同型半胱氨酸對(duì)FABP4啟動(dòng)子活性的影響*

熊建團(tuán) ，李旭生 ，楊安寧 ，楊松昊 ，鄧梅 ，王磊 ，高源 ，李南 ，楊曉玲 ，賈月霞，姜怡鄧

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，寧夏 銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院 骨科，寧夏 銀川750004；3.寧夏醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004）

脂肪型脂肪酸結(jié)合蛋白4（fatty acid binding protein 4, FABP4）屬于脂肪酸結(jié)合蛋白大家族的重要成員，主要在脂肪組織中高度表達(dá)，在巨噬細(xì)胞中也有大量表達(dá)[1]。近年來(lái)研究表明，F(xiàn)ABP4在肥胖和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生中發(fā)揮重要作用[2]。FABP4表達(dá)缺失可通過(guò)降低炎癥因子在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)，保護(hù)高血脂老鼠避免動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[3]。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于FABP4基因啟動(dòng)子的研究較少。同型半胱氨酸（Homocysteine, Hcy）是心腦血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，通過(guò)多種機(jī)制影響基因表達(dá)，參與疾病發(fā)生、發(fā)展[4]。本研究以人源FABP4基因?yàn)檠芯繉?duì)象，成功克隆FABP4基因啟動(dòng)子，分析確定影響FABP4基因啟動(dòng)子活性的核心區(qū)域，為進(jìn)一步開(kāi)展功能研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要設(shè)備和試劑

L-Hcy和佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA）（德國(guó)Sigma-Aldric公司），二氧化碳CO2培養(yǎng)箱HF90（上海力新儀器有限公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），青霉素、鏈霉素、PBS緩沖液、DMEM和RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)HycLone公司，相差顯微鏡（日本尼康公司），熒光素酶檢測(cè)儀器（美國(guó)普洛麥格公司），PrimeSTAR HS DNA polymera（大連寶生生物工程公司有限公司），限制性內(nèi)切酶Xhol、Hind Ⅲ、T4 DNA快速連接酶、DNA Marker及轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM3000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，DNA提取試劑盒、凝膠回收純化試劑盒、DNA純化試劑盒及雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)普洛麥格公司，質(zhì)粒純化試劑盒（北京天根生化科技有限公司），pGL3-Basic質(zhì)粒、pRL-TK質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存，HEK-293A細(xì)胞（四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)院），實(shí)驗(yàn)中所用引物及測(cè)序由上海英俊生物有限公司完成。

1.2 啟動(dòng)子序列分析

根據(jù)GenBank中人FABP4基因的序列（GenBank：CR456903.1），查找啟動(dòng)子區(qū)2 000 bp區(qū)域，分別根據(jù)http：//fruitfly.org：9005/seq_tools/promoter.html、http：//www.urogene.org/methprimer/index1.html網(wǎng)站預(yù)測(cè)啟動(dòng)子結(jié)合序列和甲基化島分布情況的結(jié)果。

1.3 FABP4基因啟動(dòng)子報(bào)告基因載體的構(gòu)建

將人FABP4啟動(dòng)子初步分為4個(gè)片段，分別為 -500/-1、-1000/-1、-2000/-1、-2000/-1501， 利用Primer 5設(shè)計(jì)合成4對(duì)特異引物獲得相應(yīng)片段，并在5’端和3’端分別添加X(jué)hol和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)，引物序列見(jiàn)附表。將目的片段從亞克隆載體上切割并回收，回收目的片段并與pGL3-Basic載體連接，利用雙酶切方法篩選并測(cè)序鑒定。

附表 FABP4基因啟動(dòng)子片段引物設(shè)計(jì)

