寧夏紅果枸杞多糖提取及其體外抗氧化活性研究

孫玉姣，侯淑婷，魚喆喆，崔湘怡，譚梓杉，戚歆宇，康雨芳

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安 710021)

0 引言

細(xì)胞在正常的代謝和生長過程中會產(chǎn)生一系列活性氧(reactive oxygen species,ROS)，例如超氧陰離子(superoxide anion,O2-)，羥自由基(hydroxyl radicals,·OH)和過氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)等.它們能夠破壞脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子，導(dǎo)致癌癥、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病和組織炎癥等許多疾病的發(fā)生[1,2].一些食物的變質(zhì)也與食品中的脂質(zhì)或者不飽和脂肪酸的氧化有關(guān).由ROS引起的脂質(zhì)氧化會引起脂類食品營養(yǎng)價值的降低，不僅造成食物外觀受損，還會增加食品安全的風(fēng)險.抗氧化劑可以延緩或者阻止過量自由基和活性氧類物質(zhì)的形成，也可以阻止ROS同生物大分子發(fā)生反應(yīng)，保護身體免受ROS的損害，因而對人類身體健康有積極的作用.許多化學(xué)合成的抗氧化劑已經(jīng)被商品化，被廣泛用于阻止氧化反應(yīng)和過氧化過程.

目前，常用的合成抗氧化劑有二丁基羥基甲苯(butylated hydroxytoluene,BHT)、二丁基羥基茴香醚(butylated hydroxyanisole,BHA)、叔丁基對苯二酚(tert-butylhydroquinone,TBHQ)和沒食子酸丙酯(propyl gallate,PG)等.然而，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)一些合成抗氧化劑會對人體的肝、脾、肺等器官產(chǎn)生不利影響,具有致癌的風(fēng)險[3-5].因此，尋找安全性高、無毒副作用和抗氧化性強的天然抗氧化劑受到了人們的廣泛關(guān)注.目前開發(fā)的天然抗氧化劑有維生素類、酚類、類胡蘿卜素類、黃酮類和甾醇類等，但這些天然抗氧化劑往往耐熱性不好，遇高溫容易揮發(fā)分解，導(dǎo)致失去抗氧化能力[6].多糖的結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，并且來源廣泛，無毒副作用，因此多糖有望成為新型的天然抗氧化劑.

寧夏枸杞主要分布在中國西北地區(qū)，具有滋腎、潤肺、補肝、明目之功效，現(xiàn)有研究表明枸杞多糖具有促進免疫、抗衰老、抗腫瘤、清除自由基等多種生物活性，是枸杞發(fā)揮功效的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[7].但這些研究多集中在對枸杞粗多糖的活性評價上，對枸杞多糖各單一組分的活性研究較少，阻礙了其構(gòu)效關(guān)系的深入研究.

本研究擬在前期枸杞多糖提取純化等相關(guān)研究[8]基礎(chǔ)上，采用纖維素柱色譜法分離得到枸杞多糖的4個單一組分(LBP 1-4)，采用羥自由基清除能力、超氧離子自由基清除能力、二苯代苦味?；杂苫?DPPH)清除能力、還原力、脂質(zhì)抗氧化能力、ABTS自由基清除能力等六種不同方法評價其體外抗氧化活性的差異，為闡明枸杞多糖抗氧化活性的構(gòu)效關(guān)系奠定理論基礎(chǔ)，并對枸杞多糖作為新型天然抗氧化劑的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

(1)主要材料與試劑：寧夏紅果枸杞，購于西安萬壽路中藥材市場；乙醇；碳酸氫鈉；葡萄糖；濃硫酸；氫氧化鈉；鹽酸；苯酚；1，1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)；鐵氰化鉀(K3Fe(CN)6)；三氯乙酸(TCA)；硫代巴比妥酸(TBA)；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉；抗壞血酸(Vc)；甲醇；三氯化鐵(FeCl3)；雙氧水；石油醚；乙醇；ABTS 過硫化鉀；熒光素鈉鹽；AAPH；冰醋酸；D-半乳糖；氯仿；正丁醇；硫酸亞鐵(FeSO4)；水楊酸；鄰苯三酚；以上試劑均為國產(chǎn)分析純.

