副溶血弧菌(V.parahaemolyticus，MF627445.1)、霍亂弧菌(V.cholerae，DQ227350.1)、大腸桿菌(Escherichiacoli，U04278.1)聚為一支，進(jìn)化關(guān)系較近；與鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonellatyphimurium，DQ205474.1)序列在進(jìn)化關(guān)系上相對(duì)較遠(yuǎn)。DNAStar軟件分析結(jié)果顯示，本試驗(yàn)被測(cè)菌株的Sul1部分序列與副溶血弧菌、霍亂弧菌、大腸桿菌核苷酸一致性均為100 %，與鼠傷寒沙門氏桿菌核苷酸一致性為97.7 %。

圖4 基于TEM部分序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of partial sequences of TEM

圖5 基于Sul1部分序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of partial sequences of Sul1

2.3 副溶血弧菌對(duì)4類抗生素耐藥表型與耐藥基因的相關(guān)性

在30株副溶血弧菌中，鏈霉素和慶大霉素耐藥表型與ant(3")-I基因之間符合率均為0 %，相關(guān)性不顯著(P>0.05，下同)。由于未檢測(cè)到對(duì)新霉素有抗性的菌株，因此新霉素耐藥表型與ant(3")-I基因之間的相關(guān)性無(wú)法計(jì)算。復(fù)方磺胺嘧啶耐藥表型與Sul1基因之間符合率為53.8 %，相關(guān)性不顯著?；前范奏奏つ退幈硇团cSul1基因之間符合率為41.4 %，相關(guān)性不顯著。由于未檢測(cè)到tet(A)基因，因此多西環(huán)素耐藥表型與tet(A)基因之間的相關(guān)性也無(wú)法計(jì)算。青霉素G的耐藥表型與TEM基因之間符合率為13.8 %，相關(guān)性不顯著。氨芐青霉素的耐藥表型與TEM基因之間符合率為14.3 %，相關(guān)性不顯著(表6)。

表6 副溶血弧菌對(duì)4類藥物耐藥性和耐藥基因的相關(guān)性

注：“-”表示無(wú)法計(jì)算。括號(hào)外的數(shù)字為耐藥基因?yàn)殛?yáng)性的菌株數(shù)量，括號(hào)里的數(shù)字為對(duì)應(yīng)耐藥表型的菌株總數(shù)。

Note:‘-’ indicates that the value could not be calculated. The number outside the bracket indicated the quantity of strains which carry the resistance gene, and the number inside the bracket indicated the quantity of strains possessing the relevant antibiotic resistance.

