IL-20及其受體在大鼠自身免疫性心肌炎不同階段的表達

吳梁安 常賀 郭明 張宗輝 楊杰 王焱

IL-20是 IL-10家族（包括 IL-10、IL-19、IL-22、IL-24、IL-26、IL-28A、IL-28B 和 IL-29）的成員之一，IL-20有兩個受體復合體：一個是IL-20R1/IL-20R2，另一個是IL-22R1/IL-20R2[1]。IL-20是重要的促炎性細胞因子，具有引起炎癥、血管生成、趨化和凋亡的效應，在銀屑病、動脈粥樣硬化、中風、風濕性關節(jié)炎、急慢性腎衰竭的發(fā)病機制中起了重要作用[2-5]。自身免疫性心肌炎（EAM）是由于機體細胞免疫和體液免疫功能異常，產生致敏性T淋巴細胞和多種自身抗體，這些自身抗體與抗原反應形成免疫復合物，通過血液循環(huán)進入心肌纖維，引起心肌細胞水腫、溶解、壞死及單核細胞浸潤等一系列炎癥反應。大鼠EAM類似于人類的巨細胞性心肌炎，已經被證實是T細胞介導的EAM[6]，目前認為Th1和Th2細胞因子的平衡對于控制EAM的疾病過程和修復很重要。然而IL-20及其相關受體在EAM發(fā)病過程中的表達特征尚未見報道，其在EAM發(fā)病機制中所起的作用還有待進一步闡明。本研究采用大鼠EAM模型，通過檢測IL-20及其受體鏈在心肌炎急慢性期各階段的表達，進一步探討IL-20及其受體在心肌炎發(fā)病機制中的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 8周齡Lewis雄性大鼠20只，體重180～220g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[許可證號SCXK（京）2002-003]，飼養(yǎng)于廈門大學醫(yī)學院實驗動物中心。

1.2 主要試劑及儀器 含H37Ra株熱滅活結核桿菌的弗氏佐劑（美國Difco公司）；Trizol（美國Invitrogen公司）；逆轉錄試劑盒RevertAid First Strand cDNA kit（美國 Fermentas公司）；RT-PCR酶 DreamTaq Green PCR master mix（美國 Fermentas公司）；SYBR Premix Ex Taq（大連寶生物工程有限公司）；引物設計合成（表1，大連寶生物工程有限公司）；一次抗體：Goat polyclonal antibody to IL-20（美國 Santa Cruz公司），Rabbit polyclonaly antibody to GAPDH（美國ABcam公司），二次抗體：Penxiclase-Labeled Affinity Purified rabbit antibody to Goat IgG（美國 KPL公司），Peroxidase-conjugated Affinipure Goat anti-Rabbit IgG（美國ABcam公司），RatIL-20ELISA試劑盒（美國R&D公司）。C1000雙模塊梯度PCR儀（美國BIO-RAD公司），7500型實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司），蛋白凝膠電泳系統(tǒng)（美國BIO-RAD公司），iMARK酶標儀（美國BIO-RAD公司）等。

表1 IL-20及其各受體的引物序列

1.3 抗原制備 提取豬心室肌球蛋白溶解于0.3 mol/L KCl溶液中配制成濃度為10mg/ml，加同等體積含結核桿菌H37Ra株的完全弗氏佐劑，充分混合制成抗原。

1.4 動物分組與EAM模型制作 將20只大鼠按數(shù)字表隨機分為4組，即：（1）對照組：即未制作EAM模型組；（2）EAM 3 周組；（3）EAM 6 周組；（4）EAM12 周組，每組5只。3組EAM大鼠雙后足各皮下注射以上制備的抗原0.1ml完成建模，對照組注射等量0.9%氯化鈉注射液。

1.5 組織病理學檢查 3組EAM大鼠建模當天作為0d，觀察至建模后3、6、12周后處死，對照組12周后處死。取出心臟稱重并計算心臟重量/體重比值，取心尖部約5mm厚度心肌，10%甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片，HE法染色，光鏡下觀察。

1.6 實時熒光定量RT-PCR檢測IL-20及其相關因子的mRNA表達 取各組大鼠心臟、肝臟、脾臟、腎臟組織，Trizol法提取各組織RNA，逆轉錄試劑盒合成cDNA（2μg/20μl），采用實時熒光定量 RT-PCR 進行擴增反應，檢測 IL-20及其受體鏈（IL-20R1/R2，IL-22R1）在各臟器組織中的mRNA表達，以及在各階段心肌組織中的mRNA表達。

