擬南芥圖位克隆快速初定位系統(tǒng)的建立

闞東陽,柯 學(xué),Walid Ghidan,肖素勤,肖 卿,胡向陽,孔祥祥,黃興奇,程在全

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，云南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，農(nóng)業(yè)部西南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，云南 昆明 650223；3.云南藍慮商貿(mào)有限公司，云南 會澤 650420)；4.中國科學(xué)院昆明植物研究所，云南 昆明 650201)

圖位克隆(Map-based cloning)也叫位點克隆，是基因克隆的經(jīng)典方法，1986年首先由劍橋大學(xué)的Alan coulson提出。它是通過已知位點的分子標(biāo)記尋找目的基因并確定其物理圖譜位置，對基因進行粗定位和精細定位，最終克隆到目的基因的方法?；静襟E包括：篩選與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記, 目的基因的定位，構(gòu)建高質(zhì)量容易操作的大片段基因組文庫,目的基因的篩選和鑒定，相比其它基因克隆技術(shù)，圖位克隆結(jié)果更具可靠性[1-6]。

利用圖位克隆技術(shù)，已從擬南芥和其它多種植物發(fā)現(xiàn)了許多功能基因。擬南芥中，克隆到ω-脂肪酸去飽和酶基因[6]，發(fā)現(xiàn)IEN2基因編碼延伸因子復(fù)合物，參與NAD+介導(dǎo)的信號途徑[5]，與測序技術(shù)相結(jié)合發(fā)現(xiàn)種子油成分控制基因，克隆了葉綠素?zé)晒釲CF3基因[2]和葉形態(tài)建成基因ABL1。大豆中，克隆出開花相關(guān)基因GmGIa[7]和豆莢籽粒數(shù)相關(guān)主效基因Ln[8]。水稻中利用InDel和SNP引物精細定位到卷葉基因和抗除草劑基因[9-10]。黃瓜中利用2 971個F2植株將葉綠體發(fā)育和葉綠素代謝相關(guān)w基因定位于33 kb，利用9497個F2植株定位在8.2 kb[11]。黑麥草中利用圖位克隆精細定位了自交不親和基因座[12]白菜中利用圖位克隆首次發(fā)現(xiàn)了種皮顏色基因TTG1[13]。

【研究意義】擬南芥(Arabidopsisthaliana)由于其植株小、形態(tài)特征簡單、生活周期短、基因組小(125 Mb、2n=10、25000個蛋白編碼基因)，在遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和分子生物學(xué)中是模式植物[14]。有Landsberg erecta (Ler)、Columbia (Col)和Wassilewskija (Ws)3種生態(tài)型，用于自交系構(gòu)建[4]，是突變體篩選、基因克隆和功能驗證的強有力工具[1]。在擬南芥圖位克隆初始工作中，面對數(shù)千個分子標(biāo)記，常常讓研究者一籌莫展，需要一一篩選易用性分子標(biāo)記用于初定位。因此篩選出了一批高效的分子標(biāo)記，實現(xiàn)了擬南芥中目標(biāo)基因的快速初定位，可以幫助其他研究者實現(xiàn)擬南芥中目標(biāo)基因的快速定位。【前人研究進展】隨著測序技術(shù)的發(fā)展和多種植物基因組測序的完成，后基因組的時代到來，開發(fā)出了更多的分子標(biāo)記(RFLP、RAPD、AFLP、INDEL、CAPS、SSR、SNP)，使圖位克隆的便利性和效率大為提高。在擬南芥中，已建立了TAIR(http://www.arabidopsis.org/marker)和AMP(http://amp.genomics.org.cn/)等數(shù)據(jù)平臺，在大量數(shù)據(jù)和信息的支持下，最快甚至幾個月就能證實和克隆到新基因[9,15]。即便如此，面對數(shù)千個分子標(biāo)記，研究者也需要花費大量時間去篩選合適的分子標(biāo)記?！颈狙芯壳腥朦c】通過已篩選出一批經(jīng)反復(fù)驗證過的高效的分子標(biāo)記，實現(xiàn)了擬南芥中各條染色體上目標(biāo)基因的快速初定位。【擬解決的關(guān)鍵問題】為解決擬南芥各條染色體上的目標(biāo)基因的快速定位提供了一批高效的分子標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

擬南芥(Arabidopsisthaliana)Columbia生態(tài)型(Col)和Landsberg生態(tài)型(Ler)，以及二者雜交后代種子經(jīng)10 mmol/LEMS誘變后，播種篩選出的鹽敏感突變體S28株系。鹽敏感突變體種子播于MS培養(yǎng)基上進行光照培養(yǎng)篩選，成苗后移栽入有機質(zhì)盒中于溫室培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為23 ℃，16 h光照，8 h黑暗。

