廣西2個特色釀酒葡萄品種黃烷-3-醇組分解析

成 果，張 勁，黃小云，張 瑛，謝太理，謝林君，余 歡，周詠梅，周思泓

(廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄與葡萄酒研究所，廣西 南寧 530007)

【研究意義】目前，我國釀酒葡萄生產(chǎn)中存在應(yīng)用品種較為單一的問題，仍然以歐亞種葡萄‘赤霞珠’、‘霞多麗’等為主。而廣西屬亞熱帶氣候區(qū)，高溫多濕，歐亞種葡萄品種由于抗病性較差一直未在當(dāng)?shù)貜V泛種植。南方野生葡萄品種耐高溫高濕，抗病性強(qiáng)，不易感染黑痘病、白腐病、炭疽病等病害，是重要的葡萄品種資源[1]。因此，挖掘廣西本地葡萄品種資源，提升特色釀酒葡萄品質(zhì)至關(guān)重要。【前人研究進(jìn)展】原花青素(Proanthocyanidins，Pas), 又稱為縮合單寧(Condnsed Tannins，CTs)，在植物體經(jīng)苯丙烷-類黃酮代謝路徑合成，來源于葡萄果皮和種子，構(gòu)成葡萄酒的‘骨架’，并保證酒的色澤穩(wěn)定性[2-3]。原花青素是黃烷-3-醇(Flavan-3-ol)單元的聚合體，葡萄中常見的黃烷-3-醇單體有：兒茶素(Catechin, C)、表兒茶素(Epicatechin，EC)、表?xiàng)攦翰杷?Epigallocatechin,EGC)和表兒茶素沒食子酸酯(Epicatechingallate，ECG)[4-5]。葡萄果實(shí)成熟過程中黃烷-3-醇組分含量發(fā)生變化。研究表明，不同葡萄品種單寧含量一般在坐果時達(dá)到最高，進(jìn)入轉(zhuǎn)色期時含量開始下降[6]。不同品種、栽培條件、紫外線照射、激素處理等對葡萄果皮和種子中黃烷-3-醇物質(zhì)的組成和含量有很大影響。前人研究表明，北美種群和歐美雜種葡萄中黃烷-3-醇含量最高，圓葉葡萄次之，而多數(shù)東亞種葡萄中黃烷-3-醇含量較低[7]。UV-C 能夠增強(qiáng)隱色花色素還原酶活性，從而誘導(dǎo)葡萄果實(shí)中黃烷-3-醇的合成[8]。劉金串等[9]研究表明，在幼果期對紅地球葡萄進(jìn)行膨大處理可使果實(shí)總黃烷醇含量增加。高翔等[10]研究表明，油菜素內(nèi)脂處理能夠提高‘赤霞珠’果皮及種子中的黃烷-3-醇含量?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】近年來國內(nèi)外學(xué)者不斷改進(jìn)葡萄果實(shí)及葡萄酒中黃烷-3-醇類物質(zhì)的檢測方法，并探究不同品種、不同產(chǎn)區(qū)葡萄及葡萄酒黃烷-3-醇類的組成及含量差異，而此類研究多集中于歐亞種葡萄。針對廣西特色釀酒葡萄品種‘凌豐’和‘桂葡6號’中黃烷-3-醇類物質(zhì)組分特征的研究鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以廣西特色釀酒葡萄品種‘凌豐’和‘桂葡6號’為試材，并與歐亞種‘赤霞珠’進(jìn)行比較，通過檢測冬果不同發(fā)育期果皮和種子中黃烷-3-醇的含量，分析其組分特征，為今后優(yōu)化廣西釀酒葡萄的栽培措施，提高當(dāng)?shù)靥厣劸破咸训钠焚|(zhì)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)與材料