1.7 Western blotting檢測EAM大鼠心肌組織IL-20的蛋白表達 取各組EAM大鼠心肌組織約100mg剪碎，放入1ml RIPA組織裂解液（含1mmol/L PMSF）中機械勻漿，超聲細胞破碎儀破碎細胞，冰上孵育30min，4℃低溫10 000r/min離心10min取上清液。采用BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測總蛋白質濃度，加入5×蛋白上樣緩沖液，100℃5min裂解蛋白，制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠（12%分離膠和 15%的濃縮膠），每孔加蛋白樣品 20～180μg，電泳（積層膠：電泳70V，20min分離膠：電壓100V，75min），濕法轉膜（90V 恒壓下 30min），5%脫脂奶粉PBS緩沖液室溫封閉1～2h或4℃過夜，一次抗體：Goat polyclonal antibody to IL-20（1∶200），Rabbit polyclonaly antibody to GAPDH（1∶2 000）稀釋,1～2h 或 4℃過夜，TBST洗膜5次，二次抗體：Penxiclase-Labeled rabbit antibody to Goat IgG（1∶10 000），Peroxidase-conjugated Goat anti-Rabbit IgG（1∶5 000），稀釋室溫孵育1h，TBST洗滌5次，加Super Signal發(fā)光試劑,暗室顯影30s～30min不等并沖洗膠片，掃描膠片。

1.8 ELISA檢測各組EAM大鼠心肌組織勻漿IL-20蛋白含量（IL-20蛋白/總蛋白） 取各組EAM大鼠心肌組織約100mg剪碎，放入1mlRIPA組織裂解液（含1mmol/L PMSF）中機械勻漿,超聲細胞破碎儀破碎細胞，冰上孵育30min，4℃低溫 16 000r/min離心15min取上清液。采用BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測總蛋白質濃度。并應用ELISA試劑盒檢測IL-20的蛋白濃度（標準品蛋白標準曲線相關系數(shù)＞0.99）。

1.9 統(tǒng)計學處理 采用Graph pad prism 5.0統(tǒng)計軟件進行分析并作圖，數(shù)值以表示，多組間比較采用一元線性回歸Anova檢驗，兩組間比較采用非配對t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠心臟外觀、心肌組織病理學改變和心臟/體重比值的比較 見圖1。

由圖1可見，EAM大鼠免疫3周時心肌組織可見廣泛多量炎性細胞浸潤和組織壞死，并可見少量的心肌纖維化；6周時炎癥細胞明顯減少，可見大量的心肌纖維；12周時炎癥細胞幾乎消失，心肌纖維化仍十分明顯。與對照組比較，EAM大鼠免疫后心臟重量/體重比值（mg/g）3周時明顯升高（P＜0.01），6周和 12周無明顯差異。

2.2 IL-20在EAM大鼠3、6周時各臟器中的mRNA表達 見圖2。

圖1 各組大鼠心臟外觀（a）、心肌組織病理學改變（b，HE染色，×20）和心臟/體重（c，mg/g）比值的比較（與對照組比較，**P＜0.01）

圖2 IL-20及其受體鏈在EAM 3周和6周時各組織的mRNA表達

由圖2可見，實時熒光定量RT-PCR結果顯示，在EAM急性期（3周時）IL-20與IL-20R2主要在心臟表達，IL-20R1主要在腎臟表達，IL-22R1主要在脾臟表達；在EAM慢性期（6周時）IL-20在心、肝、脾、腎均有明顯表達，IL-20R1主要在腎臟表達，IL-20R2、IL-22R1主要在心臟表達。

2.3 心肌組織中IL-20及其受體鏈（IL-20R1/R2，IL-22R1）在EAM大鼠急慢性期各階段的mRNA表達 見圖3。

由圖3可見，實時熒光定量RT-PCR的結果，IL-20R1/IL-20R2兩條受體鏈在EAM大鼠心肌組織的表達高峰均出現(xiàn)在急性期（3周時）（均P＜0.05），隨后逐漸減少，在慢性期（6、12周時）已基本接近正常水平，而IL-20及另一受體鏈IL-22R1在EAM大鼠心肌組織的表達3周時逐漸升高，6周時達高峰（均P＜0.05），12周時又逐漸下降，但仍處于較高水平。

圖3 IL-20及其受體鏈在EAM大鼠心肌組織各階段的mRNA表達（與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01）

2.4 IL-20在EAM大鼠心肌組織的蛋白水平及含量見圖4。

圖4 IL-20在EAM大鼠心肌組織蛋白勻漿中的含量（a）以及心肌組織的蛋白水平（b）（與對照組比較，*P＜0.05）

由圖4可見，Western blotting結果顯示，心肌組織中IL-20的蛋白表達在EAM3周時表達開始升高，6周時達到峰值，12周時逐漸下降。心肌組織蛋白勻漿中IL-20含量即IL-20蛋白/總蛋白（pg/ng）的結果與Western blotting結果表現(xiàn)為相同的趨勢性。

3 討論

本研究通過檢測IL-20及其受體在大鼠EAM各臟器及心臟組織各階段的表達特征，闡述了IL-20參與EAM的發(fā)病進程并發(fā)揮了重要的作用。我們的結果顯示在EAM大鼠急性期（3周時）IL-20主要在心臟表達，在6周時心、肝、脾、腎均有明顯表達；IL-20心肌組織中的表達在大鼠EAM急性期3周時逐漸升高，并且在EAM 6周時達到高峰，隨病程的進一步進展IL-20在慢性期（12周）的表達水平逐漸降低，提示IL-20可能參與了EAM急性期的炎癥啟動，并在慢性期的炎癥反應或纖維修復過程中扮演重要作用。