(2)主要儀器：CP 213 電子天平，奧豪斯儀器(常州)有限公司；UV-2600系列分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器責(zé)任有限公司；冷凍干燥機，西安比郎生物科技有限公司；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；THERMO Varioskan Flash全波長掃描式多功能酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技有限公司；RE 52-99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；BS-100A 自動部分收集器，上海滬西分析儀器廠有限公司；DEAE-52型纖維素離子交換柱，上海三愛思試劑有限公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 枸杞多糖的提取

將200 g枸杞粉浸泡在1 800 mL的蒸餾水中，超聲預(yù)處理40 min.在40 ℃放置6 h后，過濾，將浸出液濃縮旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)到體積為200 mL.濾渣再溶于1 800 mL的蒸餾水中，重復(fù)提取一次，濃縮旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)到體積為200 mL.將兩次的濃縮液合并.加入4倍體積的95%(v/w)乙醇，然后過夜放置于4 ℃環(huán)境下醇沉后，溶液于4 ℃離心，收集沉淀，沉淀部分再溶于100 mL的蒸餾水中，采用Sevag法[9]除去游離蛋白，將除蛋白后的溶液用玻璃紙在活的自來水下透析2天，將透析好的溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在60 ℃下濃縮到200 mL，進行凍干，凍干12 h后得枸杞粗多糖LBP.

1.2.2 枸杞多糖的分離純化

枸杞多糖(LBP)經(jīng)DEAE-52纖維素離子交換柱層析進行分離[10]，依次用蒸餾水、0.05 mol/L、0.10 mol/L、0.25 mol/L NaHCO3溶液分步洗脫，用自動部分收集儀收集洗脫樣品，調(diào)節(jié)洗脫液流速1 mL/min，每管收集10 mL，收集好后用苯酚-硫酸法測糖含量于490 nm處隔管測定吸光值，以管數(shù)為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線.

1.2.3 測糖含量

總糖含量的測定采用苯酚-硫酸法[11].以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.將葡萄糖配制成濃度為0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL和1.0 mL于試管中，每管用蒸餾水補到2.0 mL.依次加入50μL的80%(w/v)苯酚溶液和2.5 mL的濃硫酸.搖勻后，在室溫下放置20 min，用紫外分光光度計于490 nm處測定光吸收值.用2 mL的蒸餾水作為空白對照，同樣按不同方法操作.平行做三份，求出各個濃度吸光度的平均值.將得到的結(jié)果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)(X)為標(biāo)準(zhǔn)單糖質(zhì)量，縱坐標(biāo)(Y)為平均吸光度值(下同)，進而得糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線.

樣品的總糖含量測定：將枸杞多糖配制成濃度為2 mg/mL的溶液，吸取各樣品溶液0.2 mL(平行三份)，按以上操作方法測定其吸光度值.根據(jù)回歸方程計算各個樣品的總糖含量.

1.2.4 體外抗氧化活性試驗

(1)羥自由基清除能力的測定

采用水楊酸比色法[12]，取1 mL不同濃度的待測液分別于10 mL的試管中，依次加入1 mL 9 mmol/L FeSO4溶液、1 mL 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液，最后加入1 mL 8.8 mmol/L H2O2啟動反應(yīng)，震蕩混勻，于37 ℃下水浴30 min，冷卻，以水作參比在510 nm下測定吸光值A(chǔ)1，每個樣品重復(fù)測定3次，取平均值.

羥自由基清除率計算按公式(1)進行：

(1)

式(1)中：A1-待測液在510 nm下的吸光值；A0-以H2O代替待測液在510 nm下的吸光值.

