神經(jīng)營養(yǎng)因子-3聯(lián)合全反式維甲酸與β-巰基乙醇誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化效果比較

張杰，秦華麗，蔣明

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，浙江 溫州 325015；2.長(zhǎng)沙市婦幼保健院 耳鼻咽喉頭頸外科，湖南 長(zhǎng)沙 410007；3.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，湖南 長(zhǎng)沙 410013）

近年來骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）治療神經(jīng)退行性病變?nèi)找媸艿綄W(xué)者重視。BMSCs具有高度自我復(fù)制能力和多向分化潛能，且在適宜條件下能向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化[1]。目前最常見的誘導(dǎo)劑為神經(jīng)營養(yǎng)因子與化學(xué)制劑。本研究比較堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）預(yù)誘導(dǎo)后，再用神經(jīng)營養(yǎng)因子-3（neurotrophin-3，NT-3）聯(lián)合全反式維甲酸（retinoic acid，RA）與β-巰基乙醇（beta-mercaptoethanol，β-BME）進(jìn)行分步誘導(dǎo)的方法來體外誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的效果差異。

1 材料和方法

1.1 材料 澳洲胎牛血清、0.25%胰酶-0.02%EDTA、青鏈霉素購自美國Gibco公司；PE anti-rat CD29、CD90、CD45、IgG1購自美國BioLegend公司；β-BME、bFGF、RA、NT-3購自美國PeProtech公司；Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）購自上海碧云天公司；L-DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；大鼠抗山羊神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron-specific endase，NSE）購自武漢博士德公司；4～6周齡，40～60 g雄性SD大鼠購自中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物許可證號(hào)為SYXK（湘）2014-0013。

1.2 方法

1.2.1 分離培養(yǎng)大鼠BMSCs：用腹腔注射水合氯醛麻醉后，無菌條件下取大鼠股骨和脛骨，用2 mL注射器抽取含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓，離心去上清，以1×105個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種于25 cm2細(xì)胞透氣培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置于飽和CO2，濕度5%，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。按照8 h首次換液，后3 d換液1次的方法，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后傳代。每日在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.2.2 BMSCs表面標(biāo)記分子的鑒定：待P3代BMSCs長(zhǎng)滿瓶底90%以上時(shí)，胰酶消化后移入15 mL離心管內(nèi)，1 000 r/min，離心5 min，PBS重懸細(xì)胞，重復(fù)3次，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度到1×106個(gè)/mL，分別加入抗體試劑PE-CD29、PE-CD90、PE-CD45各3管，及1管PEIgG1，置冰上避光孵育30 min。4 ℃，2 000 r/min，離心5 min，棄上清，PBS重懸，重復(fù)3次，洗凈未結(jié)合的抗體。每管加入200 μL PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，重復(fù)3次，CELLQUEST軟件分析結(jié)果。

1.2.3 體外誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化：取P3代BMSCs胰酶消化后，按8×103個(gè)/mL的密度接種于預(yù)先放有消毒蓋玻片的6孔板內(nèi)制備細(xì)胞爬片，加完全培養(yǎng)液2 mL，待細(xì)胞60%～70%融合。用預(yù)誘導(dǎo)液2 mL（98% L-DMEM+2% FBS+10 ng/mL bFGF[2]）誘導(dǎo)24 h后，隨機(jī)分為A組（NT-3+RA，換用98% LDMEM+2% FBS+20 ng/mL NT-3+0.5 μmol/L RA[3]）和B組（β-BME，換用98% L-DMEM+2% FBS+1 mmol/L β-BME[3]），2組各用2 mL誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)1 h、5 h、24 h、7 d、14 d、21 d后于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.2.4 細(xì)胞免疫熒光鑒定：取細(xì)胞爬片用PBS洗3次，5 min/次，再用4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗3次，5 min/次，再用0.5% Triton-X100浸泡打孔15 min，PBS洗2次，5 min/次，后用封閉液封閉，4 ℃冰箱過夜。加已用封閉液稀釋的一抗200 μL，37 ℃避光孵育3 h。用含0.1% Triton-X100的PBS漂洗4次，5 min/次。加入已用PBS稀釋的二抗200 μL，37 ℃避光孵育1 h。用含0.1% Triton-X100的PBS漂洗4次，5 min/次。用ddH2O按1∶2 000稀釋的DAPI，避光染色5 min；PBS漂洗4次，5 min/次，甘油封片，在倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。隨機(jī)選擇10個(gè)非重疊視野，分別計(jì)算誘導(dǎo)后1 h、5 h、24 h、7 d、14 d、21 d的NSE陽性率（NSE染色陽性率=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。正態(tài)分布計(jì)量資料用表示，同組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)比較用單因素重復(fù)測(cè)量方差分析，相同時(shí)間點(diǎn)2組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)結(jié)果 剛接種的BMSCs呈圓形，大部分懸浮在培養(yǎng)液中。各個(gè)時(shí)間段的BMSCs形態(tài)見圖1。

