丙泊酚對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞HMGB1表達(dá)的調(diào)控作用

張明曉，黃陸平，金深輝，陳思佳，戴勤學(xué)

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 麻醉科，浙江 溫州 325015）

高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）為晚期炎癥反應(yīng)介質(zhì)，由單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞在炎癥反應(yīng)中主動(dòng)分泌[1-2]。丙泊酚作為一種新型靜脈麻醉藥，因其起效快、蘇醒迅速而完全、不良反應(yīng)少、持續(xù)輸注后無(wú)蓄積等特點(diǎn)，己廣泛應(yīng)用于臨床各科的手術(shù)麻醉[3-4]。近年來(lái)報(bào)道丙泊酚具有腦保護(hù)作用，而炎癥是腦損傷中的關(guān)鍵因素[5-6]。越來(lái)越多的研究已證實(shí)丙泊酚的炎癥調(diào)控作用[5，7-8]，但其對(duì)HMGB1的調(diào)控作用尚未完全闡明。p38 MAPK信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激反應(yīng)信號(hào)，其表達(dá)廣泛，與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[9-10]。已有研究證實(shí)，丙泊酚能通過(guò)抑制HMGB1的表達(dá)調(diào)控LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，緩解大鼠急性肺損傷[1]。p38信號(hào)通路也可調(diào)控TNF-α誘導(dǎo)的HMGB1表達(dá)[11]。我們推測(cè)丙泊酚能通過(guò)p38 MAPK信號(hào)通路抑制TNF-α誘導(dǎo)的HMGB1表達(dá)，本研究應(yīng)用TNF-α誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型，驗(yàn)證丙泊酚對(duì)HMGB1的調(diào)控作用及機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 小膠質(zhì)BV-2細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心）。丙泊酚、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG/鼠IgG、p-p38鼠單克隆抗體、p38鼠多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；抗GAPDH兔單克隆抗體購(gòu)自德國(guó)CST公司；HMGB1鼠單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；RNA提取試劑購(gòu)自大連Takara公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜與曝光系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-rad公司；SpectraMax M2型酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Molecular Devices公司；倒置及正置熒光顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1 小膠質(zhì)BV-2細(xì)胞培養(yǎng)：將小膠質(zhì)BV-2細(xì)胞接種到DMEM高糖培養(yǎng)基（含100 U/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素和10%胎牛血清）中培養(yǎng)傳代2次取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.2 不同濃度丙泊酚及TNF-α處理細(xì)胞：不同濃度丙泊酚（5、10、20、50、100、150和200 μmol/L）處理小膠質(zhì)細(xì)胞24 h后，MTT法檢測(cè)各濃度對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞增殖的影響，選擇合適濃度的丙泊酚進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。不同濃度（5、10和20 ng/mL）的TNF-α處理細(xì)胞后進(jìn)行RT-qPCR和Western blot檢測(cè)HMGB1的mRNA及蛋白表達(dá)。

1.2.3 分組：將小膠質(zhì)BV-2細(xì)胞分組，設(shè)立對(duì)照組、TNF-α（20 ng/mL）組、TNF-α（20 ng/mL）+丙泊酚（10、20、50 μmol/L）組，丙泊酚孵育細(xì)胞1 h后再經(jīng)TNF-α處理6、24 h，收集細(xì)胞進(jìn)行RT-qPCR和Western blot檢測(cè)HMGB1的表達(dá)和p38的磷酸化；將小膠質(zhì)BV-2細(xì)胞分組，設(shè)立對(duì)照組、TNF-α（20 ng/mL）組、sip38組、TNF-α（20 ng/mL）+sip38組、TNF-α（20 ng/mL）+丙泊酚（50 μmol/L）組、TNF-α（20 ng/mL）+sip38+丙泊酚（50 μmol/L）組，小膠質(zhì)BV-2細(xì)胞經(jīng)p38的siRNA（10 nmol/L）處理12 h后再經(jīng)丙泊酚孵育1 h，最后用TNF-α處理細(xì)胞6、24 h，收集細(xì)胞進(jìn)行RT-qPCR和Western blot檢測(cè)HMGB1的表達(dá)。

1.2.4 RNA的提取與RT-qPCR檢測(cè)：細(xì)胞研磨后，加入1 mL提取試劑，收集到1.5 mL EP管，加入200 mL氯仿，渦旋15 s，室溫靜置5 min，12 000×g離心，15 min，4 ℃，吸出無(wú)色上層液到另一EP管中，加入等體積的異丙醇，上下顛倒混勻，室溫靜置10 min，12 000×g離心10 min，4 ℃，去上清，加入1 mL 75%乙醇，7 500×g離心，5 min，4 ℃。去上清，吸出液體，室溫干燥10 min，加入DEPC水溶解RNA，測(cè)量RNA的純度（OD260/OD280）及濃度。反轉(zhuǎn)錄試劑盒用隨機(jī)六聚體引物和轉(zhuǎn)錄酶將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。獲得的cDNA通過(guò)RT-qPCR分析檢測(cè)HMGB1 mRNA的表達(dá)水平，引物序列見表1。

