不同產(chǎn)地抱莖苦荬菜的HPLC指紋圖譜研究△

楊非凡，張亞妮，武媛媛，李亞梅，王燕秋，李遇伯*

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，天津 300193；2.吉林通化華夏藥業(yè)有限責(zé)任公司，吉林 通化 134000)

抱莖苦荬菜具有清熱解毒、鎮(zhèn)痛抗炎、涼血消腫之功效，為苦碟子(碟脈靈)注射液的原料藥材?？嗟幼⑸湟壕哂谢钛雇础⑶鍩犰铕龅淖饔肹1]，臨床常用于瘀血閉阻的胸痹、冠心病、心絞痛、腦梗死等。抱莖苦荬菜中的主要化學(xué)成分為黃酮類、有機(jī)酸類、核苷類、氨基酸類及倍半萜內(nèi)酯類成分，研究表明其具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、擴(kuò)張冠脈及降低冠脈血管阻力、抗腫瘤活性等藥理作用[2-5]。不同產(chǎn)地的抱莖苦荬菜各化學(xué)成分含量也有一定的差異，這些差異進(jìn)而對(duì)藥效產(chǎn)生了直接影響，因而產(chǎn)生了道地藥材與非道地藥材之分[6]。有研究證明不同產(chǎn)地抱莖苦荬菜確實(shí)存在異質(zhì)性的物質(zhì)基礎(chǔ)[7]，隨著中藥注射液安全性備受關(guān)注，中藥注射液安全性再評(píng)價(jià)指導(dǎo)原則對(duì)中藥注射液原藥材的質(zhì)量控制提出了明確要求，所以建立一個(gè)有效的中藥材質(zhì)量控制方法就成為了迫在眉睫的任務(wù)，而中藥指紋圖譜作為現(xiàn)代中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系的核心技術(shù)，是多學(xué)科交叉、綜合技術(shù)手段對(duì)復(fù)雜物質(zhì)組成體系質(zhì)量穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)的檢測(cè)方法[8-15]。抱莖苦荬菜質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)[16]中，但因不同的檢測(cè)機(jī)構(gòu)及企業(yè)所具有的實(shí)驗(yàn)條件是不同的，故在具體實(shí)驗(yàn)操作時(shí)可能存在儀器的不適用性等問(wèn)題，故本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同產(chǎn)地的抱莖苦荬菜進(jìn)行HPLC色譜分析，并進(jìn)行了儀器適用性考察，在使用率最高的Agilent、Waters、Shimadzu三個(gè)型號(hào)的儀器上進(jìn)行儀器精密度、方法重復(fù)性以及樣品穩(wěn)定性驗(yàn)證，均符合指紋圖譜分析方法學(xué)要求，最終建立了抱莖苦荬菜的對(duì)照指紋圖譜。

1 儀器與材料

Agilent Technologies 1200高效液相色譜系統(tǒng)(含四元泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱，1260 DAD檢測(cè)器；美國(guó)Agilent公司)；Waters 2695高效液相液相色譜儀(含四元泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱，2698 DAD檢測(cè)器；美國(guó)Waters公司)；Shimadzu LC-20AT液相色譜儀(含二元泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，LC-20AT PDA檢測(cè)器；日本島津公司)；M320型外接柱溫箱(Tianjin Puxiang)。

乙腈(Sigma公司，美國(guó)，色譜純)；甲醇(Sigma公司，美國(guó)，色譜純)；磷酸(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)；純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)。腺苷對(duì)照品(批號(hào)：110879-200202)、菊苣酸對(duì)照品(批號(hào)：111752-200902)，均購(gòu)買于中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度均大于98%；木犀草素-7-O-β-D葡萄糖醛酸苷對(duì)照品由通化華夏藥業(yè)公司提供，純度大于98%。抱莖苦荬菜藥材(通化華夏藥業(yè)公司提供)均經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)王玉明專家鑒定為菊科植物抱莖苦荬菜Ixerissonchifolia(Bge.)Hanc。樣品清單如表1所示。