2.2 BMSCs表面標(biāo)志物鑒定結(jié)果 由流式細(xì)胞儀檢測(cè)，CD45 PE陽性率分別為8.34%、6.95%、6.94%，平均7.41%；CD90 PE陽性率分別為99.98%、99.98%、99.98%，平均99.98%；CD29 PE陽性率分別為98.21%、98.32%、97.20%，平均97.91%；故CD29 PE、CD90 PE為陽性表達(dá)，CD45 PE為陰性表達(dá)。見圖2。

圖1 BMSCs原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)結(jié)果（×100）

圖2 BMSCs表面標(biāo)志物流式鑒定結(jié)果

2.3 BMSCs誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 A組加NT-3+RA誘導(dǎo)1 h，少數(shù)胞體有軸突樣改變，見圖3A；誘導(dǎo)5 h細(xì)胞漩渦樣生長(zhǎng)，部分胞體軸突明顯延伸，較前增多，并出現(xiàn)少許多角形細(xì)胞，見圖3B；誘導(dǎo)24 h細(xì)胞數(shù)量增多，出現(xiàn)少許胞體變圓的細(xì)胞，見圖3C；誘導(dǎo)至7 d大多數(shù)細(xì)胞胞體變圓，可有雙觸角或多觸角細(xì)胞，可呈多角形，內(nèi)可見2～3個(gè)核仁。胞間漩渦狀趨勢(shì)逐漸消失，部分細(xì)胞間相互連接交織成橋梁狀，見圖3D；誘導(dǎo)至14 d細(xì)胞突起較前明顯延長(zhǎng)，并出現(xiàn)一、二級(jí)分支，形成雙級(jí)或多極的突起，突起間互相連接，呈網(wǎng)絡(luò)狀，見圖3E；誘導(dǎo)21 d，仍可見少許存活的神經(jīng)元樣細(xì)胞，其連接的突起變細(xì)，細(xì)胞橋梁趨向斷離，其中部分細(xì)胞出現(xiàn)顆粒及空泡，呈死亡趨勢(shì)，見圖3F。B組加β-BME誘導(dǎo)1 h，部分胞體呈短棒形或圓形，見圖4A；5 h時(shí)見胞體可呈雙觸角或多觸角樣改變，有些亦見雙核仁，部分細(xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)顆粒和空泡，見圖4B；24 h時(shí)見懸浮的細(xì)胞碎片增多，大部分細(xì)胞胞體破裂，趨向老化死亡，見圖4C。

圖3 BMSCs經(jīng)NT-3+RA誘導(dǎo)后各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化（×100）

2.4 2組BMSCs的NSE表達(dá)情況比較 免疫熒光結(jié)果示，A組誘導(dǎo)分化24 h和B組誘導(dǎo)分化5 h后NSE均陽性表達(dá)，見圖5。

圖4 BMSCs經(jīng)β-BME誘導(dǎo)后細(xì)胞學(xué)形態(tài)變化（×100）

圖5 2組NSE免疫熒光鑒定結(jié)果（×200）

B組在誘導(dǎo)24 h后大部分細(xì)胞死亡。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，A組誘導(dǎo)分化7 d后達(dá)到高峰，NSE表達(dá)率為（81.92±5.02）%，與其他時(shí)間點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。B組誘導(dǎo)5 h后NSE表達(dá)最高，與1 h比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。在1 h和5 h B組NSE表達(dá)率高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

3 討論

BMSCs起源于中胚層組織，是一種具有多分化潛能的非造血干細(xì)胞，在一定條件下可以被誘導(dǎo)分化為外胚層起源的神經(jīng)元樣細(xì)胞。已有研究發(fā)現(xiàn)BMSCs分化的神經(jīng)元樣細(xì)胞能修復(fù)受損的神經(jīng)[4]，并且移植后能為自身修復(fù)提供支架[5]，因此BMSCs可以作為治療神經(jīng)退行性疾病的理想種子細(xì)胞。