(2)超氧離子自由基清除能力的測定[13]

取1 mL不同濃度的待測液，依次加入3 mL 50 mmol Tris-HCL緩沖溶液(pH=8.2)，30 ℃水浴20 min，冷卻，加入3 mL 7 mmol/L的鄰苯三酚溶液，震蕩混勻，反應(yīng)3 min，加入1 mL濃鹽酸終止反應(yīng)，在320 nm下測定吸光值A(chǔ)1，每個樣品重復(fù)測定3次，取平均值.

超氧自由基清除率計算按公式(2)進行：

(2)

式(2)中：A1-待測液在320 nm下的吸光值；A0-以H2O代替待測液在320 nm下的吸光值.

(3)DPPH自由基清除能力的測定[14]

取1 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液于10 mL具塞試管中，加入1 mL不同濃度的待測樣液，震蕩均勻，室溫下避光反應(yīng)30 min，在517 nm下測定吸光值A(chǔ)1，每個樣品重復(fù)測定3次，取平均值.

DPPH清除率計算按公式(3)進行：

(3)

式(3)中：A1-待測液在517 nm下的吸光值；A0-以H2O代替待測液在517 nm下的吸光值.

(4)還原力的測定[15]

將不同濃度的樣品溶液1 mL置于比色管中，加入1 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH=6.6)和 0.125 mL的1%(w/v)的鐵氰化鉀，在50 ℃下反應(yīng)20 min，反應(yīng)結(jié)束后，加入0.125 mL 的10%(w/v)的三氯乙酸(TCA)終止反應(yīng)，最后加入1.5 mL的0.1%(w/v) FeCl3顯色，搖勻后，于700 nm處測定吸光值.空白參比為蒸餾水代替樣品溶液，Vc作為對照組.吸光值越強表明寡糖的還原能力越強.

(5)脂質(zhì)抗氧化[16]

取0.4 mL 10%蛋黃，加入50μL不同濃度樣品溶液，再加入 50μL 40 mmol/L AAPH，混勻，37 ℃溫浴1 h，再加入1 mL 10% TCA(三氯乙酸)，1 mL 0.67% TBA(硫代巴比妥酸)，50μL 2 mol/L鹽酸，2 mL 0.1 mol/L PBS(pH=7.4)，混勻，沸水浴15 min，立即放入冰水浴，冷卻，5 000轉(zhuǎn)離心10 min，取上清液，于532 nm處測吸光值A(chǔ)1，每個樣品重復(fù)測定3次，取平均值.

脂質(zhì)抗氧化能力計算按公式(4)進行：

(4)

式(4)中：A1-待測液在532 nm下的吸光值；A0-以H2O代替待測液在532 nm下的吸光值.

(6)ABTS自由基清除能力測定

參照Marcin等[17]改進后進行實驗：以去離子水將ABTS自由基和過硫酸鉀分別溶解14 mmol/L和4.9 mmol/L，等體積混合，在室溫避光條件下靜置.測定時，將ABTS自由基儲備液以0.1 mol/L PBS溶液(pH=7)稀釋，使其在734 nm處吸光度達(dá)0.70，形成ABTS自由基測定液.測定時將200 uL ABTS自由基測定液和50 uL不同濃度待測液加入到96孔板中，振蕩30 s，測定反應(yīng)20 min后于734 nm處的吸光值A(chǔ)1，以PBS為空白對照代替樣品測量A0.ABTS自由基清除率計算按公式(5)進行：

(5)

式(5)中：A1-待測液在734 nm下的吸光值；A0-以H2O代替待測液在734 nm下的吸光值.

2 結(jié)果與討論

2.1 枸杞多糖洗脫曲線

用蒸餾水、0.05 mol/L、0.10 mol/L、0.25 mol/L NaHCO3溶液分步洗脫，用自動部分收集儀收集洗脫樣品，用苯酚-硫酸法分析，得圖1所示洗脫曲線，得對應(yīng)四個組分：LBP1、LBP2、LBP3、LBP4.

圖1 枸杞多糖洗脫曲線

將所得各組分糖溶液冷凍干燥得到多糖組分，多糖得率計算按公式(6)進行：

(6)

式(6)中：m-枸杞多糖LBP1-4各組分質(zhì)量；m0-枸杞多糖LBP上樣量.