1.2 DNA提取

取擬南芥鮮葉1張，利用生工“Dzup基因組DNA快速抽提試劑盒”提取基因組DNA，提取方法參照產(chǎn)品說明書。

1.3 分子標(biāo)記的選擇

從擬芥數(shù)據(jù)庫The Arabidopsis Information Resource (TAIR)(http://www.arabidopsis.org/)，和Arabidopsis mapping platform(AMP)(http://amp.genomics.org.cn/)上選擇44對分子標(biāo)記，合成引物進行PCR檢測，對Columbia(Col)和Landsberg(Ler)進行分型，從中篩選出易用高效的分子標(biāo)記。

1.4 PCR擴增及電泳檢測

根據(jù)引物合成信息，摸索PCR擴增及電泳檢測條件。實驗按常規(guī)進行，電泳檢測時瓊脂糖凝膠濃度為2 %。

1.5 重組率統(tǒng)計

對篩選出的24個分子標(biāo)記的PCR擴增產(chǎn)物進行χ2檢測，確定其分離比是否符合孟德爾分離定律(即C∶H∶L=1∶2∶1)，計算重組率[重組率(%)=重組配子數(shù)/配子數(shù)×100]，對目標(biāo)基因的初定位范圍進行判定。

2 結(jié)果與分析

2.1 從44個分子標(biāo)記中篩選出24個平均分布于5條染色體的分子標(biāo)記用于初定位

進行圖位克隆，分子標(biāo)記的篩選非常重要。有些分子標(biāo)記特異性不好，檢測條件苛刻，在實驗中難于利用，大大降低了克隆基因的效率。因此，應(yīng)選擇易用、高效的分子標(biāo)記。

經(jīng)過反復(fù)驗證，從原先選擇出的44個分子標(biāo)記中，篩選出24個分子標(biāo)記，這24個分子標(biāo)記平均分布于擬南芥的5條染色體上(圖1)，既有靠近著絲粒的標(biāo)記(1號染色體的1-AC006228-4425、3號染色體的3-AP002062-5445、5號染色體的PHYC)，又有靠近端粒位置的標(biāo)記(如1號染色體的1-AC007592-0663、2號染色體的Ciw2、3號染色體的3-AL356014-9336、4號染色體的4-AF069442-0706、5號染色體的5-AB009053-9339)。

合成引物(表1)，對24個標(biāo)記的PCR的擴增反應(yīng)條件可分為5組進行(1個標(biāo)記46 ℃退火，延伸20 min；8個標(biāo)記48 ℃退火，延伸20 min；9個標(biāo)記50 ℃退火，延伸20 min； 4個標(biāo)記52 ℃退火，延伸30 min；2個標(biāo)記56 ℃退火，延伸30 min)，110 V條件下，PCR產(chǎn)物的電泳檢測時間有7種(40、50、60、70、80、100和140 min，表2)。在上述條件下，這24個分子標(biāo)記易于擴增，條帶清晰，分辨率好，大大提高了多態(tài)性的判斷，是用于初定位的理想標(biāo)記(圖2)。

圖1 24個分子標(biāo)記在擬南芥染色體位置上的分布Fig.1 Distribution of 24 markers on chromosomes of Arabidopsis thaliana

表1 24個分子標(biāo)記及PCR引物信息

表2 PCR擴增及電泳檢測條件

2.2 篩選出的分子標(biāo)記在擬南芥耐鹽突變體中實現(xiàn)基因快速初定位

利用擬南芥構(gòu)建雜交群體，或?qū)σ吧秃吞囟ㄖ晗颠M行化學(xué)誘變或中子轟擊獲得突變體，根據(jù)表型定位克隆其中的突變基因，是通用擬南芥遺傳分析策略。通過Columbia和Landsberg生態(tài)型雜交獲得雜交后，對后代材料進行EMS誘變，從中挑選鹽敏感突變體，經(jīng)過至少2代篩選得到表型遺傳穩(wěn)定的突變材料，用于定位和克隆基因。

從EMS誘變材料中篩選到一株鹽敏感突變體S28，在MS平板上表現(xiàn)為根生長受抑制，根長極短(圖3)。經(jīng)平板和光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)成苗后，移栽到溫室培養(yǎng)，收種后進行播種用作初定位群體。在實驗中，利用篩選出的分子標(biāo)記，完成了50個植株的多態(tài)性分析，檢測結(jié)果清晰明了(圖4)。

目標(biāo)基因在圖位克隆中是根據(jù)分子標(biāo)記與基因連鎖關(guān)系的緊密程度得到定位的。根據(jù)電泳結(jié)果，對24個標(biāo)記的在S28群體中的帶型是否符合孟德爾分離定律(即C∶H∶L=1∶2∶1)進行χ2檢驗計算P值(以5 %為標(biāo)準(zhǔn)，大于5 %說明差異不顯著，小于5 %說明差異顯著)。

通過計算得到5號染色體上的引起的變異最顯著，相比其它染色體最不符合孟德爾分離定律，說明5號染色體上分子標(biāo)記與目標(biāo)基因存在連鎖現(xiàn)象。進一步統(tǒng)計5號染色體上所選分子標(biāo)記的重組率[重組率(%)=重組配子數(shù)/配子數(shù)×100]，標(biāo)記5-AB010070-0918、5-AL163792-1729、PHYC、K6M13和5-AB009053-9339的重組率分別為6 %、2 %、5 %、6 %和12 %。由此判定目標(biāo)基因應(yīng)位于小于5 %的2個遺傳標(biāo)記之間，即5-AL163792-1729與PHYC之間，并且靠近5-AL163792-1729的一端(表3)。

