CCN1基因肺特異性條件敲除小鼠模型的構(gòu)建和鑒定

陳超蕾，裘丹萍，宋晨劍，吳登敏，于埡妮，陳成水

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，浙江 溫州 325015）

富半胱氨酸血管生成誘導(dǎo)因子61（cysteinerich angiogenesis inducing factor，CYR61），又稱(chēng)CCN1，起先被認(rèn)為是生長(zhǎng)因子刺激后引起上調(diào)的即刻早期基因，隨后確定是由細(xì)胞分泌，并在細(xì)胞外基質(zhì)蛋白與生長(zhǎng)因子之間起到媒介作用的多效分子，它通過(guò)與細(xì)胞表面整合素的銜接，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及遷移[1]。有研究表明CCN1與炎癥相關(guān)，是一種新的炎癥調(diào)節(jié)因子[2]。細(xì)菌[3]、病毒[4]、炎癥趨化因子[1]、細(xì)胞因子及生長(zhǎng)因子[5]可迅速誘導(dǎo)CCN1分泌。CCN1的過(guò)表達(dá)及外源性CCN1的加入可引起包括磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）通路[6]在內(nèi)的多條細(xì)胞通路的激活和多種目的基因表達(dá)上調(diào)，最終引起相應(yīng)的細(xì)胞應(yīng)答。CCN1可與細(xì)胞因子協(xié)同作用激活炎癥細(xì)胞并誘導(dǎo)血管生成，從而在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用。炎癥部位CCN1與其他炎癥因子的相互調(diào)控可影響參與炎癥、損傷修復(fù)和纖維化過(guò)程[7]的各種細(xì)胞功能。

鑒于以上研究結(jié)果，為了更好地研究CCN1在肺部炎癥系統(tǒng)中的作用，以及是否參與肺部炎癥的主要調(diào)控環(huán)節(jié)，有必要利用動(dòng)物模型加以深入研究。本研究旨在借助Cre-LoxP位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)，制備肺上皮細(xì)胞特異性CCN1基因敲除的小鼠，并以此為基礎(chǔ)進(jìn)一步在整體動(dòng)物水平研究CCN1在肺組織內(nèi)炎癥調(diào)控的作用及分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)CCN1flox/flox純合子小鼠由美國(guó)伊利諾伊大學(xué)芝加哥分校生物化學(xué)分子遺傳學(xué)部門(mén)惠贈(zèng)。Nkx2-1tm1.1（cre/ERT2）Zjh/J小鼠購(gòu)自南京大學(xué)南京生物醫(yī)藥研究院，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（蘇）2015-0001。小鼠引進(jìn)后置于溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房進(jìn)行飼養(yǎng)、繁殖及實(shí)驗(yàn)。室內(nèi)溫度在20～25 ℃，濕度在40%～70%。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑：即用型Taq酶PCR試劑盒（GK8005）購(gòu)自上海Generay公司，SYBR Green Realtime PCR Master Mix-Plus-（QPK-212）購(gòu)自日本TOYOBO公司，Anti-CCN1抗體（sc-13100，1∶50）購(gòu)自美國(guó)Santa公司，山羊抗兔抗體（B0015K122300，1∶500）購(gòu)自美國(guó)Biosharp公司；Anti-CCN1抗體（ab24448，1∶100）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，Anti-epcam抗體（NBP1-97812，1∶50）購(gòu)自美國(guó)Novus公司，驢抗大鼠抗體（ab150153，1∶1 000）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，驢抗兔抗體（R37119，1∶1 000）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（P0010）購(gòu)自上海碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)基因小鼠的繁殖及Cre+/-CCN1flox/flox小鼠品系的建立：CCN1flox/flox小鼠采用雌雄基因型均為CCN1flox/flox的轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行交配繁殖。Cre小鼠采用Cre重組酶雜合子和野生型C57BL/6小鼠進(jìn)行交配繁殖。通過(guò)雜交CCN1flox/flox與Cre+/-小鼠，繁殖生育F1子代，根據(jù)孟德?tīng)栠z傳定律，F(xiàn)1子代小鼠將有1/2的小鼠肺上皮細(xì)胞表達(dá)Cre重組酶即可得到Cre+/-CCN1flox/+小鼠及Cre-/-CCN1flox/+小鼠。隨即將異性Cre+/-CCN1flox/+與CCN1flox/flox小鼠進(jìn)一步雜交，根據(jù)孟德?tīng)栠z傳定律，F(xiàn)2子代小鼠（Cre+/-CCN1flox/flox、Cre+/-CCN1flox/+、Cre-/-CCN1flox/flox、Cre-/-CCN1flox/+）將有1/4小鼠同時(shí)具備Cre+/-與CCN1flox/flox，即為本研究目的小鼠。