表1 RT-qPCR的引物序列（5’-3’）

1.2.5 Western blot檢測(cè)細(xì)胞HMGB1、p38和p-p38的表達(dá)：細(xì)胞裂解后，測(cè)蛋白濃度并配平每個(gè)蛋白的上樣量。等量蛋白通過(guò)SDS膠進(jìn)行分級(jí)分離，然后濕法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，相對(duì)分子質(zhì)量小的用0.2 μm孔徑的膜，相對(duì)分子質(zhì)量大的用0.45 μm孔徑的膜。90 min后用5%脫脂牛奶進(jìn)行封閉，待封閉好后加入一抗（HMGB1鼠單克隆抗體、p-p38鼠單克隆抗體、p38鼠多克隆抗體和抗GAPDH兔單克隆抗體，均稀釋為1∶1 000），置室溫?fù)u床孵育2 h之后移至4 ℃搖床過(guò)夜。次日加入HRP結(jié)合的二抗（1∶3 000），二抗孵育1 h后用TBST洗滌3次。加ECL液避光孵育2 min，曝光儀成像。

1.2.6 siRNA誘導(dǎo)的基因沉默：利用特異性siRNA序列實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的基因沉默，小鼠p38特異性siRNA購(gòu)買自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。采用LipofectAMINETM2000（美國(guó)Invitrogen公司）將10 nmol/L的siRNA轉(zhuǎn)染至小膠質(zhì)BV-2細(xì)胞，具體操作根據(jù)說(shuō)明書指示進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，2組間比較采用student’s t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析并以Bonferroni校正作后比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 低劑量丙泊酚不影響小膠質(zhì)細(xì)胞增殖 150和200 μmol/L丙泊酚可明顯抑制小膠質(zhì)細(xì)胞增殖（P＜0.01），見圖1。表明高濃度丙泊酚對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞有著細(xì)胞毒性作用，可能會(huì)影響后續(xù)研究，所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)只使用10、20和50 μmol/L濃度的丙泊酚。

圖1 MTT法檢測(cè)不同濃度丙泊酚對(duì)小膠質(zhì)BV-2細(xì)胞增殖作用的影響

2.2 TNF-α劑量依賴性地上調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞HMGB1表達(dá) 與對(duì)照組比，不同濃度（5、10和20 ng/mL）的TNF-α組HMGB1 mRNA表達(dá)均明顯增高（P＜0.05），10和20 ng/mL的TNF-α組HMGB1蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05），且TNF-α濃度越高，HMGB1表達(dá)越高，見圖2。表明TNF-α可上調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞HMGB1的表達(dá)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用20 ng/mL濃度的TNF-α。

2.3 丙泊酚降低TNF-α誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞HMGB1的表達(dá) 經(jīng)TNF-α處理后HMGB1蛋白和mRNA表達(dá)明顯增高（P＜0.01），而與TNF-α組比，10、20和50 μmol/L丙泊酚預(yù)處理顯著降低HMGB1蛋白和mRNA表達(dá)（P＜0.05），并呈現(xiàn)劑量越高，抑制效果越明顯的趨勢(shì)，見圖3。

圖2 不同濃度TNF-α對(duì)小膠質(zhì)BV-2細(xì)胞HMGB1蛋白（A）和mRNA（B）表達(dá)的影響

2.4 丙泊酚通過(guò)抑制p38激活降低TNF-α誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞HMGB1的表達(dá) 后續(xù)對(duì)丙泊酚調(diào)控TNF-α誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞HMGB1表達(dá)的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比，TNF-α組p38的磷酸化水平明顯增高（P＜0.01），而丙泊酚處理后，p38的磷酸化顯著降低（P＜0.01），并呈劑量依賴性（見圖4A）。利用siRNA沉默p38的表達(dá)后，再用丙泊酚處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默p38可抑制TNF-α誘導(dǎo)的HMGB1蛋白和mRNA表達(dá)升高（P＜0.01），而丙泊酚（50 μmol/L）處理后，sip38+丙泊酚組與si p38組HMGB1蛋白和mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖4B-C；表明丙泊酚可能通過(guò)抑制p38激活降低TNF-α誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞HMGB1的表達(dá)。