表1 抱莖苦荬菜樣品清單

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 供試品溶液制備 取抱莖苦荬菜藥材10 g，去除泥土、樹枝、偽品等雜物及發(fā)霉、變黑、帶根的藥材，挑選時(shí)應(yīng)注意保護(hù)花、葉等藥用部位，沖洗至凈，切成3～5 cm的段。加10倍量純凈水浸泡1 h，煎煮1 h，第二次加8倍量純凈水煎煮0.5 h，煎煮液合并，加純凈水配制成濃度為每1 mL相當(dāng)于原生藥0.05 g的生藥提取液。取配制好的生藥提取液(0.05 g·mL-1)，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.1.2 對(duì)照品溶液制備 取腺苷、木犀草素7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷和菊苣酸對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇-水(25∶75)配制成每1 mL含腺苷5 μg，木犀草素7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷150 μg，菊苣酸60 μg的溶液，即得。所配制的溶液4 ℃保存。

2.2 色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，Part No.WAT054275，Lot No.0294353071；檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm；流動(dòng)相：0.2%磷酸溶液(A)-乙腈(B)，洗脫梯度如表2所示；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：40 ℃。

表2 抱莖苦荬菜指紋圖譜梯度洗脫程序

2.3 抱莖苦荬菜HPLC指紋圖譜共有峰及參照峰篩選

將3個(gè)不同產(chǎn)地的抱莖苦荬菜按照2.1.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.2項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件(2.0版，國(guó)家藥典委員會(huì)，2010)進(jìn)行分析，獲得不同產(chǎn)地抱莖苦荬菜指紋圖譜疊加圖，自動(dòng)指認(rèn)共有峰，在已指認(rèn)的共有峰中手動(dòng)選擇與藥效相關(guān)的成分以及峰面積較高的9個(gè)成分為抱莖苦荬菜指紋圖譜的共有色譜峰。按照2.1.2項(xiàng)下方法制備對(duì)照品溶液，照2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，選擇腺苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷以及菊苣酸三個(gè)與藥效有關(guān)的成分為參照色譜峰，見圖1。

注：峰1.腺苷；峰2.木犀草素-7-O-β-D-葡糖醛酸苷；峰3.菊苣酸。圖1 Agilent儀器參照物色譜指紋圖譜

2.4 Agilent儀器方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取1605001批抱莖苦荬菜藥材10.00 g，按2.1.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.2項(xiàng)下所示的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，各特征峰的峰面積RSD均小于2.8%，精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取1605001批抱莖苦荬菜藥材，按2.1.1項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按照2.2項(xiàng)下所示的色譜條件進(jìn)樣分析，各特征峰的峰面積RSD均小于2.9%，重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取1605001批抱莖苦荬菜藥材10.00 g，按2.1.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.2項(xiàng)下所示的色譜條件在樣品制備后0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣分析，各特征峰的峰面積RSD均小于2.4%，樣品放置24 h穩(wěn)定。

2.5 Waters儀器方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 精密度試驗(yàn) 取1605001批抱莖苦荬菜藥材10.00 g，按2.1.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.2項(xiàng)下所示的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，各特征峰的峰面積RSD均小于2.9%，精密度良好。

2.5.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取1605001批抱莖苦荬菜藥材，按2.1.1項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按照2.2項(xiàng)下所示的色譜條件進(jìn)樣分析，各特征峰的峰面積RSD均小于2.8%，重復(fù)性良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取1605001批抱莖苦荬菜藥材10.00 g，按2.1.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.2項(xiàng)下所示的色譜條件在樣品制備后0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣分析，各特征峰的峰面積RSD均小于2.9%，樣品放置24 h穩(wěn)定。

2.6 Shimadzu儀器方法學(xué)驗(yàn)證

2.6.1 精密度試驗(yàn) 取1605001批抱莖苦荬菜藥材10.00 g，按2.1.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.2項(xiàng)下所示的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，各特征峰的峰面積RSD均小于2.7%，精密度良好。

2.6.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取1605001批抱莖苦荬菜藥材，按2.1.1項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按照2.2項(xiàng)下所示的色譜條件進(jìn)樣分析，各特征峰的峰面積RSD均小于2.7%，重復(fù)性良好。

2.6.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取1605001批抱莖苦荬菜藥材10.00 g，按2.1.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.2項(xiàng)下所示的色譜條件在樣品制備后0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣分析，各特征峰的峰面積RSD均小于2.7%，樣品放置24 h穩(wěn)定。

