內(nèi)皮細胞特異性分子-1對內(nèi)毒素致小鼠急性肺損傷時炎癥反應的影響

張曉隆，吳海亞，陳潔，吳成云

（溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，浙江 溫州 325027，1.重癥醫(yī)學科；2.呼吸內(nèi)科）

內(nèi)毒素性急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征（acute lung injury/acute respiratory distress syndrome，ALI/ARDS）是臨床常見急危重癥，病死率高[1]。其主要病理特征是肺組織大量中性粒細胞浸潤和肺泡-毛細血管屏障損傷所致的肺水腫。目前認為促炎介質的過度釋放導致的炎癥失控是內(nèi)毒素性肺損傷的主要發(fā)病機制。在此理論基礎上發(fā)展而來的防治策略，主要通過抑制關鍵炎癥介質的表達和效應，防止過度炎癥反應[2-3]。雖然有大量研究[4-5]

顯示，從不同角度對ALI的防治取得了一定成效，但其效果仍然不夠理想。因此，尋找新的有效治療手段，改善內(nèi)毒素性ALI是目前亟待解決的問題。目前，國內(nèi)外在內(nèi)皮細胞特異性分子-1（Endocan）的研究主要局限于其參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和血管生成等，對炎癥反應時黏附分子介導的細胞遷移及特異性免疫應答的報道甚少[6]。本研究采用霧化吸入脂多糖（lipopolysac charides，LPS）建立小鼠內(nèi)毒素性ALI模型，使用外源性Endocan來干預小鼠內(nèi)毒素性ALI的變化，觀察其對內(nèi)毒素性肺損傷的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與主要試劑 SPF級C57BL/6雄性小鼠30只，平均體質量（20±2）g，由溫州醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK（浙）2015-0001。LPS購自美國Sigma公司，Endocan重組蛋白購自美國CLOUD-CLONE CORP公司，髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；細胞間黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）購自美國R&D公司；腫瘤壞死因子-α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒購自法國Diaclone公司。

1.2 模型復制與分組 將30只小鼠按隨機數(shù)字表法分為Control組、LPS組和Endocan組，每組10只。LPS霧化吸入法建立小鼠ALI模型，自動霧化吸入裝置啟動后，空氣壓縮機將壓縮后的空氣送到裝有LPS濃度為400 μg/mL的塑料管中，使LPS成為霧狀液體，接入裝有小鼠的密閉容器中，持續(xù)霧化30 min，Control組霧化吸入相同時間和等量的0.9%氯化鈉溶液。Endocan組于實驗前30 min腹腔注射Endocan 0.25 mg/kg，Control組、LPS組使用等量0.9%氯化鈉溶液腹腔注射。

1.3 肺組織的檢查 剪取右肺上葉小鼠肺組織稱質量，然后放入50 ℃烤箱中72 h，再次稱質量，計算肺濕/干重比（W/D），以評價肺組織的水腫程度?；瘜W比色法測定肺組織中MPO活性，具體操作嚴格按試劑盒操作說明進行。取左肺門旁0.1 cm×0.1 cm×0.1 cm大小的組織2～3塊，4%多聚甲醛固定，行石蠟包埋、切片，Power tome-XL型超薄切片機切片，日立H-7500型透射電鏡觀察。

1.4 TNF-α、IL-6和ICAM-1的檢測 造模24 h后，予10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射，開胸，結扎小鼠左主支氣管，取左肺。頸部分離氣管進行插管后，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）灌洗右肺3次，1 mL/次，回收率大于80%。將回收的支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）離心后分別獲得上清。用ELISA法檢測TNF-α、IL-6和ICAM-1的濃度。

1.5 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理。數(shù)據(jù)均以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，方差不齊采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 肺組織W/D和MPO含量的變化 LPS組小鼠肺組織W/D較Control組升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），表明存在肺水腫。Endocan組小鼠肺組織W/D較LPS組降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），提示Endocan能減輕ALI時肺的含水量。LPS組小鼠肺組織中的MPO活性較Control組明顯增高（P＜0.01），Endocan組小鼠肺組織中MPO活性較LPS組減低（P＜0.01）。見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織W/D和MPO的變化

2.2 肺組織超微結構改變 Control組：毛細血管內(nèi)皮細胞結構正常，連接緊密，基底膜完整；I型肺泡上皮細胞正常；II型肺泡上皮細胞結構完整；線粒體嵴清楚，微絨毛無減少，板層小體數(shù)量未見改變（見圖2A）。LPS組：毛細血管內(nèi)皮細胞腫脹，連續(xù)性中斷，基底部變窄，呈拱橋狀或高柱狀向腔內(nèi)突出，部分脫落；I型肺泡上皮細胞內(nèi)吞飲小泡較少；II型肺泡上皮細胞表面微絨毛稀疏，線粒體腫脹明顯，板層小體稀少空泡化，肺泡隔水腫，肺泡隔及毛細血管內(nèi)見大量以中性粒細胞為主的炎癥細胞附著（見圖2B）。Endocan組：毛細血管和肺泡結構有所改善，毛細血管內(nèi)炎癥細胞減少，染色質分布較均勻；I型肺泡上皮細胞內(nèi)吞飲小泡較多；II型肺泡上皮細胞表面微絨毛及板層小體增多；肺泡隔輕度水腫（見圖2C）。