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

HEK-293A工具細(xì)胞使用DMEM培養(yǎng)基，THP-1單核細(xì)胞使用RPMI 1640培養(yǎng)液，均含12%胎牛血清。于37℃、5% CO2環(huán)境中靜置培養(yǎng)。以500 nmol/L PMA培養(yǎng)液孵育THP-1單核細(xì)胞48 h，單核細(xì)胞即分化為巨噬細(xì)胞，然后給予不用濃度（0、50、100、200和500μmol/L）Hcy干預(yù)24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 FABP4基因啟動(dòng)子活性分析

將細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%匯合時(shí)，采用LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染DNA總量為2μg/孔，pGL3-FABP4不同大小片段質(zhì)粒與海腎熒光素酶報(bào)告基因載體（pRL2TK）的比值為100∶1。將海腎熒光素酶報(bào)告基因載體作為內(nèi)源參照，以消除由于轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞活性等因素帶來(lái)的差異。轉(zhuǎn)染48 h后，按照Promega公司熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次，每次3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，啟動(dòng)子相對(duì)活性以目的基因熒光與海腎熒光的比值（Fluc/Rluc）表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用GraphPad Software 6.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較用方差分析，兩兩比較用SNK–q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FABP4基因核心啟動(dòng)子預(yù)測(cè)分析

通過(guò)BDGP生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)在FABP4啟動(dòng)子區(qū)2 000 bp的范圍內(nèi)含有2個(gè)可能的核心啟動(dòng)子位點(diǎn)，并且得分均＞0.95（滿分1.00分）。見(jiàn)圖1。

圖1 FABP4基因核心啟動(dòng)子預(yù)測(cè)分析

2.2 FABP4基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島生物學(xué)預(yù)測(cè)

通過(guò)Methprimer網(wǎng)站預(yù)測(cè)，筆者觀察到在FABP4啟動(dòng)子區(qū)2 000 bp范圍內(nèi)沒(méi)有CpG島的存在，但是有一段CpG二核苷酸位點(diǎn)相對(duì)集中的區(qū)域，并且可以在這個(gè)相對(duì)集中的區(qū)域設(shè)計(jì)甲基化與非甲基化引物，觀察FABP4基因啟動(dòng)子甲基化程度的改變。見(jiàn)圖2。

2.3 FABP4基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的預(yù)測(cè)

用生物信息學(xué)方法進(jìn)行分析比對(duì)FABP4基因啟動(dòng)子2 000 bp序列，發(fā)現(xiàn)在位于轉(zhuǎn)錄起始的-67堿基位置和轉(zhuǎn)錄起始的-1548堿基位置含有CAAT盒，而位于轉(zhuǎn)錄起始的-808堿基位置含有TATA盒。見(jiàn)圖3。

2.4 FABP4基因啟動(dòng)子區(qū)不同截取片段PCR產(chǎn)物

通過(guò)普通PCR擴(kuò)增得到與預(yù)測(cè)截取片段大小相等且規(guī)整單一的PCR產(chǎn)物。其中，-2000/-1501片段組、-500/-1片段組、-1000/-1片段組、-2000/-1片段組長(zhǎng)度分別為500、500、1 000和2 000 bp。見(jiàn)圖4。

2.5 FABP4基因啟動(dòng)子不同截取片段pGL3載體雙酶切結(jié)果

將構(gòu)建好的FABP4基因啟動(dòng)子不同截取片段pGL3載體經(jīng)Hind和Xhol雙酶切后用電泳法分離，均被切出大小約4 000 bp的大片段條帶和與之相對(duì)應(yīng)的與PCR產(chǎn)物相大小一致的小片段條帶。其中，-2000/-1501片段組、-500/-1片段組、-1000/-1片段組、-2000/-1片段組長(zhǎng)度分別為500、500、1 000和2 000 bp。大片段的條帶與pGl3空載體Hind、Xhol雙酶切后的產(chǎn)物大小一致。見(jiàn)圖5。

圖2 FABP4基因啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)分析

圖3 FABP4基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)預(yù)測(cè)

