硫化氫在緩解擬南芥鎘脅迫中的作用

賈紅磊，劉珂娜，劉 洋，楊 珺

(陜西科技大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 710021)

0 引言

鎘是植物生長(zhǎng)的非必需因素，是目前廣泛存在的重金屬污染源之一.近年來，隨著資源的開發(fā)與利用，造成土壤中重金屬含量升高，其中鎘成為我國(guó)農(nóng)田土壤重金屬污染的主要元素之一[1].由于鎘存在著強(qiáng)毒性與可遷移性，當(dāng)在環(huán)境中積累到一定水平時(shí)容易被植物的根系吸收，并可被運(yùn)輸?shù)降厣喜糠?，通過食物鏈進(jìn)入人體，對(duì)身體健康造成潛在的威脅.過量的鎘會(huì)通過損傷植物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、抑制細(xì)胞分裂、破壞酶活等方式直接或間接抑制植物的生理過程，最終抑制植物生長(zhǎng)甚至導(dǎo)致植物死亡[2].作物受重金屬脅迫時(shí)主要表現(xiàn)為株高和根都會(huì)比正常植株矮、細(xì)黃、結(jié)實(shí)率下降.近年來，如何解除或緩解重金屬脅迫成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)科學(xué)問題.

硫化氫(H2S)是一種無色有臭雞蛋氣味的氣體，并且也是一種重要的氣體信號(hào)分子.目前,氣體信號(hào)分子有NO、CO和H2S三種，在動(dòng)物體內(nèi)H2S的產(chǎn)生機(jī)制和生理作用已經(jīng)被充分證明，目前關(guān)于植物體內(nèi)H2S 的合成及功能研究也取得了較大進(jìn)展[3].H2S參與了許多植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程，如調(diào)節(jié)氣孔運(yùn)動(dòng)、促進(jìn)根的發(fā)育和增強(qiáng)光合作用、緩解干旱、滲透和金屬離子等多種非生物脅迫造成的傷害等[4].H2S通過調(diào)控基因表達(dá)、離子通道活性等參與植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)等過程，其與活性氧(ROS)、NO、CO、Ca2+，以及脫落酸(ABA)、茉莉酸(Ja)、赤霉素(Ga)、生長(zhǎng)素、乙烯等植物激素信號(hào)路徑存在相互作用.最近研究表明，外源生理濃度 H2S可通過上調(diào)病程相關(guān)基因的表達(dá)和一些次級(jí)代謝產(chǎn)物的含量，增強(qiáng)植物抵抗生物脅迫能力[5].

綜上所述，H2S信號(hào)可從不同水平增強(qiáng)植物應(yīng)答各種非生物脅迫和生物脅迫的能力，并參與調(diào)節(jié)植物的整個(gè)生長(zhǎng)、發(fā)育、成熟和衰老過程.Jin等[6]證明硫化氫通過與脫落酸(ABA)的互作影響氣孔的關(guān)閉，進(jìn)而提高擬南芥的抗旱性.另外，NaSH處理也誘導(dǎo)了干旱相關(guān)基因的表達(dá)，表明H2S還參與了擬南芥對(duì)干旱脅迫的響應(yīng).目前關(guān)于H2S對(duì)擬南芥抗重金屬脅迫的研究相對(duì)較少.

本研究以模式植物擬南芥為材料，用NaSH作為供體提供H2S，采用培養(yǎng)基培養(yǎng)擬南芥分析鎘脅迫的條件下外源H2S信號(hào)對(duì)植物生理生化指標(biāo)的影響，探究H2S在提高擬南芥對(duì)鎘抗性中的作用，為鎘污染的防治提供理論依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料及培養(yǎng)

擬南芥種子野生型購(gòu)自于ABRC公司，將春化后的擬南芥種子經(jīng)10%的次氯酸鈉溶液消毒10 min后，用無菌水沖洗5～6次播種于含1%蔗糖和0.8%瓊脂的1/2 MS培養(yǎng)基(pH 5.8)上，播種好的培養(yǎng)皿垂直放置于人工氣候箱中，使種子呈水平排列，進(jìn)行垂直培養(yǎng).培養(yǎng)條件為恒溫22 ℃，相對(duì)濕度(H):75%，16 h光照/8 h黑暗周期[7].

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 種子萌發(fā)測(cè)定

將擬南芥種子分別播種于空白培養(yǎng)基、含有50μmol/L CdCl2、50μmol/L NaSH(用以提供H2S)、50μmol/L CdCl2+50μmol/L NaSH的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件如1.1.播種后按式(1)計(jì)算不同處理培養(yǎng)基中48 h、72 h、96 h種子的萌發(fā)率.