2.3 小鼠BALF中TNF-α、IL-6和ICAM-1的水平 與Control組比，LPS組TNF-α、IL-6和ICAM-1水平均明顯升高（P＜0.01），經(jīng)過Endocan干預后，Endocan組TNF-α、IL-6和ICAM-1水平均較LPS組降低（P＜0.01）。見圖3。

圖3 各組小鼠BALF中TNF-α、IL-6和ICAM-1水平的變化

3 討論

ALI/ARDS是由肺內(nèi)外因素導致的肺組織病理損傷、肺泡血管屏障破壞、炎癥反應和肺臟生理功能異常。肺是膿毒血癥的易損器官之一，內(nèi)毒素促進大量炎癥細胞因子產(chǎn)生，引起肺內(nèi)中性粒細胞（polymorphonuclear，PMN）的聚集和激活，是造成ALI的重要原因。本研究觀察到LPS組小鼠肺組織W/D明顯增高，電鏡下觀察到肺毛細血管內(nèi)皮、I型肺泡上皮細胞、II型肺泡上皮細胞、線粒體和板層小體等肺超微結構損傷改變，肺泡隔及毛細血管內(nèi)見大量以PMN為主的炎癥細胞附著；與Control組比，肺泡結構損傷嚴重，間質水腫、炎性細胞浸潤和出血等情況均顯著增加，進一步證實霧化吸入LPS致小鼠ALI的模型有效可行。

目前炎癥反應機制在內(nèi)毒素性肺損傷中的研究越來越受到大家的關注，ALI是由于機體炎癥反應失控導致的綜合征，表現(xiàn)為促炎因子的明顯升高，抑炎因子的下降以及凝血纖溶系統(tǒng)失衡為特征。參與這些炎癥反應的包括PMN、血管內(nèi)皮細胞、單核巨噬細胞、淋巴細胞等，其中PMN、單核巨噬細胞等在ALI中發(fā)揮了重要作用。在內(nèi)毒素性肺損傷時，PMN聚集、活化和釋放炎性介質，其關鍵為PMN通過ICAM-1與內(nèi)皮細胞相互黏附，介導炎癥反應導致釋放多種細胞因子，引起免疫應答形成網(wǎng)絡連鎖反應，使血管內(nèi)皮細胞受損導致穩(wěn)態(tài)失衡[7]，內(nèi)皮功能的快速變化激活凝血系統(tǒng)，微血栓形成引發(fā)血液流變學的變化，導致組織缺血缺氧引起器官衰竭[8]。本研究顯示，霧化吸入LPS后小鼠血清TNF-α、IL-6、ICAM-1、MCP-1水平均顯著升高，我們推測毛細血管內(nèi)皮細胞損傷后，分泌大量黏附分子和趨化因子等，從而促進PMN、巨噬細胞等炎癥細胞向炎癥部位聚集，在內(nèi)毒素性肺損傷中發(fā)揮重要作用，與文獻報道[9]一致。

Endocan又稱內(nèi)皮細胞特異性分子-1，在正常人體內(nèi)主要由肺、腎臟血管內(nèi)皮細胞分泌[10]。Endocan是淋巴細胞相關抗原-1（lymphocyte function associated antigen-1，LFA-1）的一個特異性配體，它可以與LFA-1結合，通過對LFA-1與ICAM-1競爭性抑制作用，阻止PMN在內(nèi)皮細胞黏附[11]，Endocan具有非常廣泛的生物學活性，可能通過多種信號傳導途徑，參與體內(nèi)黏附分子介導的細胞遷移、細胞黏附、炎癥反應、血管生成、促進細胞增殖和分化、腫瘤的發(fā)生與發(fā)展等過程[12-13]。過去大量研究表明，Endocan與人類多種惡性腫瘤密切相關[14-16]，新近有研究發(fā)現(xiàn)，在ARDS早期Endocan水平升高反映病情的嚴重程度，并預測不良的演化，如死亡或對機械通氣的長期依賴，提示Endocan可能成為預測其發(fā)生率和病死率的重要指標[17-19]。MIKKELSEN等[20]報道了嚴重創(chuàng)傷后ALI患者血清Endocan沒有升高，而是處在低水平狀態(tài)，推斷Endocan的分泌不足導致肺組織過度炎癥反應使肺損傷加重。本研究采用外源性Endocan來干預小鼠內(nèi)毒素性肺損傷，結果發(fā)現(xiàn)與LPS組比，Endocan組小鼠肺組織W/D和MPO活性降低（P＜0.01），BALF中TNF-α、IL-6和ICAM-1水平均降低（P＜0.01），肺組織超微結構改變顯著減輕。由此，我們認為Endocan能夠降低LPS誘導的小鼠ALI時MPO活性和ICAM-1的水平，推斷Endocan可能通過調控PMN從血液到組織的遷移及特異性免疫應答過程，抑制LFA-1/ICAM-1的相互結合，從而阻止PMN通過血管壁隨意遷移，減少PMN向炎癥部位聚集，減輕肺組織損傷，從而在內(nèi)毒素性肺損傷中起器官保護作用。

綜上所述，Endocan可減輕LPS誘導的ALI小鼠肺組織的炎癥反應，提示Endocan在ALI時具有保護作用。值得注意的是，Endocan的分泌不足或過度分泌均可導致組織器官的損傷，而Endocan分泌可能是炎癥反應過程中機體的負反饋調節(jié)，其過度分泌可導致機體免疫保護作用受到限制，繼而加重ALI，故Endocan在ALI中的作用機制有待于在以后的研究中進一步探索。