Slug過表達(dá)對口腔鱗癌Tca8113細(xì)胞侵襲性的影響

林思思，王舒儀，孫旺，施更生

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬臺州醫(yī)院 口腔科，浙江 臺州 317000）

口腔鱗癌是亞洲人頭頸部腫瘤中最常見的腫瘤之一[1]，雖然近幾十年來其治療手段不斷增加，包括放化療的應(yīng)用，使得口腔鱗癌的治療不再局限于手術(shù)切除，但是由于局部侵襲和早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，其治療效果仍不太理想，且5年生存率只有50%左右[2]。因此，口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制及尋求腫瘤中特定的分子標(biāo)志物以便能早期確診和早期治療已成近年來研究的熱點(diǎn)。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial to mesenchymal transitions，EMT）與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲有密切聯(lián)系，即在某種特定情況下，腫瘤上皮細(xì)胞會發(fā)生一系列變化，會失去上皮細(xì)胞的特性而獲得間質(zhì)細(xì)胞移動的能力[3]。腫瘤轉(zhuǎn)移的過程中EMT的發(fā)生往往伴隨著腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位沿血管、淋巴管等途徑向其他部位繼續(xù)生長[4]，EMT的過程受多種細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，如E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）和Slug均參與其中[3]。E-cadherin是跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)糖蛋白家族中的一員，與鈣依賴性的細(xì)胞黏附有關(guān)，在胚胎發(fā)育和器官形成中起重要作用[5]，Vimentin作為中間絲纖維蛋白家族成員，參與構(gòu)成細(xì)胞骨架，主要由間質(zhì)來源的細(xì)胞表達(dá)，其在正常上皮細(xì)胞中不表達(dá)，因此Vimentin可作為EMT的分子標(biāo)志物。Slug是Snail鋅指家族的轉(zhuǎn)錄因子之一，與原腸胚形成和中胚層形成有關(guān)，同時(shí)還涉及細(xì)胞分化、細(xì)胞移動和細(xì)胞凋亡[6-8]。本研究通過對Tca8113細(xì)胞轉(zhuǎn)染Slug過表達(dá)質(zhì)粒，觀察Slug過表達(dá)對口腔鱗癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響，從而為臨床篩選藥物提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 口腔鱗癌細(xì)胞株Tca8113細(xì)胞來源于臺州醫(yī)院恩澤公共科研平臺，GV141/Slug和GV141質(zhì)粒購自上海吉凱基因科技有限公司，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購自上海碧云天科技有限公司，RMPI1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，Trizol裂解液購自日本TAKARA公司，F(xiàn)S SYBR Green Master購自上海Rocge公司，Revert Aid Firat Strand cDNA Synthesia Kit購自美國Femrengtas公司，引物購自上海生工生物技術(shù)有限公司，兔抗人Slug單抗和Vimentin單抗購自美國CST公司，兔抗人E-cadherin多克隆抗體購自美國Abcam公司，二抗羊抗兔購自美國Biosharp公司。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)染口腔鱗癌Tca8113細(xì)胞：口腔鱗癌Tca8113接種于6孔板，溫箱培養(yǎng)24 h細(xì)胞貼壁匯合度達(dá)到80%～90%時(shí)，用lipofectamine6000轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞分為3組：空白對照組（Control組）細(xì)胞不加質(zhì)粒載體；轉(zhuǎn)染目的質(zhì)粒組，即GV141/Slug組；轉(zhuǎn)染空載體組，即GV141組。將3組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)有無熒光表達(dá)。

1.2.2 熒光定量PCR檢測：將3組貼壁細(xì)胞消化離心后，裂解，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，將反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA，采用SYBR Green嵌合熒光定量PCR法，以GADPH為內(nèi)參檢測3組細(xì)胞Slug、E-cadherin和Vimentin mRNA的含量，其中20 μL反應(yīng)體系為：1 μL cDNA、0.25 μL上游引物、0.25 μL下游引物、8.5 μL ddH2O、10 μL SYBR Green Q-PCR Supermix，反應(yīng)條件為：預(yù)變性50 ℃ 2 min，95 ℃10 min，循環(huán)階段95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，該反應(yīng)在實(shí)時(shí)熒光定量儀ABI7500上進(jìn)行。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.2.3 Western blot檢測：將轉(zhuǎn)染后的3組細(xì)胞溫箱培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用PBS配制的5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，將封閉過的PVDF膜稍微瀝干后，放入干凈的雜交袋，以Slug和Vimentin的一抗比例為1∶1 000，E-cadherin以1∶10 000的比例，4 ℃搖床過夜，隔天PVDF膜用10% PBST漂洗，放入1∶10 000的羊抗兔二抗，室溫?fù)u動1～2 h，洗膜，ECL顯色，應(yīng)用ImageJ對Western blot結(jié)果的灰度值進(jìn)行分析。