隨著研究的不斷深入，研究者發(fā)現(xiàn)了很多種BMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的誘導(dǎo)劑，主要有：RA、抗氧化劑（β-BME[3]、褪黑素、丁羥茴醚、二甲亞砜等）、神經(jīng)營養(yǎng)因子及生長(zhǎng)因子[3]（NT-3和bFGF）、中藥[6]等。但其誘導(dǎo)機(jī)制仍然不明確。其中，RA能催化胚胎干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元，能調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖及分化，有很強(qiáng)的誘導(dǎo)劑功能[7]，能和生長(zhǎng)因子聯(lián)合，增加神經(jīng)細(xì)胞的合成[8]。β-BME為強(qiáng)抗氧化劑，可以通過提高胞內(nèi)cAMP水平[9]，進(jìn)一步誘導(dǎo)BMSCs轉(zhuǎn)變成神經(jīng)細(xì)胞樣形態(tài)。bFGF是一種具有多種功能的多肽生長(zhǎng)因子，可以促使BMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化[1]，參與分化啟動(dòng)，細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育和組織損傷的修復(fù)[10]，可能與wnt信號(hào)通路相關(guān)[11]。而NT-3作為神經(jīng)營養(yǎng)素家族中的一員，在誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中非常重要[12]。

為了尋找BMSCs的最佳誘導(dǎo)方案，獲得更佳的誘導(dǎo)結(jié)果，研究者采用了各種研究方案去提高誘導(dǎo)率，但是不同的誘導(dǎo)劑，其轉(zhuǎn)化效率大為不同，如：FGF-RA方案[13]陽性分化率約為40%，而BME-RA方案[14]的分化率約為20%。而且不同研究者可能因操作手法的差別，即使采用相同的方法也可能得出不同的誘導(dǎo)率[15]。此外，DEZAWA等[16]的研究表明聯(lián)合誘導(dǎo)分化高于單獨(dú)誘導(dǎo)分化，HERMANN等[17]的研究結(jié)果則證實(shí)分步誘導(dǎo)優(yōu)于單一步驟誘導(dǎo)，且能夠獲得較高的分化效率。

表1 BMSCs誘導(dǎo)分化成神經(jīng)元樣細(xì)胞NSE陽性表達(dá)率（，%）

表1 BMSCs誘導(dǎo)分化成神經(jīng)元樣細(xì)胞NSE陽性表達(dá)率（，%）

與同組內(nèi)其他時(shí)間點(diǎn)比：aP＜0.01；與A組同時(shí)間點(diǎn)比：bP＜0.01

組別 n 1 h 5 h 24 h 7 d 14 d 21 d A組 3 1.60±0.44 5.53±1.21 18.55±0.55 81.92±5.02a 68.98±2.41 15.72±1.90 B組 3 6.09±0.76b 15.41±2.11ab — — — —

劉謙虛[18]的研究認(rèn)為RA誘導(dǎo)穩(wěn)定表達(dá)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的BMSCs表達(dá)NSE陽性率高于單獨(dú)的RA誘導(dǎo)，且單用RA與不加誘導(dǎo)劑的空白對(duì)照組無明顯變化，故本研究采取分步誘導(dǎo)+聯(lián)合誘導(dǎo)，bFGF預(yù)誘導(dǎo)24 h后，再換用NT-3+RA及β-BME誘導(dǎo)，探索相對(duì)較好的誘導(dǎo)方案。結(jié)果發(fā)現(xiàn)2組均能誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化，但是NT-3+RA組細(xì)胞存活時(shí)間較β-BME組顯著延長(zhǎng)，故后期誘導(dǎo)分化率較β-BME組高，但β-BME組短期誘導(dǎo)分化率較高。這些結(jié)果與前人研究基本一致。有學(xué)者認(rèn)為[19]化學(xué)藥物可導(dǎo)致BMSCs的肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)斷裂，并引起細(xì)胞質(zhì)回縮，可有似神經(jīng)元細(xì)胞樣伸出軸突的假象，這也可能是β-BME誘導(dǎo)后細(xì)胞生存時(shí)間短的原因。而NT-3+RA組細(xì)胞存活時(shí)間長(zhǎng)，而且后期分化率高，可能與NT-3的神經(jīng)營養(yǎng)作用有關(guān)。故NT-3+RA方案較β-BME方案更佳。但考慮到誘導(dǎo)劑還存在可能的致畸性[3]，而且移植的細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)存活時(shí)間較短暫[15]，故誘導(dǎo)的BMSCs能否通過移植來治療神經(jīng)退化性疾病仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。