3 討 論

3.1 廣西凡納濱對(duì)蝦源副溶血弧菌的耐藥性

水生養(yǎng)殖動(dòng)物源副溶血弧菌的耐藥現(xiàn)象普遍存在，在本試驗(yàn)中，廣西沿海凡納濱對(duì)蝦源副溶血弧菌對(duì)青霉素G和氨芐青霉素耐藥程度較高，與在浙江海產(chǎn)品[7]、江蘇凡納濱對(duì)蝦[8]源弧菌中的研究結(jié)果類似，這可能是因?yàn)榍嗝顾谿主要對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有效；而氨芐青霉素雖具有廣譜抗菌活性，但弧菌可能容易對(duì)其發(fā)生耐藥[6]。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)菌株對(duì)復(fù)方磺胺嘧啶和磺胺二甲嘧啶耐藥率較高，與對(duì)浙江海產(chǎn)品來(lái)源副溶血弧菌的研究結(jié)果[7]相似；試驗(yàn)菌株也具有一定的多重耐藥性。有學(xué)者認(rèn)為，由于磺胺類濫用現(xiàn)象嚴(yán)重，目前在我國(guó)環(huán)境中磺胺類的檢出率與濃度遠(yuǎn)高于其他國(guó)家[16]，因而推測(cè)副溶血弧菌對(duì)磺胺類的耐藥程度可能與環(huán)境中的磺胺類殘留量較高有關(guān)，多種抗生素可在蝦池中長(zhǎng)期存在，并誘導(dǎo)水體細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，同時(shí)造成耐藥基因的廣泛傳播[16]。但2013-2015年，本研究團(tuán)隊(duì)對(duì)某公司設(shè)在沿海各地的5個(gè)漁藥銷售店進(jìn)行初步調(diào)查結(jié)果，抗生素類藥物在廣西沿海的銷售量很少，所調(diào)查的5個(gè)漁藥店基本上不銷售抗生素類藥物；另對(duì)廣西沿海近6500 hm2蝦塘的調(diào)查結(jié)果也證明，在對(duì)蝦養(yǎng)殖過(guò)程中極少使用磺胺類等抗生素類藥物，蝦病都是通過(guò)改水、控料等方法進(jìn)行防控，一旦發(fā)生蝦病，幾乎都是即賣或排塘。表明導(dǎo)致本試驗(yàn)的試驗(yàn)菌株對(duì)復(fù)方磺胺嘧啶和磺胺二甲嘧啶耐藥率較高和多重耐藥性形成的原因較為復(fù)雜，除與抗生素的濫用有關(guān)外，可能還與其他因素有關(guān)。總之，在對(duì)蝦等水生動(dòng)物養(yǎng)殖過(guò)程中，建議養(yǎng)殖戶在選擇用藥時(shí)應(yīng)以藥敏試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，做到科學(xué)用藥。根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果，雖然氟苯尼考的敏感率達(dá)96.7 %，可作為廣西沿海凡納濱對(duì)蝦副溶血弧菌病防控的首選藥物，但也不可亂用和濫用，以最大限度減少耐藥菌株的產(chǎn)生。

3.2 4類耐藥基因檢測(cè)以及與耐藥表型的相關(guān)性

在耐藥基因攜帶情況與耐藥表型相關(guān)性的研究結(jié)果中，靳曉敏等[15]認(rèn)為，ant(3")-I為弧菌主要的氨基糖苷類修飾酶，能使游離羥基核苷化從而導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性[15]。但在本試驗(yàn)中，攜帶ant(3")-I的2株副溶血弧菌均對(duì)3種氨基糖苷類藥物敏感。在對(duì)單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)的研究中也有類似結(jié)果，這一現(xiàn)象被認(rèn)為是ant(3")-I基因需在一定條件下才能表達(dá)功能蛋白[17]。Sul1基因編碼的二氫葉酸合成酶能保護(hù)細(xì)菌不被磺胺類所抑制[15]。而本試驗(yàn)攜帶Sul1基因的13株副溶血弧菌中，有6株對(duì)復(fù)方磺胺嘧啶中介、1株對(duì)磺胺二甲嘧啶中介，可見(jiàn)Sul1和磺胺類耐藥表型間并非完全對(duì)應(yīng)，這是否與菌株生理?xiàng)l件或環(huán)境導(dǎo)致Sul1控制的性狀未能得到有效表達(dá)有關(guān)尚待進(jìn)一步深入研究。tet(A)為革蘭氏陰性菌最主要的四環(huán)素類耐藥基因，其編碼的tet(A)蛋白可將抗生素外排至細(xì)胞外導(dǎo)致細(xì)菌耐藥[13]，本試驗(yàn)在30株試驗(yàn)菌株中均未檢測(cè)到tet(A)基因，與對(duì)大菱鲆源鰻弧菌的檢測(cè)結(jié)果[15]一致。盡管未檢測(cè)到tet(A)，仍有13.3 %的試驗(yàn)菌株對(duì)多西環(huán)素耐藥。已知四環(huán)素類耐藥機(jī)制除tet(A)介導(dǎo)的外排泵機(jī)制外，還有核糖體保護(hù)和四環(huán)素類鈍化機(jī)制等[18]，據(jù)此推測(cè)，本試驗(yàn)的副溶血弧菌對(duì)四環(huán)素類抗生素可能存在其他耐藥機(jī)制。TEM是革蘭氏陰性菌最常見(jiàn)的β-內(nèi)酰胺類耐藥基因，其編碼的β-內(nèi)酰胺酶可水解各類青霉素類[12]。本試驗(yàn)TEM的檢出率(13.3 %)低于寧波(91.47 %)[19]而高于泰國(guó)(0 %)[6]。造成TEM檢出率不同的原因可能與細(xì)菌宿主及所處環(huán)境、地理位置、檢測(cè)條件等不一致有關(guān)。本試驗(yàn)中青霉素G、氨芐青霉素的耐藥表型和TEM相關(guān)性不顯著(P>0.05)，有學(xué)者認(rèn)為菌株對(duì)青霉素G、氨芐青霉素的耐藥性可能還受環(huán)境的抗生素含量、耐藥基因拷貝數(shù)等影響[20]。