試驗(yàn)地位于廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄與葡萄酒研究所科研基地(22°50′59′′ N，108°14′35′′ E)。供試的葡萄(VitisL.)品種為‘赤霞珠’(V.viniferaL.)、‘桂葡6號’(Vitissp.)以及‘凌豐’(V.quinquangularis×V.vinifera)，樹齡分別為8、3和10年。3個品種的整形方式分別為：單干雙臂型、一字型和Y字型，行距2.5 m，株距1.5 m，南北行向，灌溉方式均為滴灌。3個品種果實(shí)樣品均為冬果，采集時間始于花后4周(2015年9月28日)，之后每2周采樣1次至采收期結(jié)束。每個品種選擇樹體長勢基本一致的9株作為實(shí)驗(yàn)樹，每3株合并作為一個生物學(xué)重復(fù)。每次采樣時間為上午9:00-10:00，樣品采后放入冰盒立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 果實(shí)理化指標(biāo)測定

從每個生物學(xué)重復(fù)的實(shí)驗(yàn)樹上剪下100粒漿果果粒(即每個采樣點(diǎn)每個品種共300粒)，隨機(jī)兼顧果穗的各個部位。其中150粒樣品(每個生物學(xué)重復(fù)50粒)用于測定果實(shí)鮮重、單粒果皮鮮重、單粒種子數(shù)量、單粒種子鮮重、可溶性固形物含量和可滴定酸含量。詳細(xì)步驟如下：果實(shí)稱重后破碎擠汁，然后將果皮、果肉和種子分離，用濾紙吸去果汁后稱量果皮和種子鮮重，并統(tǒng)計種子的數(shù)量。利用PAL-1型手持折射計(Atago, Tokyo, Japan)測量可溶性固形物(Total soluble solids, TSS)含量。利用酸堿滴定法測定可滴定酸(Titratable Acid, TA)含量，結(jié)果用酒石酸表示。每個生物學(xué)重復(fù)采取3個技術(shù)重復(fù)測定。剩余樣品用液氮速凍后保存于-80 °C冰箱待用。

1.3 黃烷-3-醇類物質(zhì)的檢測

黃烷-3-醇的提取方法參照Liang等[11]的方法。取0.1 g葡萄皮干粉或種子干粉于10 mL離心管中，加入1 mL間苯三酚緩沖液(含25.8 μl HCl和50 g/L 間苯三酚)和0.005 g抗壞血酸，在50 °C 下靜置裂解20 min后，加入1 mL乙酸鈉(200 mM)終止反應(yīng)，離心15 min (10 000 r/min)后取出上清液置于新的10 mL離心管中；重復(fù)提取3次合并上清液搖勻，于-80 °C保存待用。每個生物學(xué)重復(fù)單獨(dú)提取。

采用島津LC-20AD高效液相色譜對提取產(chǎn)物進(jìn)行檢測。流動相A：0.2 %乙酸水溶液。流動相B：乙腈∶0.2 %乙酸水溶液=4∶1。色譜條件如下，梯度洗脫程序：0～20 min，10 % B；20～30 min，10 %～15 % B；30～40 min，15 %～20 % B；40～50 min，20 %～33 % B；50～55 min，33 %～40 % B；55～58 min，40 %～100 % B；58～63 min，100 % B； 63～64 min，10 % B。流速：1.0 mL/min；柱溫：25 °C；檢測波長：280 nm；進(jìn)樣量：25 μl。

1.4 葡萄果皮和種子中黃烷-3-醇類物質(zhì)的定性與定量

本研究的黃烷-3-醇定性工作對標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間一一確定。分別建立1～1000 mg/L之間、9個水平、3個重復(fù)的兒茶素、表兒茶素、表?xiàng)攦翰杷睾捅韮翰杷貨]食子酸酯標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)在0.97以上。果皮和種子中黃烷-3-醇含量單位為μg·漿果-1。

1.5 試劑與標(biāo)樣

標(biāo)準(zhǔn)品：兒茶素[(+)-Catechin]、表兒茶素[(-)-Epicatechin]、表?xiàng)攦翰杷豙(-)-Epigallocatechin]和表兒茶素沒食子酸酯[(-)-Epicatechin gallate]均購買于 Sigma(St. Louis, MO, USA)公司，純度均為98 %以上。