圖4 各FABP4基因啟動(dòng)子片段擴(kuò)增

圖5 各FABP4基因啟動(dòng)子片段酶切鑒定

2.6 FABP4基因啟動(dòng)子不同截取片段的熒光素酶活性

以HEK-293A細(xì)胞為工具細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)入不同長(zhǎng)度的FABP4啟動(dòng)子截取片段，檢測(cè)相應(yīng)片段的螢光素酶活性，-2000/-1501片段組、-2000/-1片段組、-1000/-1片段組、-500/-1片段組細(xì)胞中相對(duì)熒光素酶活性分別為（0.2103±0.02741）、（0.3203±0.02978）、（0.1542±0.05314）和（0.2595±0.02686），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=16.900，P=0.000），提示不同長(zhǎng)度FABP4啟動(dòng)子截取片段可能具有不同的啟動(dòng)活性。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)SNK–q檢驗(yàn)，-500/-1片段組、-2000/-1片段組、-2000/-1501片段組啟動(dòng)活性高于pGL3對(duì)照組（P=0.002、0.001和0.011），其中-2000/-1片段組轉(zhuǎn)錄活性最強(qiáng)。見(jiàn)圖6。

圖6 各FABP4基因啟動(dòng)子片段熒光素酶活性檢測(cè)

2.7 Hcy和5-氮雜胞苷對(duì)FABP4基因啟動(dòng)子的作用

將FABP4基因核心啟動(dòng)子-2000/-1片段轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞，并用不同濃度Hcy和5-氮雜胞苷（5-azacytidine, AZC） 干 預(yù) 后，0、50、100、200和500μmol/L Hcy組，以及100μmol/L Hcy＋AZC組細(xì)胞中相對(duì)熒光素酶活性分別為（1.260±0.5585）、（1.430±0.1383）、（4.386±0.1711）、（4.029±0.1673）、（1.582±0.1952）和（5.265±0.3834），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=98.000，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)SNK–q檢驗(yàn)，50和500μmol/L Hcy組與0μmol/L Hcy組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.636和 0.400）；100和 200μmol/L Hcy組高于0μmol/L Hcy組（均P=0.001）；100μmol/L Hcy組用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑AZC作用后，F(xiàn)ABP4基因啟動(dòng)活性升高（P=0.002），提示Hcy可以增加巨噬細(xì)胞內(nèi)FABP4核心啟動(dòng)子片段的活性，而DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑AZC可以進(jìn)一步促進(jìn)Hcy對(duì)FABP4啟動(dòng)子活性的影響。見(jiàn)圖7。

圖7 不同濃度Hcy對(duì)FABP4基因核心啟動(dòng)子活性的影響

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)人FABP4基因2 000 bp長(zhǎng)度的啟動(dòng)子區(qū)含有3個(gè)轉(zhuǎn)錄起始結(jié)合位點(diǎn)，即由2個(gè)啟動(dòng)子區(qū)負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄調(diào)控，分別位于-2000/-1051、-500/-1和-1000/-500區(qū)域，分別為-2000/-1051區(qū)域CAAT盒（序列為CCAAT）、位于-500/-1區(qū)域CAAT盒（序列為CCAAT）和-1000/-500區(qū)域的TATA盒（序列為TATAAAA）。一般真核生物中蛋白質(zhì)編碼基因的核心啟動(dòng)子元件分4類：①傳統(tǒng)的TATA盒；②上游核心啟動(dòng)子元件；③下游啟動(dòng)子元件；④起始子。起始子只起轉(zhuǎn)錄起始并無(wú)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，而上游啟動(dòng)子元件包括CAAT盒和GC盒等，能通過(guò)TFⅡ-D復(fù)合物的識(shí)別和結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始的頻率，從而提高轉(zhuǎn)錄效率，但并不是所有啟動(dòng)子都含有這些轉(zhuǎn)錄基本元件[5]。