1.2.2 轉(zhuǎn)基因小鼠鑒定：繁殖鼠生育子代，在子代小鼠7～10 d齡時(shí)采用剪腳趾法標(biāo)記子代并留取2～3 mm長(zhǎng)小鼠腳趾，浸泡至200 μL 50 mmol/L NaOH 95 ℃ 30 min，溶解完成后加入30 μL pH 8.0的1 mol/L Tris-HCl中和，12 000 r/min 4 ℃離心10 min吸取上清液，PCR對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行基因檢測(cè)。CCN1flox/flox上游引物：5’-TCCACCTGCCCCGCCG CCTG-3’，下游引物：5’-GGAGAAGGTTAAGATTCGCC-3’。Cre上游引物：5’-GCCTCCACTCAAGCCAATTA-3’，下游引物：5’-CCTGGCCCTGTCTGTACG-3’。采用PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行CCN1flox/flox序列和Cre序列的循環(huán)擴(kuò)增。CCN1flox/flox序列設(shè)置反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min、58 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。擴(kuò)增片段391 bp。Cre序列設(shè)置反應(yīng)條件為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s、55 ℃30 s、72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，擴(kuò)增片段284 bp。取PCR反應(yīng)終產(chǎn)物5～10 μL在1%瓊脂糖凝膠電泳，全自動(dòng)凝膠圖像系統(tǒng)分析成像并保存。

1.2.3 KO-CCN1誘導(dǎo)模型建立：飼養(yǎng)Cre+/-CCN1flox/flox（KO-CCN1組）、Cre-/-CCN1flox/flox（NC-CCN1組）及C57BL/6小鼠（WT組）至4～6周后，予腹腔注射他莫昔芬（75 mg/kg），連續(xù)3次，隔天注射。1～2周后麻醉處死本研究目的小鼠即Cre+/-CCN1flox/flox（KOCCN1組）與對(duì)照小鼠（NC-CCN1組及WT組），取出肺組織，右肺用于RT-PCR及Western blot檢測(cè)，左肺用于冰凍切片或石蠟切片制備。

1.2.4 KO-CCN1誘導(dǎo)模型的鑒定：留取小鼠部分肺組織，浸泡于200 μL 50 mmol/L NaOH 95 ℃30 min，溶解完成后加入30 μL pH 8.0的1 mol/L Tris-HCl中和，12 000 r/min 4 ℃離心10 min吸取上清液，進(jìn)行基因敲除的鑒定。上游引物F：5’-CAATA CACTTCTCTTGGCTAATAAAC-3’，下游引物R：5’-ATATTA AGGGTTATTGAATATGATCGG-3’。

1.2.5 RT-PCR檢測(cè)CCN1 mRNA表達(dá)水平：應(yīng)用Trizol法抽提肺組織的細(xì)胞RNA，以此為模板，借助反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒，通過(guò)PCR反應(yīng)反轉(zhuǎn)錄為cDNA，設(shè)計(jì)CCN1基因的RT-PCR反應(yīng)引物序列：上游引物：5’-AAAGGC AGCTCACTGAAG-3’，下游引物：5’-GCCGGTATTTCTTGAC AC-3’。應(yīng)用qPCR試劑盒，在RT-PCR儀上分析CCN1在小鼠肺組織中的表達(dá)水平。

