乙烯基類聚合物對(duì)克雷伯氏菌和芽孢桿菌共培養(yǎng)的毒理效應(yīng)

朱 超，王慧琴，孫斯蔚，張文婷，丁 澤

(陜西科技大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 710021)

0 引言

乙烯基類聚合物是由含碳碳雙鍵的單體經(jīng)自由基聚合反應(yīng)所得，由于具有良好的水分散性，能與膠原分子發(fā)生交聯(lián)結(jié)合形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并且其官能團(tuán)可與膠原反應(yīng)而使結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定[1]，故一直以來(lái)乙烯基類聚合物倍受皮革化學(xué)工作者的青睞[2].然而在其廣泛應(yīng)用的同時(shí)，由于未充分利用及處理不當(dāng)，導(dǎo)致部分乙烯基類聚合物隨工業(yè)廢水進(jìn)入水體環(huán)境中，很可能對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能造成影響.污水處理廠的活性污泥生化系統(tǒng)作為這類聚合物進(jìn)入環(huán)境的第一道防線，是強(qiáng)化了的水體功能微生物集群，研究乙烯基類聚合物對(duì)其中模式種群的生物學(xué)效應(yīng)及毒理學(xué)機(jī)制對(duì)于評(píng)價(jià)基于乙烯基類聚合物的各類制革化學(xué)品的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)和環(huán)境友好性具有重要意義.

近年來(lái)的研究表明變形菌門[3,4]和厚壁菌門[3-5]是活性污泥系統(tǒng)中參與有機(jī)物降解的優(yōu)勢(shì)種群.芽孢桿菌屬是厚壁菌門中典型的孢子生成菌屬[6]，其催化途徑受葡萄糖和各種快速代謝底物的催化代謝物所抑制，其休眠態(tài)細(xì)胞較之營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞有更強(qiáng)的環(huán)境壓力抵抗能力.克雷伯氏菌屬[7]屬于變形菌門，其廣泛分布于土壤、植被和水體等環(huán)境中，參與各類生物和地球化學(xué)反應(yīng)，是非臨床脅迫環(huán)境中的主要微生物構(gòu)成種群.許多克雷伯氏菌屬成員都具備參與環(huán)境生物修復(fù)的特性.從多環(huán)芳烴-重金屬土壤中分離純化得到的一株雷伯氏菌JU1，在培養(yǎng)6 d 后對(duì)熒蒽的最高降解率可達(dá) 90%以上[8].

Ping L等[9]從土壤中分離得到雷伯氏菌菌株P(guān)L1，分別與20 mg/L 吡啶和10 mg/L苯并芘共培養(yǎng)10 d后，降解率分別達(dá)到63.4%和55.8%，對(duì)于受多環(huán)芳烴污染的土壤顯示了巨大的生物修復(fù)潛力.而較之單一種群，混合微生物種群通過(guò)代謝協(xié)作往往表現(xiàn)出對(duì)于毒性有機(jī)物的強(qiáng)耐受性和共代謝降解能力.Poulsen等[10]報(bào)道了一些難降解污染物的好氧降解過(guò)程中包含了多種微生物種群的共代謝作用.Liao等[11]用高濃度磺胺培養(yǎng)篩選出具有降解能力的功能微生物群落，培養(yǎng) 4周后平均磺胺降解率為78.3%，優(yōu)于單一種群降解的效果.從這個(gè)角度來(lái)說(shuō)使用混合培養(yǎng)物進(jìn)行目標(biāo)化學(xué)品的毒性效應(yīng)評(píng)價(jià)更符合實(shí)際微生物生態(tài)系統(tǒng)效能.