計算得各枸杞多糖組分得率分別為0.012%、0.008%、0.007%和 0.015%.

2.2 枸杞多糖糖含量測定

圖2為通過苯酚-硫酸法測得葡萄糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線對應(yīng)方程為Y=10.57X+0.041 7，R2=0.999 3，在0～0.20 mg內(nèi)線性關(guān)系良好.

圖2 苯酚-硫酸法測糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

將枸杞多糖測得吸光值代入上述方程計算得各組分糖含量如表1所示.

表1 枸杞多糖各組分糖含量

2.3 枸杞多糖體外抗氧化

2.3.1 羥自由基清除能力的測定

由圖3可知，枸杞多糖有顯著的清除羥基自由基的能力，且表現(xiàn)出良好的劑量依賴關(guān)系.隨著質(zhì)量濃度的升高其清除能力增強，且羥基自由基清除效果增強，當(dāng)多糖濃度達(dá)到3 mg/mL時，LBP1對羥基自由基清除率達(dá)65.81±1.31%，LBP2對羥基自由基清除率達(dá)77.13±1.14%，LBP3對羥基自由基清除率達(dá)76.50±0.92%，LBP4對羥基自由基清除率達(dá)74.15±0.89%，VC對羥基自由基清除率達(dá)62.58±0.44%.結(jié)合表2半數(shù)有效抑制濃度(IC50)分析可知，四種多糖羥自由基清除能力與VC比較，其能力由強到弱為LBP4>LBP3>LBP1>LBP2>VC.

表2 羥自由基清除半數(shù)有效抑制濃度

*代表有顯著性差異(p<0.05)

2.3.2 超氧離子自由基清除能力的測定

由圖4可知，枸杞多糖有顯著的清除超氧離子自由基的能力，且表現(xiàn)出較好的劑量依賴關(guān)系.隨著質(zhì)量濃度的升高其清除能力增強，超氧離子自由基清除效果增強.當(dāng)多糖濃度達(dá)到3 mg/mL時，LBP1對超氧離子自由基清除率達(dá)60.14±1.13%，LBP2對超氧離子自由基清除率達(dá)76.27±0.85%，LBP3對超氧離子自由基清除率達(dá)64.51±0.95%，LBP4對超氧離子自由基清除率達(dá)85.13±1.55%，結(jié)合表3半數(shù)有效抑制濃度(IC50)分析可知,四種多糖超氧離子自由基清除能力與VC比較，其能力由強到弱為：LBP4>VC>LBP2>LBP3>LBP1.

圖4 超氧離子自由基清除能力評價

表3 超氧離子自由基清除半數(shù)有效抑制濃度

*代表有顯著性差異(p<0.05)

2.3.3 DPPH自由基清除能力的測定

由圖5可知，枸杞多糖對DPPH自由基有較好的清除能力，且表現(xiàn)出良好的劑量依賴關(guān)系.隨著質(zhì)量濃度的升高其清除能力增強.當(dāng)多糖濃度達(dá)到3 mg/mL時，LBP1對DPPH自由基清除率達(dá)80.41±2.14%，LBP2對DPPH自由基清除率達(dá)50.13±1.58%，LBP3對DPPH自由基清除率達(dá)51.85±1.02%，LBP4對DPPH自由基清除率達(dá)52.29±0.78%.VC對DPPH自由基清除率達(dá)94.92±0.34%，結(jié)合表4半數(shù)有效抑制濃度(IC50)分析可知,四種多糖對DPPH自由基清除能力與VC比較，其能力由強到弱為：VC>LBP1>LBP3>LBP2>LBP4.

圖5 DPPH自由基清除能力評價

表4 DPPH自由基清除半數(shù)有效抑制濃度

*代表有顯著性差異(p<0.05)

2.3.4 還原力的測定

由圖6可知，枸杞多糖有一定還原力，且LBP2表現(xiàn)出較好的質(zhì)量依賴性，當(dāng)多糖濃度達(dá)到3 mg/mL時，其還原力與VC近似，此時LBP1、LBP2、LBP3、LBP4、VC吸光值分別為0.135±0.34，2.946±2.41，0.909±0.78，1.433±1.13，2.896±2.87.

