益氣補腎方對自然流產(chǎn)小鼠Th17/Treg細胞及相關細胞因子的影響*

葉 平 葉 騫 胡藍雅文 王歡歡 王百苗 董盼攀

1 浙江省立同德醫(yī)院 浙江 杭州 310012

2 浙江中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院 浙江 杭州 310053

復發(fā)性流產(chǎn)(RSA)是指與同一性伴侶連續(xù)發(fā)生≥2次于孕齡為20孕周之前的妊娠物或胎兒丟失(體質(zhì)量＜500g)[1]。生殖免疫學認為，母-胎免疫耐受微環(huán)境失調(diào)是復發(fā)性流產(chǎn)的重要影響因素[2]；Th17和Treg細胞分別作為調(diào)節(jié)性和效應性細胞，參與了妊娠的建立與維持。兩者之間的免疫失衡可能導致妊娠失敗[3]。益氣補腎方為臨床治療RSA的有效自擬方，本團隊前期藥理研究發(fā)現(xiàn)，該方可調(diào)節(jié)自然流產(chǎn)模型小鼠CD4+/CD8+T細胞、CD28細胞及NK細胞的表達；增加孕早期及中晚期脾臟CD4+CD25+T細胞及Foxp3因子表達水平，并降低胚胎吸收率，但是否可調(diào)節(jié)Th17/Treg細胞免疫平衡，維持免疫耐受而改變?nèi)焉锝Y(jié)局尚未進行深入研究。對此，為進一步探討其作用機制，本次研究采用自然流產(chǎn)小鼠模型，觀察益氣補腎方對妊娠結(jié)局、外周血Th17、Treg細胞含量、Th17/Treg細胞比例及相關細胞因子水平的影響，為益氣補腎方防治復發(fā)性流產(chǎn)提供新的理論依據(jù)。現(xiàn)將研究結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物：SPF級雌性CBA/J小鼠40只、雄性DBA/2小鼠16只、雄性BALB/c4只，體質(zhì)量18～21g。雄性DBA/2小鼠購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司[SCXK(滬)2013-0016]，雌性CBA/J、雄性BALB/c小鼠購于北京華阜康生物技股份有限公司[SCXK(京)2009-0004]。

1.2 藥物：益氣補腎方組成：黃芪36g，菟絲子30g，白術18g，當歸6g，黨參、陳皮、升麻、柴胡各12g，中藥購于浙江省中醫(yī)院。制備：用8倍水浸泡，過夜，先煮沸30min，倒出藥液，再加入8倍水，煮沸20min，最后再加5倍水，煮沸20min，合并藥液并減壓濃縮，最后配制成益氣補腎方煎劑（含生藥1.6g/ml），置－20℃冰箱備用。CsA溶液：由CsA膠囊(諾華制藥，批號：S0340A；規(guī)格：25mg/粒)溶于0.1%濃度甲醇溶液[將0.1ml的無水甲醇溶于99.9ml的蒸餾水（避光保存）]制成。灌胃前2小時，將1粒CsA膠囊放入裝有25ml 0.1%濃度甲醇溶液的小燒杯中，待膠囊軟化后，用針頭將其刺破，使內(nèi)容物充分溶解于甲醇溶液，待用。

1.3 試 劑 ：CD4-FITC、PE-Cyanine5.5、IL-17A-PE、Foxp3 - APC、 RatIgG2aisoty Pecontrol-APC、RatIgG2aisoty Pecontrol-PE、Foxp3/Transcri Ption FactorStaining BufferSetKit均由eBiosci-ence公司生產(chǎn)。PMA/Ionomycinmixture、BFA/Monensin Mixture、Flowcytometry Stainingbuffer均 由 Liankebio公司生產(chǎn)。干擾素-?（IFN-?）、白介素-4（IL-4）、白介素-17（IL-17）、白介素-10（IL-10）均購于聯(lián)科生物技術有限公司，批號為70-E-EK2022。