1.2.6 免疫熒光觀察CCN1表達(dá)：左肺組織冰凍切片、固定、通透。濾紙吸除冰凍切片上多余液體后，滴加適量封閉液，5% BSA或2%山羊血清溶液室溫放置30 min。濾紙吸除冰凍切片上多余液體后，滴加適量Anti-CCN1抗體（1∶100）和Anti-epcam抗體（1∶50）4 ℃過(guò)夜。冰凍切片浸泡PBS溶液5 min，重復(fù)3次，洗去一抗。隨后濾紙吸除冰凍切片上多余液體后滴加適量Alexa Fluor 488驢抗大鼠二抗（1∶1 000）和Alexa Fluor 594驢抗兔二抗（1∶1 000），室溫放置30 min后，浸泡PBS溶液5 min，重復(fù)3次，洗去二抗。濾紙吸除冰凍切片上多余液體后，滴加適量DAPI染液（10 μg/mL）染色10 min后，浸泡PBS溶液5 min，重復(fù)2次，洗去DAPI染液。濾紙吸除冰凍切片上多余液體后，滴加一滴抗熒光衰減封片劑，蓋上蓋玻片置于熒光顯微鏡下檢測(cè)肺組織中CCN1表達(dá)定位及其水平。

1.2.7 免疫組織化學(xué)觀察CCN1表達(dá)：左肺組織石蠟切片、脫蠟、水化、阻斷、抗原修復(fù)并進(jìn)行通透。隨后濾紙吸除組織切片上多余液體，滴加適量封閉液，5% BSA或2%山羊血清溶液室溫放置30 min。濾紙吸除組織切片上多余液體后，滴加適量兔Anti-CCN1抗體（1∶50）4 ℃冰箱過(guò)夜或室溫放置1～2 h。組織切片浸泡PBS溶液5 min，重復(fù)3次，洗去一抗。濾紙吸除多余液體后，滴加HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1∶500），室溫或37 ℃放置30 min后，浸泡PBS溶液5 min，重復(fù)3次，洗去二抗。濾紙吸除組織切片上多余液體后，滴加適量DAB顯色液5～10 min，同時(shí)在顯微鏡下觀察顯色情況，根據(jù)情況及時(shí)停止反應(yīng)，自來(lái)水沖洗5 min。組織切片浸入蘇木素染液中染色5 min后，再滴加1%鹽酸乙醇溶液浸泡分化2～3 s，使用PBS緩沖液浸泡返藍(lán)3 min。染色、分化、返藍(lán)后均用自來(lái)水沖洗20 s。組織切片脫水透明，在載玻片上滴加適量中性樹(shù)脂后，蓋上蓋玻片，顯微鏡下檢測(cè)肺組織中CCN1表達(dá)水平。

1.2.8 Western blot檢測(cè)CCN1蛋白表達(dá)：應(yīng)用細(xì)胞裂解及蛋白抽提試劑盒從肺組織中提取總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度后，應(yīng)用Western blot法測(cè)定肺部細(xì)胞中CCN1蛋白的表達(dá)水平。全自動(dòng)凝膠圖像系統(tǒng)分析成像并保存。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用GraphPad Prism 6、Image Lab進(jìn)行數(shù)據(jù)記錄、提取、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及圖表繪制。計(jì)量資料以表示，2組間比較用LSD檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Cre+/-CCN1flox/flox小鼠繁殖及鑒定 雌性CCN1flox/flox與雄性Cre+/-小鼠合籠交配后繁殖生育F1子代，篩選出F1代Cre+/-CCN1flox/+小鼠。篩選出的雄性Cre+/-CCN1flox/+小鼠與雌性CCN1flox/flox小鼠繼續(xù)合籠繁殖出F2代小鼠，予以基因型鑒定后篩選出Cre+/-CCN1flox/flox小鼠及Cre-/-CCN1flox/flox小鼠，再將Cre+/-CCN1flox/flox小鼠及Cre-/-CCN1flox/flox小鼠按性別比例1∶1進(jìn)行合籠后交配繁育，可得1/2概率的Cre+/-CCN1flox/flox及1/2概率的Cre-/-CCN1flox/flox。其中Cre+/-CCN1flox/flox小鼠（3、5、6、9、10、12、16）即為本研究實(shí)驗(yàn)組，其他小鼠則為對(duì)照組（見(jiàn)圖1）。實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組小鼠進(jìn)行他莫昔芬注射后誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞Cre表達(dá)，對(duì)該細(xì)胞中CCN1基因進(jìn)行敲除，并予以PCR鑒定（見(jiàn)圖2），結(jié)果表明Cre+/-CCN1flox/flox小鼠（KO-CCN1組）經(jīng)他莫昔芬刺激后表達(dá)a和b 2條條帶，Cre-/-CCN1flox/flox小鼠（NC-CCN1組）經(jīng)他莫昔芬刺激后只表達(dá)a條帶不表達(dá)b條帶，以上結(jié)果證實(shí)Cre+/-CCN1flox/flox小鼠已構(gòu)建成功。

