經(jīng)顱磁聲耦合電刺激技術應用于小鼠的實驗研究*

劉世坤，張鑫山，周曉青，殷濤，劉志朋

(中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院生物醫(yī)學工程研究所，天津 300192))

1 引 言

在腦科學及神經(jīng)科學的研究中，各類物理刺激(如電刺激、磁刺激、光刺激和超聲刺激等)正發(fā)揮著愈加重要的作用，現(xiàn)已被廣泛應用于腦功能認知及腦部神經(jīng)功能性疾病的研究和治療。其中，經(jīng)顱神經(jīng)電刺激有著巨大優(yōu)勢。早在1874年，美國的Bartholow在腦手術中用電極直接電刺激大腦運動區(qū)引起對側(cè)肢體抽動[1]，揭開了神經(jīng)電刺激用于神經(jīng)調(diào)控的序幕。到今天，通過科學家們對神經(jīng)電刺激的探究，神經(jīng)電刺激已經(jīng)引起了廣泛的關注，并逐步成為科學研究和臨床診療的重要手段。非侵入的經(jīng)顱神經(jīng)電刺激不僅用于診斷和治療腦神經(jīng)疾病，同時也可以調(diào)控大腦功能，為探索大腦認知過程的機制，提供了新的支撐技術。

本研究探討的經(jīng)顱磁聲耦合電刺激(transcranial magneto-acoustic stimulation, TMAS)屬于新型的無創(chuàng)腦神經(jīng)電刺激技術，即在神經(jīng)組織或組織液中利用靜磁場和超聲波通過霍爾效應來產(chǎn)生電流去無損傷地刺激神經(jīng)組織。2003年Norton最先提出借助超聲聚焦性和傳播深度的優(yōu)勢，將該原理應用于電刺激，并對磁聲耦合電刺激進行了理論推導，計算結果表明該方法可以產(chǎn)生感應電流，并應用于刺激目標神經(jīng)[2]。與經(jīng)顱磁刺激(transcranial magnetic stimulation, TMS)和經(jīng)顱直流電刺激(transcranial direct current stimulation, tDCS)相比，TMAS具有更高的空間分辨率，因為TMAS的空間分辨率是由聚焦超聲斑的直徑大小決定，而超聲聲斑較磁場聚焦區(qū)域小。

在此之前，Li曾對TMAS的刺激原理進行了仿真和驗證性實驗[3]，驗證了該方法的可行性。為進一步探究TMAS應用于動物神經(jīng)刺激的效果，本研究搭建了TMAS實驗系統(tǒng)，設計了針對小鼠的刺激參數(shù)，開展健康鼠和帕金森(parkinson’s disease，PD)模型鼠的在體實驗。

2 方法

2.1 TMAS技術的原理

經(jīng)顱磁聲刺激的物理原理是神經(jīng)組織中的離子在超聲波的作用下發(fā)生振動,因為靜磁場與帶電離子的運動方向垂直，所以在組織中的帶電離子在與靜磁場和振動方向均正交的方向產(chǎn)生洛倫茲力，產(chǎn)生的洛倫茲力將正負離子帶往相反的方向，從而在組織內(nèi)形成刺激電場[4]。

圖1 原理圖

原理圖見圖1，在磁場B0的作用下，當超聲波帶動導電組織產(chǎn)生相同振動速度V的運動時，可導電組織中產(chǎn)生的電場E為：

E=VB0

(1)

且組織中粒子振動的速度V與超聲聲壓P之間關系為：

P=ρCsV

(2)

ρ為組織密度，Cs為組織中超聲傳播速度。

將式(2)帶入式(1)得到電場分布情況：

(3)

由于電流密度J=σE，所以組織內(nèi)部電流密度為：

(4)

由式(4)可看出，由于神經(jīng)組織中ρ與Cs不變，磁聲耦合刺激產(chǎn)生的電場與電流密度僅與磁場強度和聲壓有關，且該電場方向為靜磁場與聲束振動方向的矢量積方向；即在靜磁場大小不變時，電流大小與超聲聲壓成線性關系。