因此，本研究選取克雷伯氏菌屬和芽孢桿菌屬作為模式種群分別從純培養(yǎng)和混合培養(yǎng)水平考察四種乙烯基類聚合物的生物學(xué)效應(yīng)，以期提供此類化學(xué)品的基礎(chǔ)微生物生態(tài)效應(yīng).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要材料

受試菌株來(lái)源：分離自市政污水處理廠二沉池活性污泥中的克雷伯氏菌屬(Klebsiellasp.)和芽孢桿菌屬(Bacillussp.)菌株，二者NCBI登錄號(hào)分別為KC753506和KC753503.甘油冷凍保存的菌株經(jīng)牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基活化和牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基劃線分離后，37 ℃恒溫振蕩(150 r/min)培養(yǎng)至OD600nm為0.305，濃度約為107CFU/mL時(shí)保存?zhèn)溆?

以表1中四種基于乙烯基類聚合物的皮革化學(xué)品作為評(píng)價(jià)對(duì)象，設(shè)置三個(gè)暴露濃度：100 mg/L、500 mg/L和1 000 mg/L，將不添加任何化學(xué)品的培養(yǎng)物視為對(duì)照.

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)置

純培養(yǎng)設(shè)置：在超凈工作臺(tái)中，各取2.5 mL克雷伯氏菌屬和芽孢桿菌屬擴(kuò)繁菌液(見1.1)分別加入250 mL的錐形瓶中，并分別添加四種乙烯基類聚合物和牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基至100 mL并達(dá)到3個(gè)濃度水平，每個(gè)處理設(shè)置三個(gè)平行，37 ℃、150 r/min進(jìn)行振蕩培養(yǎng).

混合培養(yǎng)設(shè)置：混合培養(yǎng)設(shè)置同純培養(yǎng)設(shè)置僅接種液不同，為預(yù)先1∶1(體積比)混合的克雷伯氏菌和芽孢桿菌擴(kuò)繁菌液，混合菌液接種量與純培養(yǎng)暴露處理相同，總量為2.5 mL.

接種后0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，10 h，12 h，24 h，36 h，48 h，72 h，108 h分別測(cè)定純培養(yǎng)處理的和混合培養(yǎng)處理的pH值及OD600nm值.

1.3 乳酸脫氫酶(LDH)釋放實(shí)驗(yàn)

LDH是一類穩(wěn)定的胞內(nèi)酶[12]，正常情況下在所有細(xì)胞中保持幾乎相同的濃度，目前其作為一種生物標(biāo)志物基于檢測(cè)受損細(xì)胞釋放的LDH活性，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)體外細(xì)胞系統(tǒng)中的細(xì)胞毒性/細(xì)胞溶解進(jìn)行快速簡(jiǎn)單地定量[13,14].因此，可通過(guò)LDH釋放實(shí)驗(yàn)評(píng)估乙烯基類聚合物對(duì)供試菌株細(xì)胞膜完整性的影響.LDH活性通過(guò)細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所：A020-1)進(jìn)行測(cè)定，將培養(yǎng)12 h的純培養(yǎng)和混合培養(yǎng)物分別在12 000 g下離心5 min，在離心后的50μL上清液中加入0.25 mL基質(zhì)緩沖液(試劑盒配置)和0.05 mL的輔酶Ⅰ應(yīng)用液(試劑盒配置)，混勻后于37 ℃水浴中孵育15 min后再加入0.25 mL的 2,4-二硝基苯肼，混勻后于37 ℃再次水浴15 min，再加入0.4 mol/L NaOH溶液，混勻后室溫放置3 min后使用分光光度計(jì)(上海尤尼柯儀器有限公司，7200)在440 nm的波長(zhǎng)下掃描記錄吸光度.其中：乳酸脫氫酶釋放率(%)=細(xì)胞外乳酸脫氫酶含量/(細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶含量+細(xì)胞外乳酸脫氫酶含量)×100%[15].

表1 實(shí)驗(yàn)所用皮革化學(xué)品信息

注：DM為二甲基二烯丙基氯化銨，AM為丙烯酰胺，AA為丙烯酸，HEA為丙烯酸羥乙酯.