圖1 PCR鑒定Cre+/-CCN1flox/flox小鼠的電泳結(jié)果

圖2 敲除鑒定原理及PCR鑒定Cre+/-CCN1flox/flox小鼠他莫昔芬誘導(dǎo)后CCN1基因敲除結(jié)果

2.2 CCN1 mRNA在Cre+/-CCN1flox/flox小鼠肺組織中轉(zhuǎn)錄水平 KO-CCN1組小鼠使用他莫昔芬誘導(dǎo)Cre敲除CCN1基因后肺組織中CCN1轉(zhuǎn)錄水平較NC-CCN1組及WT組小鼠肺組織轉(zhuǎn)錄水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 使用他莫昔芬誘導(dǎo)后的小鼠肺組織內(nèi)CCN1 mRNA的表達(dá)

2.3 CCN1蛋白在Cre+/-CCN1flox/flox小鼠肺組織中的表達(dá) 免疫熒光檢測(cè)小鼠肺組織CCN1表達(dá)發(fā)現(xiàn)，CCN1（紅色熒光）主要在肺上皮細(xì)胞（綠色熒光為特異性上皮細(xì)胞EpCAM標(biāo)記）內(nèi)表達(dá)，KO-CCN1組小鼠肺組織上皮細(xì)胞中顯示CCN1表達(dá)的紅色熒光明顯減弱，提示KO-CCN1組CCN1表達(dá)較對(duì)照組有所下降，見(jiàn)圖4。免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)WT組及KO-CCN1組肺氣道上皮細(xì)胞及部分肺泡上皮細(xì)胞可見(jiàn)大量核黃色顆粒沉積，提示CCN1蛋白主要于氣道上皮細(xì)胞及部分肺泡上皮細(xì)胞中表達(dá)。他莫昔芬刺激小鼠后，KOCCN1組小鼠氣道上皮細(xì)胞核黃色顆粒沉淀程度較其他2組減輕，提示該組小鼠肺內(nèi)CCN1蛋白的表達(dá)明顯下降，見(jiàn)圖5。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，KO-CCN1組小鼠肺組織中CCN1蛋白水平較NC-CCN1組小鼠肺組織明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖6。

3 討論

圖4 免疫熒光檢測(cè)使用他莫昔芬誘導(dǎo)后NC-CCN組、KO-CCN1組小鼠肺組織內(nèi)CCN1表達(dá)（×40）

圖5 免疫組織化學(xué)檢測(cè)使用他莫昔芬誘導(dǎo)后WT組、NC-CCN1組、KO-CCN1組小鼠肺組織內(nèi)CCN1蛋白表達(dá)