圖6 還原力評價

2.3.5 脂質(zhì)抗氧化能力的測定

由圖7可知，枸杞多糖有良好的雞蛋脂質(zhì)抗氧化，且表現(xiàn)出良好的劑量依賴關(guān)系.隨著質(zhì)量濃度的升高其清除能力增強，當(dāng)多糖濃度達(dá)2 mg/mL時，LBP1對雞蛋脂質(zhì)氧化物清除率達(dá)61.6%±1.55%，LBP2對雞蛋脂質(zhì)氧化物清除率達(dá)61.0%±2.15%，LBP3對雞蛋脂質(zhì)氧化物清除率達(dá)65.87%±1.46%，LBP4對雞蛋脂質(zhì)氧化物清除率達(dá)62.85%±1.57%，四組分對雞蛋脂質(zhì)氧化物清除能力相近.

圖7 脂質(zhì)抗氧化清除能力評價

2.3.6 ABTS自由基清除能力測定

由圖8可知，枸杞多糖對ABTS自由基有良好的清除能力.隨著時間推進，溶液體系吸光值顯著下降，表明枸杞多糖對ABTS自由基有一定清除能力，且隨著濃度加大其清除能力明顯增強;當(dāng)LBP1濃度達(dá)0.4 mol/L時，其在60 min時對ABTS清除率可達(dá)56.1%;當(dāng)LBP2濃度達(dá)0.4 mol/L時，其在60 min時對ABTS清除率可達(dá)62.7%;當(dāng)LBP3濃度達(dá)0.4 mol/L時，其在60 min時對ABTS清除率可達(dá)63.2%;當(dāng)LBP4濃度達(dá)0.4 mol/L時，其在60 min時對ABTS清除率可達(dá)52.9%，四個組分ABTS自由基清除能力相近.四組分縱向?qū)Ρ劝l(fā)現(xiàn)LBP3對ABTS自由基清除能力最強.

(b)LBP2 ABTS自由基清除能力評價

(c)LBP3 ABTS自由基清除能力評價

3 結(jié)論

細(xì)胞在正常的代謝和生長過程中產(chǎn)生的一系列活性氧(reactive oxygen species，ROS)，如超氧陰離子(superoxide anion，·O2-)、羥自由基(hydroxyl radicals，·OH)和過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)等是毒性很強的自由基，能誘導(dǎo)膜系統(tǒng)的氧化損傷，會使膜的通透性增加，從而對細(xì)胞造成損傷.近年來，天然抗氧化物質(zhì)的研究開發(fā)成為熱點,目前,從中藥材提取活性多糖、黃酮、多酚類、維生素類等成分來清除氧自由基，抑制氧化應(yīng)激受到廣泛關(guān)注[18,19].

本文通過評估枸杞多糖對·O2-、·OH、DPPH和ABTS自由基的清除能力以及枸杞多糖的還原能力和脂質(zhì)抗氧化活性，考察了4個枸杞多糖組分的抗氧化活性.研究結(jié)果表明，4個枸杞多糖組分對·O2-、·OH、DPPH和ABTS自由基有較好的清除能力，同時具有較好的還原能力與脂質(zhì)抗氧化活性，有望被開發(fā)成天然抗氧化劑應(yīng)用于食品與醫(yī)藥領(lǐng)域.相比于黃芪多糖、山藥多糖、海帶多糖等其他藥食同源多糖，枸杞多糖表現(xiàn)出優(yōu)越的抗氧化活性，常與其他具有抗氧化的多糖復(fù)合配伍，產(chǎn)生正協(xié)同效應(yīng)，提高抗氧化活性[20-22].綜上所述，鑒于枸杞多糖良好的抗氧化活性，后續(xù)研究將集中于其在更多真實食品體系的抗氧化能力評價，為枸杞多糖的深入開發(fā)利用提供理論依據(jù).