2.7 HPLC分析及數(shù)據(jù)導(dǎo)出

將19批藥材按2.1.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.2項(xiàng)下所示的色譜方法用Agilent、Waters、Shimadzu三臺(tái)液相色譜儀分析檢驗(yàn)，通過(guò)儀器自帶工作站處理并導(dǎo)出AIA格式色譜數(shù)據(jù)，儀器的積分參數(shù)設(shè)置為如下：

Agilent：Slope Sensitivity(斜率靈敏度)5，Peak Width(峰寬)0.05，Area Reject(最小峰面積)1，Height Reject(最小峰高)1；

Waters：閾值50，峰寬30，最小峰面積1000，最小峰高0；

Shimadzu：斜率2000，半峰寬5，最小峰面積/峰高 1000。

2.8 對(duì)照指紋圖譜建立

打開中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件(2.0版，國(guó)家藥典委員會(huì)，2010)，工作模式選擇生成對(duì)照，導(dǎo)入儀器所分析的原始數(shù)據(jù)；參照?qǐng)D譜參數(shù)設(shè)置分別為：參照?qǐng)D譜編號(hào)為S1，對(duì)照?qǐng)D譜生成方法為中位數(shù)法，時(shí)間窗寬度默認(rèn)為0.1；在多點(diǎn)校正模塊下選擇9個(gè)共有特征峰；峰匹配方式選擇Mark峰匹配；匹配完成后點(diǎn)擊生成對(duì)照，即可得到對(duì)照指紋圖譜，將所得的對(duì)照?qǐng)D譜保存，以備分析檢驗(yàn)時(shí)使用。點(diǎn)擊匹配數(shù)據(jù)和計(jì)算相似度按鈕，查看并保存匹配結(jié)果。抱莖苦荬菜對(duì)照指紋圖譜如圖2所示。

2.9 儀器適用性考察

2.9.1 Agilent 儀器 將19批藥材按2.1.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.2項(xiàng)下所示的色譜方法用Agilent液相色譜儀分析檢驗(yàn)，通過(guò)儀器自帶工作站處理并導(dǎo)出AIA格式色譜數(shù)據(jù)，儀器的積分參數(shù)設(shè)置為如2.4項(xiàng)所示，按照2.8項(xiàng)下的方法建立對(duì)照指紋圖譜，19批藥材匹配色譜圖如圖3所示，共有峰相對(duì)鋒面積如表3所示。

2.9.2 Waters儀器 將19批藥材按2.1.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.2項(xiàng)下所示的色譜方法用Waters液相色譜儀分析檢驗(yàn)，通過(guò)儀器自帶工作站處理并導(dǎo)出AIA格式色譜數(shù)據(jù)，儀器的積分參數(shù)設(shè)置為如2.5項(xiàng)所示，按照2.8項(xiàng)下的方法建立對(duì)照指紋圖譜，19批藥材匹配色譜圖如圖4所示，共有峰相對(duì)鋒面積如表4所示。

2.9.3 Shimadzu儀器 將19批藥材按2.1.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.2項(xiàng)下所示的色譜方法用 Shimadzu液相色譜儀分析檢驗(yàn)，通過(guò)儀器自帶工作站處理并導(dǎo)出AIA格式色譜數(shù)據(jù)，儀器的積分參數(shù)設(shè)置為如2.4項(xiàng)所示，按照2.5項(xiàng)下的方法建立對(duì)照指紋圖譜，19批藥材匹配色譜圖如圖5所示，共有峰相對(duì)鋒面積如表5所示。