色譜純試劑：乙腈(Acetonitrile)、甲醇(Methanol)和乙酸(Acetic acid)均購買于Fisher(Fairlawn, NJ, USA)公司，純度均達(dá)99.9 %以上。

分析純試劑：間苯三酚(Phloroglucinol)購買于上海瑞永生物科技有限公司；抗壞血酸(Ascorbate)購買于廣州金華大化學(xué)試劑有限公司；乙酸鈉購買于天津博迪化工股份有限公司；濃鹽酸(HCl)購買于廣東省廉江市愛廉化學(xué)試劑有限公司。

1.6 統(tǒng)計分析

利用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)在P<0.05水平下進(jìn)行顯著性分析。黃烷-3-醇含量為μg·漿果-1。采用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用Excel 2010繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種果實(shí)理化指標(biāo)隨發(fā)育期變化情況

由圖1可以看出，3個供試葡萄品種理化指標(biāo)隨發(fā)育期的變化趨勢基本一致，但是含量高低和數(shù)量大小存在差異?！嘞贾椤汀柝S’葡萄果實(shí)于花后8周開始轉(zhuǎn)色，而‘桂葡6號’于花后10周進(jìn)入轉(zhuǎn)色期。自花后6周起，‘桂葡6號’果粒鮮重和果皮鮮重高于‘赤霞珠’和‘凌豐’。采收期(花后14周，下同)，‘桂葡6號’果粒鮮重和果皮鮮重約為其它2個品種的2倍?；ê?～14周，‘赤霞珠’平均每粒漿果中的種子數(shù)量低于‘凌豐’和‘桂葡6號’，且‘桂葡6號’平均每粒漿果中的種子重量高于‘赤霞珠’和‘凌豐’?；ê?～14周，‘桂葡6號’果實(shí)可溶性固形物濃度始終低于‘赤霞珠’和‘凌豐’?；ê?2～14周，‘凌豐’果實(shí)可溶性固形物濃度最高?；ê?～8周，‘凌豐’果實(shí)可滴定酸含量最高，但在采收期‘桂葡6號’果實(shí)可滴定酸含量顯著高于其它2個品種。

不同小寫字母表示采收期不同品種之間差異達(dá)顯著性水平(P<0.05)Different small letters between different cultivars from harvest stage indicate significant differences at 5 % level(P< 0.05)圖1 不同品種果實(shí)發(fā)育期理化指標(biāo)Fig.1 The physical and chemical characteristics of different cultivars changed with the grape development

圖2 不同品種葡萄果皮中黃烷-3-醇類物質(zhì)含量變化Fig.2 Content of flavan-3-ols in grape skins of different cultivars

2.2 不同品種葡萄果皮黃烷-3-醇含量變化

如圖2所示，不同品種葡萄果皮中黃烷-3-醇含量隨發(fā)育期的變化趨勢不同?？傮w來說，3個品種葡萄果皮中表?xiàng)攦翰杷氐暮孔罡?，其次是兒茶素和表兒茶素，表兒茶素沒食子酸酯的含量最低。自花后4周至采收期，‘桂葡6號’葡萄果皮中兒茶素的含量高于其它2個品種，且在花后6周時其含量達(dá)峰值，而‘赤霞珠’和‘凌豐’則是在花后8周時含量最高。3個品種葡萄果皮中表兒茶素含量隨發(fā)育期變化呈波動下降趨勢?；ê?周至采收期，‘凌豐’葡萄果皮中表兒茶素含量始終低于其它2個品種?；ê?2～14周，‘赤霞珠’葡萄果皮中表兒茶素含量最高?；ê?～12周，3個葡萄品種葡萄果皮中表?xiàng)攦翰杷睾砍什▌由仙厔荩诓墒掌谟致杂邢陆??！鹌?號’葡萄果皮中表?xiàng)攦翰杷睾渴冀K高于其它另2個品種。在整個發(fā)育階段，‘凌豐’葡萄果實(shí)中表兒茶素沒食子酸酯含量最高，其次是‘桂葡6號’，‘赤霞珠’含量始終最低?！鹌?號’葡萄果皮中表兒茶素沒食子酸酯含量在整個發(fā)育階段呈上升趨勢，而‘赤霞珠’和‘凌豐’其含量自花后4～12周不斷增加，到采收期略有降低。