另外，IL-20通過IL-20R1/R2、IL-22R1三條單鏈形成的兩個受體復合物（IL-20R1/R2、IL-22R1/IL-20R2）發(fā)揮作用，本研究結果也顯示IL-20R1/R2、IL-22R1在EAM大鼠急性期（3周時）及在慢性期（6周時）的心臟組織均有較高的表達。而IL-20R1/IL-20R2表達的高峰在急性期（3周時），IL-22R1/IL-20R2表達的高峰期出現(xiàn)在慢性期（6周時），筆者進一步推測IL-20在急性期通過受體復合物IL-20R1/IL-20R2介導起生物學效應，而在慢性期通過IL-22R1/IL-20R2起作用，這一結果證明在EAM急慢性期時心臟組織均存在IL-20作用的靶細胞，進一步表明IL-20參與了EAM的發(fā)生及發(fā)展過程，而且可能主要在慢性炎癥或纖維修復過程中扮演重要作用。之前的研究顯示EAM是T細胞介導的EAM，Th1細胞因子啟動了炎癥反應；并且在EAM的心臟組織發(fā)現(xiàn)有各種細胞因子的分泌。IL-20是近年來被發(fā)現(xiàn)和關注的一個新型的多效性的細胞因子，目前關于IL-20免疫炎癥方面的生物學作用還知之甚少。先前的研究報道IL-20可能與一些免疫性疾病有關。在銀屑病患者受損的皮膚與未受損的皮膚及正常皮膚比較IL-20的表達是升高的，而且IL-20R2、IL-20R1和IL-22R1也存在明顯的高表達[7-9]。此外，在HaCaT細胞IL-20通過STAT3刺激信號轉導，上調角質細胞生長因子的轉錄[10]。在銀屑病患者中，IL-20可能在局部促發(fā)CD8＋T細胞和通過產生角質細胞生長因子間接的促進增值反應以維持角質細胞的過度增殖狀態(tài)，也可能通過激活CD8＋T細胞產生TNF-a并引發(fā)新的炎癥級聯(lián)反應。應用規(guī)范的銀屑病藥物治療后IL-20mRNA的表達下降。當銀屑病患者以抗CD2和抗TNF－a抗體的藥物治療后同樣可以發(fā)現(xiàn)IL-20表達的下降。最近的研究發(fā)現(xiàn)不但IL-20，還有它的3個受體鏈都在滑液膜和起源于RA患者和CIA大鼠（一個模擬人RA的模型）的滑液組織的滑液成纖維細胞中表達[11]。RA患者與正常人相比滑液膜IL-20和IL-20的3條受體鏈的基因和蛋白表達都是升高的。巨噬細胞和滑液成纖維細胞產生IL-20，IL-20又通過激活ERK1/2和 JNK 信號分子誘導 TNF-a、IL-1b、MMP-1、MMP-13的表達；并且IL-20還能誘導化學趨化因子如MCP-1和IL-8，隨后再招募中性粒細胞和T-細胞加重炎癥。此外，將抗IL-20單克隆抗體（7E）或可溶性IL-20R1質粒DNA來治療膠原誘導的關節(jié)炎大鼠模型，關節(jié)炎的嚴重程度明顯減輕[5]。有研究顯示在動脈粥樣硬化患者的動脈壁存在高表達的IL-20及其受體[12]。在硬化的動脈內皮細胞中能檢測到IL-20R1和IL-20R2。內皮細胞表達IL-20R1和 IL-20R2[13]，所以可能會成為IL-20的靶細胞。IL-20誘導人的臍靜脈內皮細胞的增殖和遷移，在人臍靜脈內皮細胞IL-20也誘導血管形成因子bFGF和VEGF，及基質金屬蛋白酶2的表達，而VEGF在動脈粥樣硬化的發(fā)展中扮演了重要的作用，并且升高血膽固醇濃度[14]。

總之，IL-20及其受體參與了EAM的發(fā)病與發(fā)展進程，而且在EAM的急慢性期炎癥反應過程中通過不同的受體鏈IL-20R1/IL-20R2和IL-22R1/IL-20R2介導生物學效應。盡管仍有許多關于IL-20的生理作用和確切的分子機制有待解釋，但先前的研究給了我們新的觀點和啟示，在IL-20相關的疾病中通過阻斷IL-20及其受體復合物的活性包括IL-20的抗體，小分子失效劑如阻斷IL-20細胞表面的受體或抑制IL-20細胞內的信號分子，可能會成為藥物新的治療靶向。這也為深入探討EAM或自身免疫性疾病發(fā)病機制提供一個新的實驗依據，關于IL-20在免疫炎癥中的深入研究我們將繼續(xù)探索。