2.2 小動物TMAS系統(tǒng)

為了進行在體小動物的磁聲耦合刺激實驗，搭建了一套針對小動物的在體TMAS實驗平臺，包括超聲激勵發(fā)生裝置、靜磁鐵、超聲換能器及小動物固定裝置、呼吸麻醉裝置等，見圖2。

圖2系統(tǒng)示意圖

Fig2Systemdiagram

圖2中設備分別為①腦立體定位儀，②超聲換能器，③超聲準直器，④靜磁鐵，⑤函數(shù)發(fā)生器，⑥門控放大器，⑦呼吸麻醉系統(tǒng)。

在TMAS實驗中，首先在函數(shù)信號發(fā)生器(AFG3252，Tektronix，美國)設定實驗需要的超聲信號，經(jīng)由高能門控放大器(GA-2500A，RITEC，美國)放大，將脈沖信號伏值提至1 000 V形成超聲激勵信號，驅(qū)動定制聚焦型超聲換能器(主頻1 MHz，焦距2.35 cm，焦點直徑2 mm，中科院聲學所制)產(chǎn)生豎直方向的超聲聲束，聲束通過超聲準直器(注滿超聲耦合劑的錐形筒，減少超聲在空氣中傳播產(chǎn)生的衰減)到達小鼠頭皮進行刺激。實驗用鼠固定在電磁兼容型腦立體定位儀上，并在實驗過程中使用呼吸麻醉系統(tǒng)(R520IP，瑞沃德，中國深圳)保持麻醉，同時在鼠頭部一側(cè)放置靜磁鐵提供水平方向的穩(wěn)恒磁場。

2.3 參數(shù)選擇與真實顱內(nèi)聲壓檢測

綜合考慮磁聲耦合電場強度及超聲安全，本實驗中所使用的超聲刺激信號為主頻1 MHz，脈沖寬度200 μs，重復頻率1 Hz的超聲波脈沖，每次刺激時間持續(xù)2 min，共120個脈沖，波形見圖3。

系統(tǒng)中靜磁場強度為0.3 T，由高斯計(475DSP，Lakeshore，美國)測試獲得。

圖3 超聲信號與參數(shù)

為了獲得本TMAS系統(tǒng)以及所使用參數(shù)在小動物顱內(nèi)所產(chǎn)生的真實聲壓，將一只C57BL/6J小鼠麻醉后頸椎脫臼處死，頭部固定于實驗系統(tǒng)中，頭頂脫毛，涂抹超聲耦合劑，并將換能器置于其頭部形成刺激點，在最大限度不影響顱內(nèi)密閉性的前提下，將針式水聽器(1 MHz下靈敏度2.71 uV/Pa，中科院聲學所制)穿過小鼠的下顎，深入顱內(nèi)，并將調(diào)整針式水聽器方向，使其與超聲換能器聲束在同一直線。之后開啟超聲刺激設備，在示波器中同步檢測超聲發(fā)射信號與水聽器檢測信號，從而得出在超聲脈沖發(fā)射時，小鼠顱內(nèi)的真實聲壓，測得在本實驗系統(tǒng)下，上述參數(shù)可以在小鼠顱內(nèi)產(chǎn)生約3.1 MPa的瞬時聲壓。