2.3 不同品種葡萄種子黃烷-3-醇含量變化

如圖3所示，不同品種葡萄種子中黃烷-3-醇含量隨發(fā)育期的變化趨勢也存在差異?？傮w來說，3個品種葡萄種子中表?xiàng)攦翰杷氐暮孔罡?，其次是表兒茶素，再次是兒茶素，表兒茶素沒食子酸酯的含量最低。自花后4周至采收期，3個品種葡萄種子中兒茶素含量在波動中下降，采收期含量降至最低，‘赤霞珠’種子中兒茶素含量自花后10周起高于其它2個品種?；ê?周，‘桂葡6號’種子中表兒茶素含量最高，而‘赤霞珠’和‘凌豐’種子中表兒茶素含量在花后6周達(dá)峰值后在波動中下降。采收期‘赤霞珠’種子中表兒茶素含量高于‘桂葡6號’和‘凌豐’。3個品種葡萄種子中表?xiàng)攦翰杷睾侩S發(fā)育期的變化趨勢一致，且都在花后6周時含量最高，隨后持續(xù)降低?；ê?～10周，‘桂葡6號’種子中表?xiàng)攦翰杷睾孔罡?，采收期時‘凌豐’種子中表?xiàng)攦翰杷睾康陀谄渌?個品種?；ê?周時，‘桂葡6號’種子中表兒茶素沒食子酸酯含量最高，而‘赤霞珠’和‘凌豐’種子中其含量在花后6周達(dá)峰值?；ê?～14周，‘桂葡6號’種子中表兒茶素沒食子酸酯含量最低，采收期‘赤霞珠’中其含量高于其它2個品種。

圖3 不同品種葡萄種子中黃烷-3-醇類物質(zhì)含量變化Fig.3 Content of flavan-3-ols in grape seeds of different cultivars

2.4 不同品種葡萄果皮及種子黃烷-3-醇總量及比例變化

由圖4可以看出，3個品種葡萄果皮中黃烷-3-醇總量在花后12周達(dá)峰值，且整個發(fā)育階段‘桂葡6號’果皮中黃烷-3-醇總量顯著高于‘赤霞珠’和‘凌豐’，漿果成熟后期(花后12～14周)‘赤霞珠’和‘凌豐’之間差異不顯著。3個品種葡萄種子中黃烷-3-醇總量隨發(fā)育期的變化趨勢與果皮不同?！嘞贾椤汀柝S’種子中黃烷-3-醇在花后4周含量最高，而‘桂葡6號’則是在花后6周達(dá)峰值。進(jìn)入轉(zhuǎn)色期后，3個品種葡萄種子中黃烷-3-醇總量持續(xù)降低，且‘凌豐’種子中黃烷-3-醇總量顯著低于‘桂葡6號’和‘赤霞珠’。將黃烷-3-醇按其B環(huán)羥基化程度不同分類，可分為3′5′-羥基化和3′-羥基化2種。本研究結(jié)果表明，3個品種葡萄果皮中所含有的黃烷-3-醇以3′5′-羥基化修飾為主，且3′5′-羥基化黃烷-3-醇比例隨發(fā)育期呈波動上升趨勢，而3′-羥基化黃烷-3-醇比例持續(xù)降低。花后12～14周，‘赤霞珠’果皮中3′5′-羥基化黃烷-3-醇比例顯著低于‘凌豐’和‘桂葡6號’?；ê?周，3個品種葡萄種子中所含的黃烷-3-醇以3′-羥基化修飾為主，隨后3′5′-羥基化修飾比例急劇增加，到采收期為止，其所占比例>50 %?；ê?～14周，‘桂葡6號’葡萄種子中3′5′-羥基化黃烷-3-醇比例顯著高于‘赤霞珠’和‘凌豐’。果實(shí)成熟階段(花后10～14周)，‘赤霞珠’葡萄種子中3′-羥基化黃烷-3-醇比例顯著高于其它2個品種。