圖6 Western blot檢測(cè)使用他莫昔芬誘導(dǎo)后NC-CCN1組、KO-CCN1組小鼠的肺組織內(nèi)CCN1蛋白表達(dá)水平

既往研究表明CCN1可在正常成人氣道上皮細(xì)胞高表達(dá)，同時(shí)纖維母細(xì)胞、肺部?jī)?nèi)皮細(xì)胞及肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞均有表達(dá)一定水平的CCN1[8]。既往關(guān)于CCN1的研究大部分定位于肺外及慢性炎癥。關(guān)于肺外研究，如CCN1與腫瘤[9-10]、心臟疾病[11-12]、腎臟疾病[13]及胚胎生長(zhǎng)功能[14]等均有相關(guān)聯(lián)系。關(guān)于炎癥方面，CCN1可以通過(guò)α4β1/α5β1整合素結(jié)合至免疫細(xì)胞，加強(qiáng)了免疫細(xì)胞的遷移能力，其中涉及PI3K/Akt及絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路，與此同時(shí)，研究表明急性炎癥時(shí)外周血漿中CCN1表達(dá)升高[6]。而近期CCN1與肺部疾病的關(guān)系研究發(fā)展迅速。有研究顯示，博來(lái)霉素導(dǎo)致的急性肺損傷（acute lung injury，ALI）中CCN1表達(dá)升高，同時(shí)腺病毒轉(zhuǎn)染后的CCN1過(guò)度表達(dá)亦可導(dǎo)致博來(lái)霉素造模ALI小鼠后小鼠體質(zhì)量降低程度的增加、肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞增加以及死亡率增加，由此證實(shí)CCN1的過(guò)度表達(dá)可促進(jìn)肺損傷疾病的發(fā)展[15]。在不同誘因（如甲流病毒、內(nèi)毒素、脂磷壁酸等）導(dǎo)致的肺炎小鼠模型中，肺組織內(nèi)CCN1表達(dá)亦有不同程度的升高，且在早期2、4 h升高顯著[4]。另有研究表明，CCN1可結(jié)合整合素αVβ6-PKC促進(jìn)抗炎因子IL-10的釋放，抑制了TNF-α、巨噬細(xì)胞炎性蛋白的分泌，減少了肺內(nèi)中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，此研究認(rèn)為細(xì)菌感染后肺上皮細(xì)胞CCN1表達(dá)升高，而CCN1可引導(dǎo)IL-10的產(chǎn)生，對(duì)于ALI后肺內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持起到了一定的作用[3]。目前CCN1于ALI疾病中是促炎作用或是抗炎作用，其具體涉及的調(diào)控機(jī)制，國(guó)內(nèi)外尚未徹底明確，CCN1沉默后是否肺部炎癥有所緩解還未得到最終結(jié)論，這也是本課題主要研究?jī)?nèi)容，亦是構(gòu)建Cre+/-CCN1flox/flox肺組織特異性CCN1基因條件敲除小鼠的重要原因。

Cre-LoxP技術(shù)是條件性基因敲除技術(shù)中的一種，通過(guò)在待敲除的一段目標(biāo)DNA序列的兩端各放置一個(gè)LoxP序列，得到flox（flanked by LoxP）小鼠，將flox小鼠與帶有細(xì)胞特異性表達(dá)Cre的小鼠交配繁殖，以獲得在特定細(xì)胞里把目標(biāo)基因敲除掉的小鼠，即條件性基因敲除小鼠[16-17]。此外，若與控制Cre表達(dá)的其他誘導(dǎo)系統(tǒng)（如CreERT2）相結(jié)合，還可以對(duì)某一基因同時(shí)實(shí)現(xiàn)時(shí)間與空間的兩方面調(diào)控。

本研究中的Cre重組酶小鼠為Nkx2-1tm1.1（cre/ERT2）Zjh/J小鼠。Nkx2-1又稱(chēng)為甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-1（thyroid transcription factor-1，TTF-1），主要調(diào)控甲狀腺球蛋白、甲狀腺過(guò)氧化物酶和促甲狀腺激素受體基因的轉(zhuǎn)錄[18]，其可能在肺發(fā)育和表面活性劑體內(nèi)平衡中發(fā)揮作用，主要表達(dá)于肺形態(tài)發(fā)育初始階段的表皮細(xì)胞和胚肺的全程發(fā)育，可調(diào)節(jié)肺上皮細(xì)胞形態(tài)發(fā)生和分化[19-20]。發(fā)育成熟正常的肺組織中，Nkx2-1表達(dá)于肺泡細(xì)胞和細(xì)支氣管細(xì)胞中，在末梢支氣管中還表達(dá)于纖毛細(xì)胞、基底細(xì)胞、Clara細(xì)胞[21-22]。在急性炎癥、肺水腫、新生兒肺透明膜病和支氣管發(fā)育不良等肺部疾病中，Nkx2-1可表現(xiàn)為基因缺失、錯(cuò)義或無(wú)義突變[23]。因此本研究的Cre重組酶小鼠在他莫昔芬誘導(dǎo)下可在特定的肺上皮細(xì)胞、細(xì)支氣管細(xì)胞、纖毛細(xì)胞等諸多肺內(nèi)細(xì)胞中產(chǎn)生Cre重組酶，從而在該特定細(xì)胞內(nèi)敲除CCN1基因，創(chuàng)建特定部位、特定條件下產(chǎn)生的CCN1基因敲除小鼠，并可在諸多疾病譬如肺部急性炎癥中研究目的基因的作用機(jī)制。