1.4 儀器：酶標儀（ThermoMultiskanMK3，美國）；流式細胞儀（FacsCalibur，美國BD公司）；臺式高速冷凍離心機（德國EPPendorf公司，5417R）；漩渦混合器（XW-80A型，上海醫(yī)科大學儀器廠）；細胞培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械廠）；低速自動平衡離心機（LDZ5-2型，北京京立離心機有限公司）。

1.5 方法：分述如下。

1.5.1 造模、分組及給藥：將CBA/J雌鼠與BALB/c雄鼠2∶1合籠，建立正常妊娠模型（CBA/J×BALB/c組），CBA/J雌鼠與DBA/2雄鼠2∶1合籠，建立小鼠自然流產(chǎn)模型（CBA/J×DBA/2組）。每天17：30～18：00合籠，早上8：00～8：30檢查陰栓，見陰栓日為妊娠第0天；未見陰栓，則繼續(xù)合籠。每日測量孕鼠體重，觀察腹部是否有明顯隆起并及時排除假孕現(xiàn)象。最終，得到正常妊娠模型孕鼠6只，作為正常妊娠模型組（正常組）；自然流產(chǎn)模型孕鼠32只，取其中30只隨機分為自然流產(chǎn)模型組（自然流產(chǎn)組）、環(huán)孢素組、中藥高劑量組（高劑量組）、中劑量組、低劑量組，每組6只。分組完成后，正常組和自然流產(chǎn)組給予0.9%生理鹽水10ml/kg；環(huán)孢素組給予CsA 10ml/kg；中藥高、中、低劑量組分別給予48、24、12g/kg益氣補腎方，連續(xù)2周，每天1次。

1.5.2 流式細胞檢測外周血Th17、Treg細胞含量：連續(xù)給藥14天后，摘眼球取外周血，置于肝素鈉抗凝管中。取部分全血進行Th17、Treg細胞含量，Th17細胞抗體標記為FITC-抗CD4和PE-抗IL-17A，CD4+IL-17+表示為Th17細胞含量；Treg細胞抗體標記為FITC-抗CD4、PE-抗CD25、APC-抗Foxp3，CD4+CD25+Foxp3+表示Treg細胞含量，按照試劑說明書步驟處理完成后，上流式細胞儀進行檢測。

1.5.3 酶聯(lián)免疫法檢測血清Th17/Treg相關細胞因子含量：剩余肝素鈉抗凝管中的全血，2000r/min離心10min得到血漿。采用酶聯(lián)免疫法檢測IFN-?、IL-17、IL-4、IL-10細胞因子含量，參照試劑盒說明書進行操作。

1.5.4 胚胎吸收率計算：末次給藥取血完畢后，迅速處死小鼠進行解剖；用鑷子撕開子宮，記錄被吸收胚胎數(shù)和存活胚胎數(shù)。按下列公式計算胚胎吸收率：R=Re/(Re+F)×100%（R表示胚胎吸收率，Re表示吸收胚胎數(shù)，F(xiàn)表示存活胚胎數(shù)）。

1.6 統(tǒng)計學分析：采用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理分析，計數(shù)資料用百分比表示，計量資料采用-x±s表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊時采用方差分析，方差不齊時用秩和檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 益氣補腎方對自然流產(chǎn)模型小鼠胚胎吸收率的影響：與正常組相比，自然流產(chǎn)組胚胎吸收率為25.0%；連續(xù)給藥2周，與自然流產(chǎn)組相比，中藥高、中、低劑量組均能顯著減少胎盤吸收率（P＜0.05），增加胎盤存活數(shù)量；中藥各劑量組間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。見表1。

表1 益氣補腎方對胚胎吸收率的影響（-x±s）

2.2 益氣補腎方對自然流產(chǎn)模型小鼠Th17/Treg細胞的影響：結(jié)果提示，益氣補腎方可影響自然流產(chǎn)模型Th17、Treg細胞含量，改善Th17/Treg比例失衡現(xiàn)象。見表2。