CAAT盒是轉(zhuǎn)錄因子CBF在DNA序列上的識(shí)別結(jié)合位點(diǎn)，其序列格式為CCAAT。CAAT盒位于所轉(zhuǎn)錄的真核生物基因的近端啟動(dòng)子，與其他啟動(dòng)子元件相互調(diào)節(jié)而發(fā)揮作用，通過(guò)控制轉(zhuǎn)錄起始的頻率從而控制啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，是真核生物基因常有的基本轉(zhuǎn)錄區(qū)[6]。而TATA盒是另一個(gè)重要基礎(chǔ)元件，是轉(zhuǎn)錄因子TBP識(shí)別的DNA序列，其序列格式通常為TATAWAW（W代表A或T）。通常認(rèn)為，含有TATA盒的啟動(dòng)子可能參與組織特異性基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，而TATA盒本身并無(wú)轉(zhuǎn)錄活性，如果表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄活性需要其他結(jié)構(gòu)基因共同調(diào)控[7]。在FABP基因2 000 bp啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)，CAAT盒位于轉(zhuǎn)錄起始的-67堿基位置和轉(zhuǎn)錄起始的-1548堿基位置，對(duì)應(yīng)存在的片段為-500/-1片段和-1501/-2000即表現(xiàn)出來(lái)轉(zhuǎn)錄活性，可以推測(cè)FABP4基因是由CAAT盒組成的核心啟動(dòng)子。而TATA盒則位于轉(zhuǎn)錄起始的-808堿基位置，存在于-1000/-1片段內(nèi)而無(wú)轉(zhuǎn)錄活性，則TATA盒在FABP4轉(zhuǎn)錄中可能未起到轉(zhuǎn)錄活性作用。