本研究中采用已在目的基因CCN1兩端放置Loxp序列的CCN1flox/flox純合子小鼠與于氣道上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞特定表達(dá)Cre酶的Nkx2-1tm1.1（cre/ERT2）Zjh/J小鼠相互雜交、繁衍出所需的目的小鼠Cre+/-CCN1flox/flox小鼠。其中16只F3代小鼠中，有7只為本研究所需的目的小鼠，占總數(shù)的43.75%，基本達(dá)到理論數(shù)值即1/2。研究中對(duì)最終取得的Cre+/-CCN1flox/flox進(jìn)行基因水平及蛋白水平的驗(yàn)證，結(jié)果顯示Cre+/-CCN1flox/flox經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的他莫昔芬誘導(dǎo)，CCN1在肺內(nèi)組織表達(dá)明顯較Cre-/-CCN1flox/flox基因小鼠下降，其中CCN1基因被敲除的現(xiàn)象主要存在于氣道上皮細(xì)胞、部分肺泡上皮細(xì)胞，符合既往研究所示Nkx2-1基因表達(dá)的細(xì)胞類(lèi)型[21-22]。結(jié)果證實(shí)，CCN1基因條件敲除后，在目標(biāo)類(lèi)型的細(xì)胞上靜默效果完全符合預(yù)期，完全符合本研究課題所需動(dòng)物模型的要求，且該種轉(zhuǎn)基因小鼠因Cre表達(dá)的特定性，可充分應(yīng)用于氣道上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞的CCN1基因與各種肺部疾病如肺部炎癥、肺部腫瘤相關(guān)聯(lián)的實(shí)驗(yàn)研究中，具有較其他非肺特異性條件敲除基因小鼠的優(yōu)勢(shì)。而基于Nkx2-1基因特定表達(dá)細(xì)胞的特征[21-22]，肺部?jī)?nèi)皮細(xì)胞及肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)的CCN1尚無(wú)法敲除，因此本研究中小鼠CCN1基因敲除后PCR鑒定結(jié)果提示Cre+/-CCN1flox/flox基因小鼠肺內(nèi)仍可檢測(cè)到CCN1（a條帶），RT-PCR及Western blot結(jié)果提示Cre+/-CCN1flox/flox基因小鼠肺內(nèi)組織亦存在CCN1的mRNA及蛋白的表達(dá)。該結(jié)果提示本研究中的轉(zhuǎn)基因敲除小鼠，并無(wú)法研究肺部炎癥中肺部?jī)?nèi)皮細(xì)胞及肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞等其他細(xì)胞中CCN1的表達(dá)情況及涉及的調(diào)控機(jī)制，可能存在一定的局限性。

本研究利用已經(jīng)構(gòu)建完成的肺上皮細(xì)胞特異性表達(dá)Cre重組酶的小鼠和CCN1flox/flox小鼠，成功建立了肺上皮細(xì)胞特異性CCN1基因條件敲除的純合子小鼠種系，該小鼠和正常野生型小鼠在生長(zhǎng)速度、繁殖能力等方面無(wú)明顯差異。本研究并完成了對(duì)子代小鼠的鑒定以及對(duì)實(shí)驗(yàn)?zāi)康男∈蟮幕蚯贸降尿?yàn)證，得到了預(yù)期的沉默效果。此類(lèi)利用Cre-LoxP技術(shù)構(gòu)建肺上皮細(xì)胞特異性的CCN1基因條件敲除小鼠，將有利于我們?cè)谡w動(dòng)物水平探索CCN1基因在肺組織內(nèi)炎癥發(fā)生、發(fā)展中的調(diào)控作用及分子機(jī)制。