1.4 培養(yǎng)物胞內(nèi)活性氧水平檢測(cè)

為了闡明乙烯基類聚合物對(duì)供試菌株的可能抑制機(jī)理，使用2,7-二氯二氰熒光乙酰乙酸鹽標(biāo)記法[16](H2DCF-DA，分子探針，Invitrogen)檢測(cè)了供試培養(yǎng)物細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平，以反映是否存在超氧自由基引起的胞內(nèi)損傷[17].具體方法：將短期暴露(12 h)后培養(yǎng)液經(jīng)400 g離心5 min后，使用0.1 M的磷酸鹽緩沖液(pH7.2)清洗沉淀3～5次.使用0.1 M的磷酸鹽緩沖液(pH7.2)配置終濃度為50μM的2,7-二氯二氰熒光乙酰乙酸鹽溶液，加入清洗后的沉淀并在室溫下避光孵育30 min，之后離心去除上清液，加入含有不同濃度類別乙烯基類聚合物的培養(yǎng)液(pH7.2)重懸沉淀，轉(zhuǎn)移至96孔板放置5 h后經(jīng)酶標(biāo)儀在485 nm 激發(fā)光和520 nm發(fā)射光濾鏡下記錄產(chǎn)生的二氯熒光素強(qiáng)度，計(jì)算活性氧水平.

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用 Origin 8.5進(jìn)行制圖，用 SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，并用 Bonferroni 法在P=0.01的置信水平檢驗(yàn)處理組之間的差異顯著性.

2 結(jié)果與討論

2.1 乙烯基類聚合物暴露對(duì)培養(yǎng)生境pH的影響

由圖1(a)、(b)可知，在對(duì)克雷伯氏菌純培養(yǎng)和芽孢桿菌純培養(yǎng)過(guò)程中，分別添加了乙烯基類及納米復(fù)合鞣劑和涂飾劑后的培養(yǎng)液pH值隨時(shí)間的變化差異均較小，且穩(wěn)定在6.7～7.3的范圍內(nèi)，其屬于細(xì)菌生長(zhǎng)適宜pH范圍[18,19]，且與空白對(duì)照組的pH變化同樣差異不大. 因此，乙烯基類及納米復(fù)合鞣劑和涂飾劑聚合物的添加并沒有對(duì)芽孢桿菌和克雷伯氏菌純培養(yǎng)體系的pH產(chǎn)生影響，排除了由于培養(yǎng)過(guò)程中pH的波動(dòng)對(duì)微生物生長(zhǎng)的干擾.

(a)克雷伯氏菌純培養(yǎng)

(b)芽孢桿菌純培養(yǎng)圖1 添加乙烯基類聚合物的克雷伯氏菌和芽孢桿菌純培養(yǎng)過(guò)程中pH的變化

2.2 乙烯基類聚合物暴露對(duì)克雷伯氏菌和芽孢桿菌純培養(yǎng)和混合培養(yǎng)生長(zhǎng)的影響

為獲得不同乙烯基類聚合物在各暴露濃度下分別對(duì)克雷伯氏菌和芽孢桿菌純培養(yǎng)和混合培養(yǎng)生長(zhǎng)的影響，用OD600nm值來(lái)表示細(xì)菌數(shù)目變化，即生長(zhǎng)量變化.

圖2為純培養(yǎng)過(guò)程中不同聚合物類型以及不同暴露濃度對(duì)克雷伯氏菌生長(zhǎng)的影響.由圖2(a)、(b)可知，LY-5和LY-8聚合物對(duì)克雷伯氏菌的生長(zhǎng)抑制作用隨暴露濃度的增加而增加，導(dǎo)致其初始增長(zhǎng)期時(shí)間增長(zhǎng)，當(dāng)暴露濃度達(dá)到1 000 mg/L時(shí)克雷伯氏菌達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間分別為10 h和8 h(空白對(duì)照組為4 h).相比之下，LY-5聚合物對(duì)于克雷伯氏菌的抑制作用較LY-8聚合物更為明顯.