3 討 論

葡萄果實(shí)中常見的黃烷-3-醇類物質(zhì)有兒茶素、表兒茶素、表?xiàng)攦翰杷睾捅韮翰杷貨]食子酸酯4類，它們存在于果實(shí)的果皮、種子、果梗、果肉及枝條中[12-13]。本研究對‘赤霞珠’、‘凌豐’和‘桂葡6號’不同發(fā)育期理化指標(biāo)的檢測結(jié)果表明，野生資源選育的品種‘桂葡6號’單粒漿果的果皮重量和種子重量高于其它2個品種，而葡萄皮和種子所含的黃烷-3-醇類物質(zhì)為葡萄及葡萄酒的酚類物質(zhì)的主要來源，因此野生資源選育的‘桂葡6號’酚類物質(zhì)含量豐富。

不同品種葡萄中黃烷-3-醇物質(zhì)的含量有很大差異。Jin[14]對9個紅色釀酒葡萄果皮中的酚類物質(zhì)的檢測結(jié)果表明，‘西拉’、‘蛇龍珠’‘赤霞珠’、‘美樂’和‘煙73’果皮中的黃烷-3-醇總量顯著高于‘佳美’和‘黑比諾’。Zhu[15]對6個種群的23個葡萄品種果皮中的黃烷-3-醇類物質(zhì)的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，北美種群的‘尼亞加拉’果皮中黃烷-3-醇總量最高，約為歐亞種‘赤霞珠’的20倍左右。在本研究中，野生資源選育的‘桂葡6號’葡萄果皮中黃烷-3-醇總量顯著高于歐亞種‘赤霞珠’和毛歐雜種‘凌豐’。張娟等[16]對20個紅色釀酒品種葡萄種子中黃烷-3-醇類物質(zhì)的檢測結(jié)果表明，‘沃波爾特’、‘法國蘭’和‘粉紅沙斯拉’3個品種籽中黃烷-3-醇總量最高，‘美樂’、‘灰比諾’、‘赤霞珠’和‘佳麗釀’等品種次之；‘黑虎香’、‘北醇’、‘神索’和‘蛇龍珠’最低。在本研究中，果實(shí)成熟階段‘凌豐’種子中黃烷-3-醇總量顯著低于‘赤霞珠’和‘桂葡6號’。黃烷醇類物質(zhì)除了決定葡萄酒的苦味及澀味以外，還對葡萄酒顏色具有保護(hù)作用[17]，由葡萄果皮及種子中經(jīng)發(fā)酵過程進(jìn)入葡萄酒中。因此，廣西本地野生資源選育的‘桂葡6號’在黃烷-3-醇對葡萄酒的護(hù)色方面具有很大潛力。

不同小寫字母表示同一發(fā)育期，不同品種之間差異達(dá)顯著性水平(P<0.05)Different small letters between different cultivars from the same developmental stage indicate significant differences at 5 % level(P < 0.05)圖4 不同品種黃烷-3-醇總量與3′5′/3′-羥基取代黃烷-3-醇比例Fig.4 The ratio of tri-/di-hydroxylated flavan-3-ols and flavan-3-ol total content in different grape cultivars