注：峰1(S).腺苷；峰7(S).木犀草素-7-O-β-D-葡糖醛酸苷；峰8(S).菊苣酸。圖2 抱莖苦荬菜對(duì)照指紋圖譜

注：峰1(S).腺苷；峰7(S).木犀草素-7-O-β-D-葡糖醛酸苷；峰8(S).菊苣酸。圖3 Agilent儀器19批藥材匹配色譜圖

批號(hào)12345678913050010.102 0 0.066 6 0.042 5 0.309 5 0.138 2 0.092 4 1 0.848 6 0.170 1 13050020.115 8 0.059 0 0.051 5 0.339 0 0.125 5 0.077 2 1 0.876 2 0.196 2 13050030.097 0 0.061 2 0.049 0 0.351 8 0.096 9 0.076 5 1 0.839 1 0.172 5 13060100.093 7 0.056 9 0.041 7 0.338 9 0.101 8 0.074 0 1 0.800 1 0.105 8 14050010.089 8 0.040 4 0.043 8 0.238 5 0.088 6 0.051 2 1 0.701 8 0.125 0 14050020.162 9 0.098 6 0.087 3 0.376 9 0.196 5 0.096 0 1 0.742 3 0.166 9 14050030.302 2 0.185 2 0.124 8 0.391 2 0.220 9 0.211 9 1 0.735 5 0.194 2 14050040.123 4 0.058 2 0.058 3 0.384 7 0.127 1 0.077 4 1 0.884 1 0.146 4 14060100.114 9 0.080 5 0.055 5 0.441 2 0.136 5 0.063 5 1 1.067 0 0.141 5 14060120.095 1 0.052 6 0.047 0 0.376 3 0.156 2 0.066 0 1 1.063 00.123 1 15050010.100 5 0.062 7 0.054 8 0.282 3 0.080 7 0.035 4 1 0.638 8 0.142 3 15050020.177 4 0.125 2 0.127 2 0.370 6 0.103 3 0.035 9 1 0.876 3 0.190 5 15060030.099 0 0.071 3 0.041 0 0.249 3 0.095 6 0.056 0 1 0.682 4 0.137 2 15060040.116 1 0.064 7 0.054 0 0.326 0 0.129 1 0.086 0 1 0.898 3 0.161 9 16050010.164 8 0.083 6 0.095 3 0.421 7 0.130 3 0.080 8 1 0.970 3 0.150 9 16050020.077 4 0.041 5 0.045 6 0.251 5 0.105 5 0.059 9 1 0.549 2 0.119 1 16060030.352 8 0.249 3 0.265 1 0.617 5 0.197 2 0.083 4 1 0.767 4 0.188 9 16050040.083 2 0.054 6 0.050 7 0.233 1 0.075 0 0.024 1 1 0.425 6 0.159 9 16050060.070 7 0.043 2 0.027 5 0.330 10.104 6 0.062 1 1 0.906 3 0.148 4

圖4 Waters儀器19批藥材匹配色譜圖

批號(hào)12345678913050010.249 00.036 10.020 40.276 70.036 90.020 81 1.627 00.616 413050020.117 30.060 90.052 90.474 80.101 80.030 41 1.081 00.174 413050030.086 40.063 80.047 00.426 00.070 10.028 21 1.014 00.161 713060100.084 50.056 00.035 20.409 70.084 20.045 31 0.911 50.091 414050010.073 10.041 60.052 80.310 50.063 10.035 41 0.883 20.115 514050020.156 20.108 80.095 90.546 00.164 90.056 21 0.957 90.164 914050030.437 30.284 00.200 40.784 70.219 20.089 91 1.143 00.245 314050040.093 30.058 90.058 00.496 00.113 30.060 51 1.088 00.130 214060100.109 20.086 20.051 90.594 80.117 90.031 31 1.321 00.137 714060120.085 30.057 00.044 90.542 70.135 70.023 81 1.417 00.105 715050010.104 40.066 70.044 10.403 80.065 70.019 71 0.831 00.131 115050020.167 10.152 30.142 60.590 30.083 00.035 91 1.184 00.190 315060030.078 10.074 80.041 30.362 60.073 50.024 81 0.698 60.149 415060040.106 40.064 00.057 30.480 60.122 00.036 51 1.160 00.143 516050010.138 80.078 70.093 00.476 20.120 20.113 81 1.097 00.150 016050020.053 60.034 40.043 70.274 30.095 60.037 91 0.597 10.114 116060030.214 30.165 90.184 00.525 00.176 20.090 21 0.731 40.147 216050040.066 70.047 70.035 90.285 40.048 70.023 61 0.499 50.141 916050060.044 70.031 00.014 00.357 30.088 90.068 51 1.023 00.125 2