由圖2(c)、(d)可知，當(dāng)LJL-2聚合物暴露濃度為500 mg/L時(shí)對(duì)克雷伯氏菌的生長(zhǎng)有較為明顯的抑制作用，而相同暴露濃度下LJL-3聚合物純培養(yǎng)的克雷伯氏菌還是具有明顯的增長(zhǎng)趨勢(shì).因此，LJL-2聚合物對(duì)于克雷伯氏菌的抑制作用較LJL-3聚合物更為明顯且與暴露濃度呈正相關(guān).綜合比較乙烯基類及納米復(fù)合涂飾劑和鞣劑系列對(duì)于克雷伯氏菌的生長(zhǎng)抑制作用發(fā)現(xiàn)，前者更為明顯.

(a)LY-5暴露下的克雷伯氏菌生長(zhǎng)曲線

(b)LY-8暴露下的克雷伯氏菌生長(zhǎng)曲線

(c)LJL-2暴露下的克雷伯氏菌生長(zhǎng)曲線

(d)LJL-3暴露下的克雷伯氏菌生長(zhǎng)曲線圖2 不同聚合物類型及暴露水平對(duì)克雷伯氏菌純培養(yǎng)生長(zhǎng)的影響

圖3為純培養(yǎng)過(guò)程中不同聚合物類型以及不同暴露濃度對(duì)芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響.由圖3(a)、(b)可知，不同暴露濃度下LY-5和LY-8聚合物對(duì)芽孢桿菌的抑制作用相差不大，暴露濃度為1 000 mg/L下的培養(yǎng)物均在6 h時(shí)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期.因此，芽孢桿菌對(duì)LY-5和LY-8聚合物均具有較高的耐受性.

結(jié)合圖3(c)、(d)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)LJL-2和LJL-3聚合物暴露濃度高于100 mg/L時(shí)對(duì)芽孢桿菌的生長(zhǎng)就出現(xiàn)明顯的抑制作用，當(dāng)暴露濃度為1 000 mg/L時(shí)芽孢桿菌雖然可以生長(zhǎng)，但遲滯期延長(zhǎng)，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期縮短，這在LJL-2暴露下表現(xiàn)更為明顯.因此，乙烯基類及納米復(fù)合涂飾劑系列對(duì)于芽孢桿菌的生長(zhǎng)抑制作用較乙烯基類及納米復(fù)合鞣劑系列的更為明顯.

(a)LY-5暴露下的芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線

(b)LY-8暴露下的芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線

(c)LJL-2暴露下的芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線

(d)LJL-3暴露下的芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線圖3 不同聚合物類型及暴露水平對(duì)芽孢桿菌純培養(yǎng)生長(zhǎng)的影響

圖4為不同聚合物類型以及不同暴露濃度對(duì)克雷伯氏菌和芽孢桿菌混合培養(yǎng)生長(zhǎng)的影響.圖4(a)為在LY-5聚合物不同暴露濃度下混合培養(yǎng)物的生長(zhǎng)變化趨勢(shì)，暴露濃度為1 000 mg/L時(shí)混合培養(yǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間為4 h.圖4(b)中LY-8聚合物各暴露濃度下的混合培養(yǎng)均在4 h時(shí)進(jìn)入了對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期.對(duì)比該系列聚合物暴露下純培養(yǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間發(fā)現(xiàn)，其對(duì)克雷伯氏菌和芽孢桿菌混合培養(yǎng)的抑制作用不明顯，甚至較純培養(yǎng)影響更小，說(shuō)明共培養(yǎng)體系增加了微生物對(duì)污染物的耐毒害作用.