萌發(fā)率=發(fā)芽種子數(shù)/受試種子數(shù)×100%

(1)

1.2.2 根長(zhǎng)測(cè)定

擬南芥種子在基礎(chǔ)1/2 MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)5 d后，將幼苗轉(zhuǎn)移至含有不同處理?xiàng)l件的培養(yǎng)基中繼續(xù)垂直培養(yǎng)3 d，對(duì)幼苗進(jìn)行成像，并用Image-J測(cè)量根長(zhǎng)度[8].

1.2.3 離子滲透率的測(cè)定

將7日齡擬南芥幼苗在含有不同化學(xué)物質(zhì)的1/2 MS瓊脂培養(yǎng)基上處理5 d.處理后，收集擬南芥根并用去離子水中洗滌3次以上，去除表面附著的電解質(zhì).然后，將待測(cè)樣品放置于含有10 mL去離子水的試管中，25 ℃條件溫育3 h.溫育后，測(cè)定浴液中的電導(dǎo)率C1，并測(cè)定去離子水的電導(dǎo)率C0.之后將樣品在沸水中加熱1 h，然后在測(cè)量浴液中總電導(dǎo)率C2，按式(2)計(jì)算離子滲透率.

(2)

1.2.4 葉綠素含量測(cè)定

葉綠素用體積分?jǐn)?shù)為80%的丙酮提取，之后用分光光度法測(cè)定，計(jì)算葉綠素a、葉綠素b及總?cè)~綠素的含量.

1.2.5 MDA、SOD含量測(cè)定

MDA含量的測(cè)定采用硫代巴比妥酸法[9]，SOD活性的測(cè)定采用氯化硝基四氮唑藍(lán)法(NTB)[9].

1.3 數(shù)據(jù)分析

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用Orign7.0、Image J及SPSS7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和顯著性分析.所有數(shù)據(jù)均為三次試驗(yàn)平均值.

2 結(jié)果與討論

2.1 鎘脅迫下H2S對(duì)擬南芥生長(zhǎng)的影響

2.1.1 對(duì)擬南芥萌發(fā)率的影響

種子萌發(fā)是系統(tǒng)認(rèn)識(shí)重金屬傷害機(jī)理的較好途徑，有助于了解鎘脅迫下H2S擬南芥的影響.最近的研究發(fā)現(xiàn)，適宜濃度的外源H2S(NaSH)預(yù)處理可提高大豆種子的發(fā)芽率[10]. 本實(shí)驗(yàn)條件下種子的發(fā)芽率如圖1所示.結(jié)果表明，在50μmol/L的CdCl2濃度下及加入外源H2S后，擬南芥種子的發(fā)芽率與對(duì)照組相比沒有顯著性差異，說明50μmol/L的CdCl2并不影響擬南芥種子萌發(fā).

圖1 不同處理對(duì)擬南芥萌發(fā)率的影響

2.1.2 對(duì)根長(zhǎng)的影響

重金屬影響植物的作用機(jī)理主要包括抑制植物根尖細(xì)胞的分裂或根的伸長(zhǎng)、影響植物激素的分布或細(xì)胞死亡等[11].高濃度的鎘嚴(yán)重影響植物幼苗根的生長(zhǎng)[2].H2S作為一種氣體信號(hào)分子還可能參與根發(fā)育的調(diào)控，一些研究結(jié)果顯示H2S可能通過IAA和NO來誘導(dǎo)植物不定根的發(fā)生[12].如圖2所示，用50μmol/L的Cd2+處理后，其根長(zhǎng)明顯較對(duì)照組的幼苗短，與對(duì)照組相比主根長(zhǎng)度降低54.37 %，說明50μmol/L濃度的Cd2+能夠顯著抑制擬南芥根伸長(zhǎng)，對(duì)擬南芥的根部生長(zhǎng)造成了損傷.同時(shí)，與鎘脅迫處理相比，鎘脅迫下外源H2S(NaSH+Cd2+)處理下根長(zhǎng)明增加，上調(diào)比例為48.94 %，說明外源添加H2S后，能夠在一定程度上緩解Cd對(duì)擬南芥根生長(zhǎng)的抑制作用，緩解Cd的脅迫作用，從而有助于提高擬南芥的抗逆性.

圖2 不同處理對(duì)擬南芥根長(zhǎng)的影響

2.2 鎘脅迫下H2S對(duì)擬南芥生理指標(biāo)的影響

2.2.1 離子滲透率的影響

當(dāng)植物處于逆境環(huán)境時(shí)，膜結(jié)構(gòu)被破壞導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加，使細(xì)胞電解質(zhì)外滲.如圖3所示，與對(duì)照組相比50μmol/L CdCl2處理?xiàng)l件下，擬南芥的離子滲透率上調(diào)48.79 %，表明50μmol/L的CdCl2對(duì)擬南芥膜通透性造成損傷.此外再加入外源添加NaSH后，離子滲透率下降26.77 %，說明外源H2S在一定程度上能緩解Cd對(duì)植物細(xì)胞膜造成的損害.