3 討論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病或損傷后，小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的慢性神經(jīng)炎癥反應(yīng)會(huì)損傷局部腦組織，加重病情，不利于神經(jīng)功能的恢復(fù)[12-13]。丙泊酚被報(bào)道在缺血性腦損傷中有著保護(hù)作用[6，14]，但其對(duì)腦損傷的免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)功能鮮有報(bào)道。

丙泊酚作為麻醉藥，如果用量過(guò)大對(duì)細(xì)胞也必然會(huì)產(chǎn)生影響[15-16]。在研究丙泊酚對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞HMGB1調(diào)節(jié)作用的過(guò)程中，當(dāng)濃度增加到150 μmol/L時(shí)，丙泊酚便顯示出明顯的細(xì)胞毒性作用。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取了較低濃度（5～100 μmol/L）的丙泊酚做進(jìn)一步的研究。

圖3 丙泊酚對(duì)TNF-α誘導(dǎo)小膠質(zhì)BV-2細(xì)胞HMGB1蛋白（A）和mRNA（B）表達(dá)的影響（TNF-α濃度為20 ng/mL）

HMGB1作為一種細(xì)胞因子[17]，其作用是雙方面的。一方面它可以引起骨髓細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，促進(jìn)表皮細(xì)胞的再生；另一方面也會(huì)參與自身炎癥反應(yīng)和敗血癥等[18]。HMGB1與TNF-α、IL-1等早期速發(fā)型炎性因子不同，TNF-α和IL-1等作為一種促炎性因子在早期炎癥中發(fā)揮重要作用，而HMGB1作為介導(dǎo)LPS所致細(xì)胞死亡的細(xì)胞因子，其產(chǎn)生較晚，且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，因此被認(rèn)為是一種重要的晚期炎癥反應(yīng)介質(zhì)，可在炎癥反應(yīng)中被單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞表達(dá)與分泌，與此同時(shí)早期速發(fā)型炎性因子與HMGB-1的表達(dá)及分泌密切相關(guān)[11]。HMGB1在炎癥物質(zhì)如LPS等刺激下由固有免疫細(xì)胞分泌，這些介質(zhì)又能夠加強(qiáng)HMGB1的分泌效應(yīng)，形成一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞因子分泌調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。HMGB1是決定特定細(xì)胞壞死或凋亡的關(guān)鍵信號(hào)，細(xì)胞釋放出HMGB1引起晚期炎癥反應(yīng)即可誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，而凋亡細(xì)胞即使經(jīng)受第二次壞死或部分自溶也不會(huì)釋放HMGB1而誘發(fā)死亡[18]。在膿毒癥中，在LPS誘導(dǎo)晚期炎癥反應(yīng)中，HMGB1可分泌出胞，加劇炎癥級(jí)聯(lián)瀑布反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，由此可見HMGB1在炎癥反應(yīng)中的重要性與致死性毒性[17]。本研究主要探究HMGB1在腦損傷炎癥晚期（TNF-α誘導(dǎo)）中的表達(dá)。本研究檢測(cè)了不同濃度TNF-α對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞HMGB1 mRNA水平和蛋白水平的影響。結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，20 ng/mL的TNF-α可明顯增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞HMGB1蛋白和mRNA表達(dá)。而10、20和50 μmol/L的丙泊酚預(yù)處理組與TNF-α組相比較，HMGB1蛋白和mRNA水平明顯降低，且呈劑量依賴性。所以，丙泊酚可抑制TNF-α誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的HMGB1表達(dá)。

圖4 丙泊酚通過(guò)p38調(diào)控HMGB1的表達(dá)

有研究報(bào)道TNF-α可通過(guò)p38的激活誘導(dǎo)HMGB1的表達(dá)[11，19]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組比，20 ng/mL TNF-α可明顯增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞p38的激活，而丙泊酚處理可明顯抑制p38激活，且呈現(xiàn)劑量依賴性。另sip38轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明：與對(duì)照組比，sip38可明顯抑制TNF-α誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞HMGB1的表達(dá)，而丙泊酚處理后，并未出現(xiàn)明顯差異，說(shuō)明抑制p38的表達(dá)后丙泊酚無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)HMGB1的調(diào)控作用。

綜上所述，小膠質(zhì)細(xì)胞受TNF-α干預(yù)后，p38 MARK被激活及HMGB1表達(dá)升高，丙泊酚處理后，可顯著降低TNF-α誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞p38的激活及HMGB1 mRNA和蛋白的表達(dá)。而利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)丙泊酚對(duì)HMGB1的調(diào)控作用是通過(guò)p38實(shí)現(xiàn)[20]。由此可見，丙泊酚在腦損傷免疫炎癥系統(tǒng)中的調(diào)控作用可能是通過(guò)其對(duì)p38/HMGB1的調(diào)控作用實(shí)現(xiàn)的。