由圖4(c)可知，LJL-2聚合物各暴露濃度下混合培養(yǎng)的生長(zhǎng)均沒有出現(xiàn)明顯的進(jìn)入生長(zhǎng)期的時(shí)間點(diǎn).結(jié)合對(duì)克雷伯氏菌和芽孢桿菌的純培養(yǎng)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LJL-2聚合物對(duì)純培養(yǎng)和混合培養(yǎng)具有抑制作用.圖4(d)中LJL-3聚合物同樣對(duì)于混合培養(yǎng)生長(zhǎng)具有較強(qiáng)的抑制作用，且不利影響表現(xiàn)為劑量依賴行為.綜上所述，混合培養(yǎng)體系可以減輕聚合物對(duì)微生物的抑制作用，其中乙烯基類及納米復(fù)合涂飾劑系列對(duì)于混合菌的抑制作用較為明顯.

(a)LY-5暴露下的混合培養(yǎng)物生長(zhǎng)曲線

(b)LY-8暴露下的混合培養(yǎng)物生長(zhǎng)曲線

(c)LJL-2暴露下的混合培養(yǎng)物生長(zhǎng)曲線

(d)LJL-3暴露下的混合培養(yǎng)物生長(zhǎng)曲線圖4 不同聚合物類型及暴露水平對(duì)混合培養(yǎng)物生長(zhǎng)的影響

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，聚合物類型及不同暴露濃度對(duì)不同種群的生長(zhǎng)影響有顯著差異，乙烯基類及納米復(fù)合涂飾劑系列聚合物對(duì)純培養(yǎng)和混合培養(yǎng)的抑制均較鞣劑系列聚合物更明顯，這可能與乙烯基聚合物結(jié)構(gòu)不同有關(guān).乙烯基類及納米復(fù)合涂飾劑系列聚合物含有大量的酯基，疏水性較強(qiáng)[20].乙烯基類及納米復(fù)合鞣劑系列聚合物除含有酯基外還有大量的羥基、酰胺基和親水基團(tuán)羧基，疏水性較弱，且碳鏈較長(zhǎng)，空間位阻較大[21].因此，具有更高親脂性的乙烯基類及納米復(fù)合涂飾劑系列聚合物更容易進(jìn)入微生物細(xì)胞，使得細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化水平較高.因此，在皮革化學(xué)品的開發(fā)過(guò)程中不僅要考慮其性能還要考慮引入材料或基團(tuán)的生態(tài)效應(yīng)，開發(fā)綠色皮革化學(xué)品.

2.3 乙烯基類聚合物暴露對(duì)混合培養(yǎng)物L(fēng)DH和ROS的影響

LDH是一種廣泛用于毒理學(xué)和臨床化學(xué)檢測(cè)的生物標(biāo)志物，用于診斷細(xì)胞、組織和器官損傷[22],其濃度變化反映了受影響組織的代謝活性變化[23].因此通過(guò)測(cè)定乙烯基類聚合物暴露處理和對(duì)照培養(yǎng)液中的乳酸脫氫酶濃度，可以用于評(píng)價(jià)乙烯基類聚合物對(duì)微生物細(xì)胞膜的損傷情況.

由圖5可知，不論是純培養(yǎng)還是混合培養(yǎng)，暴露處理的培養(yǎng)液中的乳酸脫氫酶濃度與對(duì)照相比處于同一水平，沒有顯著差異.說(shuō)明此類皮革化學(xué)品的毒理效應(yīng)機(jī)制不在于細(xì)胞膜損傷.

圖5 不同聚合物類型及暴露水平對(duì)芽孢桿菌和克雷伯氏菌純培養(yǎng)和混合培養(yǎng)LDH釋放率的影響

由圖6可知，暴露于乙烯基類聚合物的培養(yǎng)物細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平相比于空白對(duì)照組均有所提高，說(shuō)明活性氧脅迫是供試化學(xué)品微生物毒理效應(yīng)的主因.其中增長(zhǎng)較大的為L(zhǎng)Y-5(500 mg/L)、LY-5(1 000 mg/L)、LY-8(1 000 mg/L)、LJL-2(500 mg/L)、LJL-2(1 000 mg/L)、LJL-3(500 mg/L)、LJL-3(1 000 mg/L)，且其大小順序大致為L(zhǎng)JL-3(1 000 mg/L)> LJL-2(1 000 mg/L) > LY-5(1 000 mg/L)> LJL-2(500 mg/L)> LJL-3(500 mg/L)> LY-8(1 000 mg/L)> LY-5(500 mg/L).由此可見，乙烯基類及納米復(fù)合涂飾劑系列較乙烯基類及納米復(fù)合鞣劑系列的毒性作用更強(qiáng)，兩個(gè)系列的乙烯基類聚合物的毒性作用均與濃度呈正相關(guān)，濃度越高，毒性作用越強(qiáng).