1.2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：將轉(zhuǎn)染后的3組細(xì)胞培養(yǎng)48～72 h，待細(xì)胞長滿6孔板，用槍頭比著直尺，垂直劃痕，用PBS清洗細(xì)胞3遍，加入無血清培養(yǎng)基，放入37 ℃ CO2培養(yǎng)箱，按0、6、12、24 h取樣拍照。

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)：取Transwell小室放入24孔板中，基質(zhì)膠鋪板，水化，將細(xì)胞懸液中的細(xì)胞以1×105的密度按每孔200 μL分別接種于Transwell膜上，并在小室下方每孔加600 μL含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，取出小室，用棉簽擦去小室膜內(nèi)表面的細(xì)胞和基質(zhì)膠，4%多聚甲醛固定，考馬斯藍(lán)染色，每孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，顯微鏡下觀察穿過基質(zhì)膠膜底的細(xì)胞數(shù)，以穿過膜底的細(xì)胞數(shù)來表示腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染效率的檢測 細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，GV141/Slug和GV141組細(xì)胞均可見綠色熒光，表明質(zhì)粒均已轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)染率為50%～60%。見圖1。

圖1 GV141/Slug組和GV141組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后觀察到的熒光（×40）

2.2 3組細(xì)胞中Slug mRNA的表達(dá) GV141組與Control組比Slug mRNA表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.363）；GV141/Slug組與GV141組比Slug mRNA表達(dá)量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003）。見圖2。

圖2 3組細(xì)胞中Slug mRNA的相對表達(dá)量

2.3 3組細(xì)胞中Slug蛋白表達(dá) GV141組與Control組比Slug蛋白相對表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.492）；GV141/Slug組與GV141組比Slug蛋白相對表達(dá)量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.026）。見圖3。

圖3 3組細(xì)胞中Slug蛋白的相對表達(dá)量

2.4 3組細(xì)胞中E-cadherin和Vimentin mRNA的表達(dá)量 GV141組與Control組比E-cadherin mRNA表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.631）；GV141/Slug組與GV141組比E-cadherin mRNA表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.042）。GV141組與Control組比Vimentin mRNA表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.746）；GV141/Slug組與GV141組比Vimentin mRNA表達(dá)量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.031）。見圖4。

圖4 E-cadherin和Vimentin mRNA在3組細(xì)胞中的相對表達(dá)量

2.5 3組細(xì)胞中E-cadherin和Vimentin蛋白的相對表達(dá)量 GV141組與Control組比E-cadherin蛋白相對表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.902）；GV141/Slug組與GV141組比E-cadherin蛋白相對表達(dá)量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.013）。GV141組與Control組比Vimentin蛋白相對表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.882）；GV141/Slug組與GV141組比Vimentin蛋白相對表達(dá)量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.025）。見圖5。

2.6 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果 GV141組細(xì)胞在24 h后的愈合距離與Control組細(xì)胞比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.463）；GV141/Slug組細(xì)胞在24 h后的愈合距離與GV141組細(xì)胞比較明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001）。見圖6。

2.7 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果 GV141組細(xì)胞24 h穿過小室的細(xì)胞數(shù)與Control組比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.951），GV141/Slug組細(xì)胞24 h穿過小室的細(xì)胞數(shù)較GV141組增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.042）。見圖7-8。