據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果，未發(fā)現(xiàn)4類抗生素耐藥表型和耐藥基因之間存在顯著相關(guān)性，綜合前人的研究成果，認(rèn)為原因可能有：①菌外膜蛋白有可能參與調(diào)節(jié)抗生素經(jīng)細(xì)菌外膜的通透性[21]。如副溶血弧菌具有外膜蛋白復(fù)合物VmeA-VmeB-vpoC，該復(fù)合物可將抗生素泵出細(xì)菌胞外以達(dá)到耐受抗生素的目的[22]。②不同菌株其基因拷貝數(shù)不一，導(dǎo)致部分菌株耐藥基因未被檢出[20]。③一些耐藥基因在染色體、質(zhì)粒及其他可移動(dòng)遺傳元件上的分布情況復(fù)雜，其有效表達(dá)受到各種因素影響[10]。I型整合子耐藥基因(如ant(3")-I和Sul1)與整合酶基因intI的表達(dá)呈此消彼長(zhǎng)的狀況[23]。位于轉(zhuǎn)座子上的tet(A)基因其轉(zhuǎn)錄和翻譯受啟動(dòng)子、莖環(huán)結(jié)構(gòu)的影響[18]。④不同菌株其耐藥基因啟動(dòng)子強(qiáng)弱不一[20]，如I型整合子中耐藥基因ant(3")-I和Sul1的表達(dá)與啟動(dòng)子的種類、強(qiáng)弱以及與啟動(dòng)子的距離密切相關(guān)[23]。TEM基因4種啟動(dòng)子強(qiáng)弱順序?yàn)镻4>Pa/Pb>P3[24]。⑤菌株可能存在其他耐藥基因介導(dǎo)的耐藥機(jī)制等。例如當(dāng)外部環(huán)境條件不適宜細(xì)菌生存時(shí)，細(xì)菌可通過(guò)整合外源耐藥基因及調(diào)節(jié)整合子中下游基因盒的表達(dá)以適應(yīng)外部變化[23]。⑥細(xì)菌耐藥形成與抗生素使用方式有關(guān)。如嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)等病原菌在亞抑菌濃度誘導(dǎo)下可以獲得對(duì)氟苯尼考等抗生素的高耐藥性[25-26]?？梢?jiàn)，除了耐藥基因，副溶血弧菌對(duì)4類抗生素的耐藥性可能還受上述6個(gè)方面情況的影響，導(dǎo)致本試驗(yàn)4類抗生素耐藥表型和耐藥基因之間的相關(guān)性不顯著。但由于許多耐藥基因可以隨可移動(dòng)遺傳組件在菌株之間水平轉(zhuǎn)移[10]，耐藥基因的存在給凡納濱對(duì)蝦弧菌病防控帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)仍需引起高度重視。總之，建議加強(qiáng)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)和耐藥基因的研究，以提高凡納濱對(duì)蝦弧菌病防控效率，同時(shí)為進(jìn)一步弄清弧菌耐藥機(jī)制提供依據(jù)。

4 結(jié) 論

廣西沿海30株凡納濱對(duì)蝦源副溶血弧菌對(duì)磺胺二甲嘧啶和青霉素G耐藥性最強(qiáng)，對(duì)氟苯尼考敏感性最高。30株弧菌的優(yōu)勢(shì)耐藥基因型是ant(3")-I-Sul1+tet(A)-TEM-和ant(3")-I-Sul1-tet(A)-TEM-。4類抗生素耐藥基因與耐藥表型之間均未發(fā)現(xiàn)顯著相關(guān)性。