2.4 在體小動物的TMAS實驗

2.4.1健康小鼠的TMAS實驗 首先使用健康小鼠進行了TMAS實驗，選取同親C57BL/6J雄性小鼠8只，體重18～22 g，7～8周齡。安靜環(huán)境飼養(yǎng)，自由取食飲水。實驗中，將上述小鼠隨機均分成對照組，磁聲耦合刺激組，每組4只。首次實驗時剃除小鼠頭部外層毛發(fā)，并使用生理鹽水沖洗清洗干凈皮膚。每次實驗開始前，先使用4%濃度的異氟烷對實驗小鼠進行誘導麻醉。使小鼠被腦立體定位儀固定，固定后改為1%濃度異氟烷維持麻醉狀態(tài)。在小鼠頭部皮膚涂抹超聲耦合劑，將小鼠置于2.2實驗系統(tǒng)中。其中磁聲耦合刺激組將小鼠腦部置于強度為0.3 T的水平方向靜磁場下，同時超聲換能器使用2.3中的參數(shù)在海馬區(qū)黑質(zhì)豎直方向發(fā)射超聲波，持續(xù)2 min，每d 1次，連續(xù)10 d。對照組小鼠僅固定在腦立體定位儀上，將換能器置于頭皮上，并關閉超聲激勵，持續(xù)2 min，每d 1次，連續(xù)10 d[5-6]。

2.4.2PD模型小鼠的TMAS實驗 實驗中使用8只由腹腔注射MPTP造模形成的PD模型鼠，全部通過爬桿測試完成PD驗模[7]。也將該8只PD小鼠隨機分為對照組，TMAS組，每組4只。實驗中使用的刺激參數(shù)與刺激方案均與2.4.1中的健康鼠實驗方案相同。

3 動物實驗結果及討論

3.1 健康小鼠的TMAS實驗結果

在刺激結束之后2 d，即從開始刺激起第12 d，對實驗鼠進行了高架十字迷宮實驗以及曠場實驗，對其主動學習與探索記憶能力進行檢測。

高架十字迷宮由兩個相對的開放臂，兩個相對的封閉臂組成的十字型迷宮，放置在離地50 cm的支架上。實驗利用動物對新異環(huán)境的探究特性和對高懸敞開臂的恐懼形成矛盾沖突來考察動物的焦慮狀態(tài)，實驗指標主要關注進入開放臂探索的距離和在開放臂停留時間的百分比。實驗結果見圖4。

圖4 高架十字迷宮實驗結果

a.各組小鼠在開放臂停留時間百分比 b.各組小鼠在開放臂運動距離(cm)(對照組為C，磁聲刺激組為M)

Fig4Resultsofelevatedplusmazetest(C：controlgroup，M：TMASgroup)

a．the percentage of time mice stay in open arm b．the distance mice progress in open arm

在開放臂中向下探究的時間百分比反應在動物的探索行為，代表動物對陌生環(huán)境的好奇探索或逃避；進入開放臂探索的距離反應動物的運動能力[8-9]。

圖5各組小鼠在曠場中心停留、探索時間(對照組為C，磁聲刺激組為M)

Fig5Durationsofmicestayatthecenterofopen-field(C:controlgroup，M:TMASgroup)

曠場實驗系統(tǒng)可以觀察研究動物進入開闊環(huán)境后的各種行為，以此評價實驗動物在新異環(huán)境中的自主探究行為。

圖5中實驗結果表明，磁聲刺激組小鼠在主動探索學習能力方面和運動能力方面顯著高于對照組。僅從行為學的結果來看，磁聲耦合刺激對腦海馬區(qū)灰質(zhì)神經(jīng)確實有一定的改善作用。

3.2 PD模型小鼠的TMAS實驗結果

刺激結束后2 d，即開始刺激后的第12 d，對各組小鼠進行腦海馬區(qū)突觸活性的長時程增量(LTP)和去長時程增量(DP)電生理檢測[10]。

圖6各組PD小鼠LTP與DP結果(對照組為PC，磁聲耦合刺激組為PM)

Fig6ResultsofLTPandDPcollectedfromdifferentgroup(C:controlgroup，M:TMASgroup)