圖5 E-cadherin和Vimentin蛋白在3組細(xì)胞中的相對表達(dá)量

圖6 3組細(xì)胞24 h愈合的距離

圖7 3組細(xì)胞24 h穿過小室的細(xì)胞數(shù)（×40）

3 討論

口腔鱗癌預(yù)后較差，局部侵襲和淋巴結(jié)的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是不利于口腔鱗癌預(yù)后的重要因素[9]，因此，抑制腫瘤細(xì)胞的局部侵襲和淋巴結(jié)的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移成為提高口腔鱗癌預(yù)后效果的關(guān)鍵，但是目前研究仍未尋找出有效的機(jī)制。最近研究表明腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與EMT密切相關(guān)[10]，在某些因素的調(diào)節(jié)下，上皮細(xì)胞會向間質(zhì)細(xì)胞的方向改變，包括細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞間的黏附能力和細(xì)胞遷移能力等[11]。E-cadherin作為上皮細(xì)胞的黏附分子，由CDH1基因編碼，通過細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的鈣依賴性地與細(xì)胞間黏附，它的結(jié)構(gòu)域包括5個(gè)鈣黏蛋白重復(fù)、1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域以及1個(gè)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域[12]。在EMT的過程中，E-cadherin的含量降低時(shí)，細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，腫瘤細(xì)胞的侵移能力增強(qiáng)[13]，因此E-cadherin表達(dá)缺失與腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)密切相關(guān)。Vimentin可作為EMT的分子標(biāo)志物之一，已被證實(shí)在多種惡性腫瘤如低分化前列腺癌、乳腺癌等中高表達(dá)，并且這種高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、侵襲能力密切相關(guān)。Slug作為鋅指家族的轉(zhuǎn)錄因子之一，有高度保守的C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域，是EMT的重要標(biāo)志物，在具有高度侵襲性的腫瘤中均有發(fā)現(xiàn)，與胃癌[14]、胸腺瘤[15]等腫瘤的不良預(yù)后密切相關(guān)，而Slug在許多惡性腫瘤中的表現(xiàn)與E-cadherin蛋白的表現(xiàn)相反，多呈上調(diào)的趨勢[15-16]。

圖8 3組細(xì)胞24 h穿過小室的細(xì)胞數(shù)

研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中Slug可抑制E-cadherin基因的表達(dá)。SHENG等[17]通過轉(zhuǎn)染cDNA發(fā)現(xiàn)在未分化甲狀腺癌中Slug可抑制E-cadherin基因的表達(dá)，為未分化甲狀腺癌的靶向治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。HAJRA等[18]通過轉(zhuǎn)染質(zhì)粒發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中Slug可通過識別結(jié)合E-cadherin啟動子中的E-box元件來抑制E-cadherin基因的表達(dá)。XIE等[19]發(fā)現(xiàn)在前列腺癌中，Slug基因可通過p19Arf來抑制E-cadherin的表達(dá)。而目前國內(nèi)關(guān)于EMT、Slug和E-cadherin在口腔鱗癌中的研究仍然較少，鄭彩云等[20]從蛋白層面，王舒儀等[21]從基因?qū)用娣謩e研究證明在口腔鱗癌細(xì)胞中Slug可調(diào)控E-cadherin，參與了EMT的發(fā)展，但體外研究仍較少見。

本研究選用口腔鱗癌Tca8113細(xì)胞為研究對象，構(gòu)建帶熒光使Slug基因過表達(dá)的質(zhì)粒和空載體質(zhì)粒，并設(shè)置空白對照組，將目的質(zhì)粒和空載體質(zhì)粒分別用Lipo6000轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，通過檢測Slug mRNA和蛋白的表達(dá)情況來檢測轉(zhuǎn)染效率，并檢測EMT相關(guān)的E-cadherin和Vimentin的mRNA和蛋白表達(dá)量，最后用劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)來檢測Slug基因過表達(dá)對口腔鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力的影響。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染Slug過表達(dá)質(zhì)粒和空載體質(zhì)粒的Tca8113細(xì)胞均可觀察到綠色熒光，其表達(dá)率在50%～60%，且轉(zhuǎn)染目的質(zhì)粒的Tca8113細(xì)胞其E-cadherin的mRNA和蛋白表達(dá)量較其他2組明顯減少，與此同時(shí)，該細(xì)胞組轉(zhuǎn)移和侵襲能力較其他2組有所增強(qiáng)。這一研究結(jié)果和在其他腫瘤中的發(fā)現(xiàn)相同，即Slug基因與E-cadherin基因存在負(fù)相關(guān)，并且本研究發(fā)現(xiàn)Slug基因高表達(dá)可促使EMT的發(fā)生。為更加完善進(jìn)一步了解，未來還應(yīng)探求在口腔鱗癌中調(diào)控Slug的相關(guān)機(jī)制及Slug誘導(dǎo)EMT發(fā)生的相關(guān)通路研究，以便早期抑制Slug基因的表達(dá)，阻斷EMT發(fā)展，開展口腔鱗癌靶向治療。