圖6 不同聚合物類型及暴露水平對(duì)芽孢桿菌和克雷伯氏菌純培養(yǎng)和混合培養(yǎng)ROS產(chǎn)率的影響

不同種群對(duì)聚合物暴露的活性氧水平響應(yīng)也有顯著差異，如暴露于聚合物L(fēng)Y-5(1 000 mg/L)、LJL-2(500 mg/L、1 000 mg/L)和LJL-3(500 mg/L、1 000 mg/L)的芽孢桿菌純培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平明顯高于克雷伯氏菌純培養(yǎng)，說(shuō)明乙烯基類及納米復(fù)合涂飾劑的聚合物對(duì)芽孢桿菌的毒理效應(yīng)較克雷伯氏菌顯著.

由暴露于乙烯基類及納米復(fù)合涂飾劑系列LJL-3(500 mg/L、1 000 mg/L)的芽孢桿菌純培養(yǎng)和混合培養(yǎng)可知，混合培養(yǎng)下細(xì)胞內(nèi)的ROS水平顯著低于純培養(yǎng)體系.整體上，混合培養(yǎng)體系耐受性更強(qiáng).低水平的ROS通常是生理上產(chǎn)生的，可以刺激活細(xì)胞的一些信號(hào)通路[24,25].然而，細(xì)胞內(nèi)過(guò)量的ROS會(huì)導(dǎo)致許多有害的影響，包括脂質(zhì)過(guò)氧化、DNA修飾和蛋白質(zhì)氧化，導(dǎo)致細(xì)胞損傷[26].混合培養(yǎng)體系在一定程度上可以減輕該類聚合物的毒害作用，這可能是由于采用混合培養(yǎng)策略能為微生物提供在純培養(yǎng)時(shí)無(wú)法獲得的物質(zhì)流交換，如為其提供生長(zhǎng)必須的氨基酸[27]，使其生長(zhǎng)率和降解效率都比純培養(yǎng)時(shí)顯著提高[28]，顯示活性污泥系統(tǒng)對(duì)此類皮革化學(xué)品具備一定的生物耐受度和相容性.因此，混合培養(yǎng)體系較之純培養(yǎng)體系對(duì)該類聚合物有更好的耐受性.

3 結(jié)論

乙烯基類聚合物的添加并沒有對(duì)芽孢桿菌和克雷伯氏菌純培養(yǎng)體系的pH產(chǎn)生影響，但對(duì)克雷伯氏菌、芽孢桿菌純培養(yǎng)和混合培養(yǎng)的抑制作用均呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系；乙烯基類及納米復(fù)合涂飾劑系列聚合物較鞣劑系列對(duì)克雷伯氏菌和芽孢桿菌純培養(yǎng)和混合培養(yǎng)的生長(zhǎng)抑制更明顯；混合培養(yǎng)體系較純培養(yǎng)體系對(duì)聚合物具有更好的耐受性，可以減輕聚合物對(duì)其毒理效應(yīng)；此類化學(xué)品的毒理效應(yīng)機(jī)制不在于細(xì)胞膜損傷，而在于活性氧的脅迫.本研究表明，此類制革化學(xué)品對(duì)于活性污泥系統(tǒng)存在潛在毒理效應(yīng)，應(yīng)控制排放濃度在100 mg/L下，以減輕對(duì)于污水處理系統(tǒng)或者土壤微生物生態(tài)的影響.