圖3 不同處理對(duì)擬南芥離子滲透率的影響

2.2.2 對(duì)葉綠素含量的影響

重金屬能通過破壞光合過程中電子傳遞和葉綠素完整性影響植物光合作用，許多植物在重金屬脅迫下都出現(xiàn)了葉片失綠現(xiàn)象[13].有研究表明擬南芥在鎘處理下，葉綠素a、葉綠素b、胡蘿卜素含量減少，說明鎘對(duì)擬南芥的葉綠體造成了損傷[14].圖4顯示，與對(duì)照組相比在50μmol/L的Cd2+脅迫下，擬南芥葉綠素含量下降33.45 %.同時(shí)，在添加外源NaSH后與鎘脅迫處理相比葉綠素含量上升45.83 %.說明在外源H2S供體NaSH的作用下，Cd對(duì)擬南芥的葉綠素的破壞作用得到了減緩，由此可見外源H2S是能夠緩解鎘脅迫對(duì)擬南芥葉綠素含量造成的影響.

圖4 不同處理對(duì)擬南芥葉綠素含量的影響

2.2.3 MDA含量

MDA是鎘脅迫下植物體內(nèi)活性氧類物質(zhì)大量積累所造成的膜脂過氧化的產(chǎn)物之一.正常條件下，植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡.在鎘脅迫下平衡被破壞導(dǎo)致活性氧大量積累，從而激活植物體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)，誘導(dǎo)抗氧化酶活性發(fā)生變化[15].MDA的含量可反應(yīng)膜脂過氧化的程度，間接表明膜系統(tǒng)受損程度及植物的抗逆性.圖5表明，與對(duì)照組相比50μmol/L的CdCl2處理的擬南芥幼苗MDA含量顯著上升，升高154.16%，說明50μmol/L濃度的CdCl2使擬南芥體內(nèi)積累的活性氧自由基導(dǎo)致了膜脂過氧化.同時(shí)，在加入外源H2S后，與鎘脅迫下相比MDA含量明顯下降63.93 %.可見，外源H2S可緩解鎘脅迫下擬南芥的膜脂過氧化程度.

圖5 不同處理對(duì)擬南芥MDA含量的影響

2.2.4 SOD含量的測(cè)定

SOD是一種廣泛存在于動(dòng)植物中的金屬酶，可以催化氧自由基的歧化反應(yīng)，生成過氧化氫，過氧化氫又可以進(jìn)一步被過氧化氫酶轉(zhuǎn)化為水和分子氧，該酶和植物的抗逆性及衰老有關(guān)，是清除植物體內(nèi)活性氧的第一道防線.在鎘濃度相對(duì)較低的情況下，植物通過提高抗氧化酶的活性來降低體內(nèi)的過氧化自由基；但是在鎘濃度過高的情況下則會(huì)與抗氧化酶的巰基結(jié)合，導(dǎo)致酶的催化中心或酶結(jié)構(gòu)受損，造成其活性的降低[16].圖6顯示，在50μmol/L的鎘脅迫下，與對(duì)照組相比，擬南芥的SOD活性下降16.70%.外源H2S處理提高了鎘脅迫下SOD活性，與受50μmol/L CdCl2處理相比，SOD活性升高13.90 %.此結(jié)果表明外源H2S能夠提高SOD的活力，降低擬南芥在鎘脅迫下·O2-的含量，提高了擬南芥的抗逆性.

圖6 不同處理對(duì)擬南芥SOD值的影響

3 結(jié)論

通過本研究發(fā)現(xiàn)，50μmol/L鎘脅迫會(huì)抑制擬南芥根生長(zhǎng)，降低葉綠素含量，增加MDA導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的氧化損傷，引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的破壞，降低SOD含量，提高種子中·O2-的含量，進(jìn)而影響植物的正常生長(zhǎng)；H2S供體NaSH處理能夠通過誘導(dǎo)鎘脅迫下提升SOD的活力，降低·O2-含量，說明H2S可以提高Cd2+脅迫下擬南芥的抗逆性，促進(jìn)擬南芥幼苗的生長(zhǎng)；H2S供體NaSH處理一定程度上延緩MDA含量的上升，減緩膜脂過氧化，保護(hù)膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，為細(xì)胞的正常代謝提供了良好環(huán)境.