表2 各組孕14天小鼠Th17/Treg表達水平（-x±s，n=6）

2.3 益氣補腎方對自然流產(chǎn)模型小鼠Th17/Treg相關細胞因子含量的影響：與正常組相比，自然流產(chǎn)組血漿IFN-?含量顯著升高（P＜0.05）；IL-4無顯著變化（P＞0.05）。連續(xù)給藥2周，與自然流產(chǎn)組相比，益氣補腎方中藥高、中、低劑量組均能顯著降低自然流產(chǎn)模型小鼠IL-17、IFN-?含量（P＜0.05）；中藥低劑量組IL-10含量顯著升高（P＜0.05）；中劑量組IL-4含量顯著升高（P＜0.05）。見表3。

表3 各組孕14天小鼠Th17/Treg相關細胞因子含量表達水平（-x±s，ng/ml）

3 討論

復發(fā)性流產(chǎn)歸屬于中醫(yī)學“滑胎”范疇，主要病機為腎虛、脾腎兩虛、血瘀、氣血兩虛等，而脾腎二臟虧虛是滑胎的關鍵，益氣補腎方以補中益氣湯為主方，結(jié)合經(jīng)驗方化裁而成，全方具有益氣補腎、固攝安胎之效[4]。

生理水平的Thl7細胞具有顯著促進胚胎成功著床的作用，Treg細胞抑制Thl7的炎癥作用，但過多的炎癥則導致著床失敗和反復自然流產(chǎn)。因此，任何引起Thl7/Treg細胞比例失衡的因素都可能導致胚胎排斥的發(fā)生。有研究者報道，通過淋巴細胞免疫治療后，可以使不明原因復發(fā)性流產(chǎn)患者外周血中的Treg細胞增加，而Th17細胞減少，從而改善患者體內(nèi)免疫微環(huán)境，進一步有利于維持妊娠[5]。本實驗結(jié)果顯示，自然流產(chǎn)模型小鼠外周血Th17細胞明顯升高，Treg細胞明顯減少，Th17/Treg比值明顯降低，與上述研究相一致。連續(xù)給藥2周，益氣補腎方可下調(diào)外周血中Th17細胞的比例，上調(diào)Treg細胞的比例，促使Th17/Treg平衡向Treg方向移動而誘導免疫耐受。

Th17細胞通過分泌IL-17、IL-21、TNF-α、IL-22等，活化MAP激酶，誘導粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-SCF)和IL-8募集中性粒細胞，直接參與慢性炎癥反應，導致免疫排斥反應[6]。Treg細胞通過直接接觸靶細胞或分泌抑制性因子如IL-10和TGF-β等抑制自身反應性T細胞的免疫效應，具有免疫無能及免疫抑制性，可降低母體對胚胎的排斥，維持免疫耐受。益氣補腎方下調(diào)自然流產(chǎn)模型小鼠外周血中IL-17表達水平，上調(diào)IL-10的表達水平，推測益氣補腎方通過調(diào)節(jié)Th17/Treg細胞比例，改變兩者分泌細胞因子，進一步維持免疫耐受。

Thl主要分泌?干擾素(IFN-?)和IL等參與細胞免疫，而Th2主要產(chǎn)生GM-CSF、IL-4、IL-10和IL-13等參與體液免疫，Thl7/Treg細胞對可影響Thl/Th2細胞對的免疫功能加重免疫紊亂[7]。INF-?能抑制GM-SCF在子宮內(nèi)膜的分泌，從而抑制絨毛的生長，導致胚胎的吸收[8]，同時，高水平的INF-?與高水平的NK細胞相關，NK細胞能非特異性地殺傷滋養(yǎng)層細胞[9]。本實驗顯示益氣補腎方可降低自然流產(chǎn)模型小鼠外周血中IFN-?水平，升高IL-4水平，推測益氣補腎方可能通過影響IFN-?和IL-4分泌，促進胚胎生長發(fā)育而影響妊娠結(jié)局。

本實驗提示：益氣補腎方可能通過調(diào)節(jié)Th17及Treg細胞的表達水平，降低Th17/Treg比例，并調(diào)節(jié)相關細胞因子的表達水平，影響Th17/Treg平衡，誘導妊娠免疫耐受，促進胚胎發(fā)育，從而改善妊娠結(jié)局。

4 參考文獻

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