圖5 Shimadzu儀器19批藥材匹配色譜圖

批號(hào)12345678913050010.078 00.033 90.031 20.292 10.136 70.095 01 0.843 20.138 013050020.105 30.042 10.047 30.376 40.116 80.061 11 0.890 40.171 013050030.100 50.045 80.049 60.347 80.086 10.059 61 0.846 40.160 013060100.095 40.044 10.044 70.360 80.097 80.045 81 0.843 40.091 914050010.095 30.034 20.050 30.252 00.074 50.037 51 0.786 60.116 714050020.157 20.075 50.092 10.405 40.173 40.042 81 0.793 50.161 914050030.339 00.128 60.149 40.466 90.209 30.132 11 0.799 80.085 414050040.139 10.046 60.064 50.411 90.120 70.049 91 0.921 90.130 314060100.097 20.060 00.052 20.445 90.132 60.045 11 1.065 00.114 814060120.095 40.035 90.041 90.390 20.162 00.058 01 1.091 00.095 215050010.093 60.045 70.053 30.302 30.081 50.034 81 0.691 40.128 215050020.156 30.092 50.133 10.394 70.097 10.030 61 0.914 60.169 815060030.086 90.051 50.045 30.273 20.077 30.028 21 0.701 50.135 015060040.106 10.053 30.056 40.368 10.140 00.059 81 0.965 40.137 116050010.134 40.056 80.082 80.316 40.100 20.054 91 0.685 00.164 016050020.079 70.028 00.046 30.235 70.103 60.042 41 0.520 70.112 016060030.307 20.163 20.236 70.533 60.194 60.059 01 0.651 00.115 916050040.070 90.048 80.041 20.228 90.058 80.014 11 0.413 10.144 216050060.056 30.028 20.021 80.335 00.093 30.025 01 0.982 10.128 6

2.10 小結(jié)

Agilent、Waters和Shimadzu三臺(tái)儀器中19批藥材與對(duì)照指紋圖譜的相似度見表6。

表6 各批次藥材與對(duì)照指紋圖譜相似度結(jié)果

可見經(jīng)Agilent、Waters和Shimadzu儀器分析的各批次藥材指紋圖譜中均出現(xiàn)了與腺苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷以及菊苣酸三個(gè)參照色譜峰保留時(shí)間一致的色譜峰，并出現(xiàn)了9個(gè)共有峰，以1(S)、2、3、4、5、6、7(S)、8(S)、9號(hào)峰為標(biāo)記，經(jīng)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件計(jì)算，與對(duì)照指紋圖譜相比較，相似度均大于0.95。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)建立了抱莖苦荬菜的HPLC指紋圖譜，綜合抱莖苦荬菜中與藥效相關(guān)的黃酮類、氨基酸類、有機(jī)酸類及核苷酸類成分的吸收波長(zhǎng)，選擇各類成分均有吸收的波長(zhǎng)，最終確定檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm；并進(jìn)行了儀器精密度、方法重復(fù)性、樣品穩(wěn)定性以及儀器適用性驗(yàn)證，符合指紋圖譜分析方法學(xué)要求。目前對(duì)于中藥材指紋圖譜的研究已經(jīng)非常廣泛，但針對(duì)不同儀器間的差異進(jìn)行考察的還鮮有報(bào)道，但眾所周知不同儀器的檢測(cè)結(jié)果會(huì)有一定差異，故本實(shí)驗(yàn)對(duì)來(lái)自天津薊縣、遼寧海城、河北玉田的19個(gè)批次藥材在Agilent、Waters和Shimadzu三臺(tái)儀器中進(jìn)行指紋圖譜檢測(cè)，均出現(xiàn)了與腺苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷以及菊苣酸三個(gè)參照色譜峰保留時(shí)間一致的色譜峰，并指認(rèn)了9個(gè)共有峰，經(jīng)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件計(jì)算，與對(duì)照指紋圖譜相比較，相似度均大于0.95，說(shuō)明所建立的對(duì)照指紋圖譜可以用于不同儀器的抱莖苦荬菜指紋圖譜分析檢驗(yàn)，為該藥材的質(zhì)量鑒定及真?zhèn)舞b別奠定了基礎(chǔ)，具有很強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)中用到的三個(gè)產(chǎn)地的抱莖苦荬菜都是道地藥材，故雖相似度有所差異但都符合要求，后期可用本實(shí)驗(yàn)建立的指紋圖譜對(duì)其他地區(qū)的抱莖苦荬菜進(jìn)行檢測(cè)，作為其真?zhèn)舞b別的依據(jù)。