C代表Col,H代表雜合，L代表LerC: Col type; H: Heterozygote; L: Ler type圖2 24個分子標(biāo)記的PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Gel detection of PCR products of 24 markers

3 討 論

圖位克隆初定位是利用分子標(biāo)記把目的基因定位到染色體的一段區(qū)域的過程。擬南芥由于基因組小，染色體少，給初定位帶來了便利。本研究建立的初定位系統(tǒng)，能利用24個分子標(biāo)記，僅50株作圖群體就實現(xiàn)了目的基因的染色體初定位，整個初定位實驗?zāi)茉?周內(nèi)完成。這與Austin等強調(diào)的考慮到群體中基因分離重組的概率，至少要50個F2代個體才能觀察到可變分離的結(jié)論相符[16]，但完成整個圖位克隆所需的作圖群體通常應(yīng)大于1000個，特別是精細定位階段需要大樣本量。在擬南芥中，作圖距離每縮小10倍，作圖群體要增加2000個，才能保證目的基因位置判斷的準(zhǔn)確性。Lei等利用2650個不育株，對擬南芥雄性不育基因BnMs2進行了精細定位[17]，在做精細定位和克隆時，有時往往也需要構(gòu)建BAC庫[18]，因此，工作量是很大的。對于本實驗中，根據(jù)遺傳分離規(guī)律，將目的基因初定位于5號染色體上的區(qū)域，下一步應(yīng)利用5-AL163792-1729與PHYC之間的更多分子標(biāo)記，加大樣本量，逐步縮小區(qū)間。

圖3 鹽敏感突變體S28的表型Fig.3 Phenotype of salt sensitive lines S28

圖4 分子標(biāo)記3-AP002062-5445在50個S28樣本中的檢測結(jié)果Fig.4 Gel image of PCR product for marker 3-AP002062-5445 in 50 samples of S28

分子標(biāo)記MarkersC∶H∶L分子標(biāo)記MarkersC∶H∶L1-AC007592-066312∶27∶11Ciw1112∶27∶11F21M1210∶26∶143-AP002062-544517∶24∶091-AC006228-442510∶29∶113-AL356014-933616∶24∶101-AC009324-661313∶25∶124-AF069442-070614∶21∶151-AC010675-864514∶21∶154-AL035526-553613∶23∶14Ciw214∶23∶134-AL079350-698512∶22∶15Ciw310∶28∶124-AL031394-871911∶27∶122-AC007232-478013∶29∶085-AB010070-091822∶22∶06Nga112614∶24∶125-AL163792-172943∶05∶022-AC004681-70218∶33∶09PHYC32∶13∶053-AB024034-181913∶26∶11K6M1316∶28∶063-AB022217-240210∶31∶095-AB009053-933914∶24∶12

圖位克隆是基因克隆的經(jīng)典方法之一，在植物基因發(fā)掘中得到廣泛運用，但其支撐點是眾多的分子標(biāo)記。利用T-DNA及轉(zhuǎn)座子已獲得了20萬以上的擬南芥插入突變體，有5萬多個遺傳標(biāo)記可選[19]。水稻中已開發(fā)了1萬多個分子標(biāo)記，有EST(expressed sequence tags)、RFLPs(restriction fragment length polymorphism)、AFLP(amplified fragment length polymorphism)、RAPD(random amplified polymorphic DNA)、SSR(simple sequence repeat)和SNP(single nucleotide polymorphism)[13,20]。本研究中篩選出的24個分子標(biāo)記，對于目的基因在擬南芥染色體上的快速初定位十分有效，但在精細定位中，可能會面臨從數(shù)據(jù)庫無標(biāo)記可選，需要重新設(shè)計分子標(biāo)記如INDEL標(biāo)記。這在有完整基因組數(shù)據(jù)的擬南芥中相對來說是容易的，但是在遇到基因組背景序列不清楚的物種，或者由于育性難于擴大群體的突變材料時，應(yīng)利用測序技術(shù)與表型數(shù)據(jù)相結(jié)合，開發(fā)新的標(biāo)記，如SNP標(biāo)記、SCOT標(biāo)記，以及新的單位點特異性PCR標(biāo)記(如SCAR、CAPS、dCAPS)等，以實現(xiàn)目的基因的最終精細定位和克隆。

4 結(jié) 論

本研究中篩選出的24個分子標(biāo)記，對于目的基因在擬南芥染色體上的快速初定位十分有效，讓檢測工作快速集中到染色體上的某一區(qū)域。利用這些標(biāo)記，建立了擬南芥初定位快速圖位克隆系統(tǒng)，大大提高了初定位的效率，并實現(xiàn)擬南芥鹽敏感突變體S28的快速染色體初定位。