已有大量文獻(xiàn)對葡萄生長發(fā)育過程中黃烷-3-醇類物質(zhì)的變化進(jìn)行了報道，它們在果實(shí)的不同發(fā)育階段和不同部位進(jìn)行合成[17]。葡萄果皮中的黃烷-3-醇在轉(zhuǎn)色后1～2周達(dá)到最大值，隨后呈急劇降低趨勢，主要原因是轉(zhuǎn)色后類黃酮代謝路徑上的底物更多的流向合成花色苷的方向[18,19]。在本研究中，‘赤霞珠’、‘凌豐’和‘桂葡6號’果皮中黃烷-3-醇含量都在花后12周出現(xiàn)峰值，這主要取決于果皮中含量最高的表?xiàng)攦翰杷氐淖兓厔?。在葡萄種子中，黃烷-3-醇在果實(shí)轉(zhuǎn)色前完成積累，轉(zhuǎn)色后到成熟此類物質(zhì)的含量有明顯下降，主要原因是氧化作用[20-21]。在本研究中，3個品種葡萄種子中黃烷-3-醇總量都在轉(zhuǎn)色前達(dá)到峰值，‘赤霞珠’和‘凌豐’種子中黃烷-3-醇總量在花后4周最高，而‘桂葡6號’中其最大值則出現(xiàn)在花后6周。由此可見，不同葡萄品種果皮和種子中黃烷-3-醇隨發(fā)育期的積累和變化規(guī)律存在差異，這對于其生物學(xué)性狀的描述和釀酒品質(zhì)的評價具有重要意義。

表兒茶素與兒茶素雖然只是在C3位的構(gòu)象不同，但卻有截然不同的口感，表兒茶素比兒茶素更加苦澀而且苦澀的感覺持續(xù)的時間也更長[22]。果實(shí)成熟階段，‘赤霞珠’果皮和種子中表兒茶素含量高于‘桂葡6號’和‘凌豐’，說明其苦澀感比其它2個品種更強(qiáng)。

在植物體內(nèi)，原花色素由黃烷-3-醇單體聚合而成。原花色素結(jié)構(gòu)多變，這主要是黃烷醇的修飾類型、化學(xué)異構(gòu)以及聚合度的變化造成的[17]。黃烷-3-醇B環(huán)羥基化模式取決于細(xì)胞色素P450單加氧酶F3′H和F3′5′H的催化，由F3′H催化產(chǎn)生的二羥基化(3′-羥基取代)黃烷-3-醇主要有兒茶素和表兒茶素；由F3′5′H催化產(chǎn)生的三羥基化(3′5′-羥基取代)黃烷-3-醇主要有棓兒茶素和表?xiàng)攦翰杷亍９麑?shí)成熟后期，‘凌豐’和‘桂葡6號’葡萄果皮中3′5′-羥基取代黃烷-3-醇比例高于‘赤霞珠’，而整個發(fā)育期‘桂葡6號’種子中3′5′-羥基取代黃烷-3-醇比例顯著高于其它2個品種。另外，黃烷-3-醇C3位的羥基基團(tuán)容易被沒食子酸酯化，這類酯化的黃烷-3-醇大量存在于葡萄籽中。沒食子酸酯化使酒的單寧感變粗糙，而三羥基化黃烷醇能夠降低這種粗糙的口感，柔順酒體[23-25]。由以上分析可以看出，‘桂葡6號’果實(shí)中高比例的3′5′-羥基取代黃烷-3-醇有助于提高葡萄酒的柔順度。

4 結(jié) 論

葡萄果皮和種子中黃烷-3-醇總量、兒茶素、表兒茶素、表?xiàng)攦翰杷丶氨韮翰杷貨]食子酸酯含量隨發(fā)育期的變化趨勢在不同品種間存在差異影響。廣西特色釀酒葡萄品種‘桂葡6號’和‘凌豐’葡萄果皮和種子中黃烷-3-醇含量最高的一類是表?xiàng)攦翰杷亍{果成熟后期‘凌豐’種子中黃烷-3-醇總量顯著低于‘桂葡6號’和‘赤霞珠’。野生資源選育的‘桂葡6號’果皮和種子中黃烷-3-醇含量和3′5′-羥基取代黃烷-3-醇的比例較高，是極具發(fā)展?jié)摿Φ募t色釀酒品種。