基因啟動(dòng)子和豐富的CpG序列（GC位點(diǎn)通常未甲基化）中的甲基化修飾被認(rèn)為與基因表達(dá)調(diào)控高度相關(guān)，是體內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控方式[8]。一般來(lái)說(shuō)，CpG島通常是基因中GC含量為60%、CpG出現(xiàn)率達(dá)到0.65、長(zhǎng)度為500 bp的序列，就算這些區(qū)域沒(méi)有CpG島也有豐富的CpG位點(diǎn)，可被甲基化修飾調(diào)控[9]。在FABP4基因啟動(dòng)子區(qū)里，GC含量相對(duì)較少，約為38%，在-2000/-1501片段中GC相對(duì)集中，含量也僅有47%，因此，F(xiàn)ABP4基因啟動(dòng)子不含CpG島，其調(diào)控可能受到散在分布的GC靈活調(diào)控。FABP4基因啟動(dòng)子可能是組織特異性表達(dá)的基因啟動(dòng)子，CpG位點(diǎn)參與基因表達(dá)調(diào)控的因素之一。-2000/-1501片段的轉(zhuǎn)錄活性高于對(duì)照組。由此證明，F(xiàn)ABP4基因本身CpG位點(diǎn)相對(duì)集中區(qū)域也具有啟動(dòng)基因表達(dá)的能力。-2000/-1片段轉(zhuǎn)錄活性高于-500/-1片段，可以推測(cè)CpG對(duì)FABP4基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控起一定促進(jìn)作用，參與FABP4基因表達(dá)調(diào)控。本研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP4基因啟動(dòng)子-1000/-500片段含有2個(gè)AML-1a結(jié)合區(qū)域（序列分別ACACAC和ACATAA）。AML-1a是一種具有與DNA結(jié)合的空間結(jié)構(gòu)域，其缺乏相應(yīng)轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，導(dǎo)致靶基因不能正常轉(zhuǎn)錄的機(jī)制可能是：一方面，AML-1a與DNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)域能夠和AMLlb/lc競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合靶基因DNA結(jié)合位點(diǎn)，從而抑制轉(zhuǎn)錄；另一方面，AML-1a通過(guò)改變基因CpG位點(diǎn)中胞嘧啶（C）甲基化修飾生成5-甲基胞嘧啶（5mC）調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，該過(guò)程在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中最早發(fā)生，隨后通過(guò)激活或抑制轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，這一調(diào)控主要集中在GC位點(diǎn)密集區(qū)[10]。實(shí)驗(yàn)中FABP4基因啟動(dòng)子-1000/-1片段的轉(zhuǎn)錄活性低于-500/-1片段，但熒光素酶活性與對(duì)照組比較無(wú)變化。由此推測(cè)FABP4基因-1000/-1片段啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄過(guò)程中可能有負(fù)相關(guān)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子參與，或者有相關(guān)沉默子起關(guān)鍵作用。AML-1a是否是負(fù)責(zé)FABP4基因負(fù)調(diào)控主要的因子及相關(guān)轉(zhuǎn)錄沉默子的有待進(jìn)一步研究。同時(shí)，包含豐富CpG-2000/-1501片段的-2000/-1片段活性與-1000/-1片段相比又進(jìn)一步增強(qiáng)，推測(cè)-2000/-1501片段對(duì)FABP4基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性有非常重要的作用。此外，對(duì)照載體pRL-TK所攜帶的啟動(dòng)子是HSV1-tk基因自身啟動(dòng)子，屬中等強(qiáng)度啟動(dòng)子[11]。實(shí)驗(yàn)中筆者發(fā)現(xiàn)FABP4基因啟動(dòng)子的啟動(dòng)活性均＜40%TK啟動(dòng)活性，由此推測(cè)FABP4基因啟動(dòng)子啟動(dòng)基因表達(dá)能力較弱。使用不同濃度Hcy干預(yù)細(xì)胞后，100μmol/L Hcy組啟動(dòng)活性最強(qiáng)。Hcy在體內(nèi)主要通過(guò)2種方式進(jìn)行代謝：當(dāng)?shù)鞍彼徇^(guò)量時(shí)，同型半胱氨酸通過(guò)轉(zhuǎn)硫化通路代謝，生成胱硫醚（維生素B6為輔助因子），繼而轉(zhuǎn)變?yōu)榘腚装彼?；?dāng)?shù)鞍彼岷枯^低時(shí)，Hcy主要通過(guò)蛋氨酸循環(huán)途徑進(jìn)行代謝[12]。SAM協(xié)助調(diào)解的Hcy被再甲基化形成蛋氨酸需要甲基四氫葉酸和維生素B12作為輔助因子，而自然界真核細(xì)胞內(nèi)甲基化修飾反應(yīng)唯一甲基來(lái)源只有SAM[13]。由此推斷，當(dāng)Hcy濃度過(guò)高時(shí)，迅速消耗培養(yǎng)基中的葉酸和維生素B12，SAM產(chǎn)生減少，F(xiàn)ABP4啟動(dòng)子CpG轉(zhuǎn)甲基減少，DNA發(fā)生去甲基化，使轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)。給予葉酸和維生素B12干預(yù)后，啟動(dòng)子活性約降低10%，說(shuō)明補(bǔ)充一定量的葉酸和維生素B12后，SAM產(chǎn)生進(jìn)一步增多，轉(zhuǎn)甲基能力增強(qiáng)，DNA發(fā)生甲基化位點(diǎn)增多，使轉(zhuǎn)錄減低。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)FABP4基因啟動(dòng)子屬于弱啟動(dòng)子，F(xiàn)ABP4基因核心啟動(dòng)子由CAAT盒組成，部分CpG位點(diǎn)參與FABP4基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，AML-1a可能是調(diào)控FABP4基因轉(zhuǎn)錄的負(fù)性轉(zhuǎn)錄因子，而CpG位點(diǎn)與轉(zhuǎn)錄因子、沉默子的相互作用有待進(jìn)一步研究。本研究為進(jìn)一步研究FABP4基因的功能提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。