海馬突觸活性的長時程增強作為突觸可塑性的研究模型，與動物的學習記憶能力有著十分直接的聯(lián)系，在圖6中記錄的興奮性突觸后場電位(field excitatory postsynaptic potential，fEPSP)可以看出，在給予海馬區(qū)神經(jīng)突觸高頻節(jié)律刺激(TBS)之后，成功誘發(fā)出LTP，并且磁聲組模型鼠的fEPSP的增強速率明顯高于對照組。在給予低頻刺激(LFS)后，引起DP后，磁聲刺激組fEPSP回升速率較快。

上述結果均表明經(jīng)顱磁聲耦合刺激可以有效地調(diào)節(jié)PD模型鼠海馬區(qū)黑質(zhì)神經(jīng)，使其突觸活性及可塑性提高，從而提高學習與記憶能力[11]。

3.3 動物實驗結果的討論及分析

經(jīng)顱磁聲刺激本質(zhì)上是一種聚焦電刺激。本研究由圖4、5、6可知，利用經(jīng)顱磁聲耦合刺激在小鼠腦黑質(zhì)區(qū)作用10 d后，無論健康鼠還是PD模型鼠，其運動功能以及學習記憶能力均得到改善，改善的效果為TMAS組優(yōu)于對照組。初步證明了TMAS技術對小動物經(jīng)顱聚焦刺激的有效性。

本實驗中，由于TMAS技術中同時產(chǎn)生超聲刺激和磁聲耦合電刺激的神經(jīng)刺激，作用的效果可能僅由電刺激作用直接引起，也可能是由超聲刺激的輻射力效應間接引起，還有可能是兩者共同作用的綜合效應。

在使用本系統(tǒng)的超聲信號進行TMAS時，實驗中小鼠顱內(nèi)瞬時聲壓達到3.1 MPa，系統(tǒng)中靜磁場的強度B0=0.3 T，Cs=1515 m/s，ρ=1028 kg/m3，σ=0.5 S/m[12]，根據(jù)磁聲耦合效應產(chǎn)生的電場與電流密度公式可以得出，其電場強度為0.597 V/m，電流密度為0.299 A/m2。由此可知，在現(xiàn)有實驗前提下，實際刺激中在目標神經(jīng)區(qū)域產(chǎn)生的電場強度遠小于經(jīng)典的直接電磁刺激技術，如TMS以及DBS，并未達到神經(jīng)動作電位閾值(參考文獻[13-15]，一般認為能引起神經(jīng)動作電位的閾值為100 V/m)，屬于閾下刺激。

經(jīng)顱聚焦超聲刺激(transcranial ultrasound stimulation,TUS)的機制[16-18]已經(jīng)被多次闡述，通過機械效應改變細胞離子通道閾值，進而影響神經(jīng)細胞活動。根據(jù)參考各課題組在TUS領域所做的研究，TUS中超聲參數(shù)的選擇更加注重的是超聲所攜帶的能量[19-20]，而非磁聲耦合電刺激中的聲壓。本實驗中所選用的超聲參數(shù)雖瞬時聲壓較高，但是實際占空比低，超聲所攜帶的平均能量較低，Ispta=63 mW/cm2，超聲能量十分微弱。

綜上論述，本研究開展動物實驗證明了TMAS的有效性。由在體動物實驗結果，我們初步認為，TMAS技術是結合了超聲刺激的力學機械效應與磁聲耦合電場的電學效應，其本質(zhì)上是在刺激靶區(qū)產(chǎn)生這兩種效應的復合效果。對于TMAS的作用效果及機制仍需更深入的探討，這也是我們未來的主要研究工作。

4 總結

本研究根據(jù)經(jīng)顱磁聲耦合刺激原理，搭建小動物TMAS實驗系統(tǒng)，進行小動物在體實驗，刺激后的行為學及電生理結果驗證了TMAS在在體動物上可有效改善運動功能，提高神經(jīng)突觸活性，并基于動物實驗結果分析及討論了TMAS的作用機制。本研究的結果對TMAS的在體應用有一定的參考價值，為進一步分析TMAS作用于神經(jīng)的實際效果機制打下了基礎。