山核桃葉總黃酮干預去勢SD大鼠脂肪組織異位沉積作用研究

浙江中醫(yī)藥大學 杭州 310053

人體脂肪組織主要分布于皮下、內臟及血管周圍，正常情況下起著調節(jié)人體生理代謝、提供干細胞等作用[1]，當脂肪組織異位沉積時會引起多種代謝異常疾病以及各類并發(fā)癥。脂肪組織在腹腔內積累過多時，會引起脂肪肝、糖尿病和心血管疾病[2]。血管周圍脂肪的過量沉積會造成脂肪組織分泌功能的紊亂，使脂肪組織分泌過量的炎癥因子，引發(fā)動脈粥樣硬化和高血壓[3]。

雌激素與脂肪代謝有關，女性絕經后雌激素水平下降，容易造成體內脂肪堆積，引發(fā)肥胖[4]。筆者研究團隊前期對人乳腺癌細胞株MCF-7、MDA-MB-231細胞的研究發(fā)現(xiàn)山核桃葉總黃酮具有雌激素樣活性[5]；還發(fā)現(xiàn)山核桃葉所含黃酮成分白楊素、球松素查爾酮能夠明顯抑制鼠胚胎成纖維細胞的成脂分化[6-7]。本研究擬進一步觀察山核桃葉總黃酮對去勢SD大鼠血脂、脂肪組織分布、過氧化物酶體增殖體激活受體γ （peroxisome proliferator activated receptor γ,PPARγ）水平的影響，探討山核桃葉總黃酮對脂肪組織異位沉積的影響及其可能的機制。

1 材料和方法

1.1 藥物與試劑 水合氯醛購自浙江省中醫(yī)院（批號：20150803）；戊酸雌二醇片購自法國DELPHARM Lille S.A.S藥廠（批號：188A）；山核桃葉總黃酮由浙江中醫(yī)藥大學制備[8-9]?？偰懝檀迹╰otal cholestero，TC）檢測試劑盒、甘油三酯（triglyceride，TG）檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所（批號：20150902、20151231）；BCA蛋白定量試劑盒購自康為世紀生物科技公司（批號：10114）；逆轉錄試劑盒購自寶生物（大連）有限公司（批號：AK2601）；SYBR Premix Ex TaqTM購自寶生物（大連）有限公司（批號：AK4605）；β-actin pAB 內參蛋白一抗、PPARγ(Ser 112)-R Antibody均購自 SANTA 公司（批號：CT36001、K1314）。

1.2 實驗動物 SPF級雌性SD大鼠60只，6周齡，體質量約200g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司[實驗動物生產許可證號：SCXK（滬）2013-0016]，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心[實驗動物使用許可證號：SYXK（浙）2013-0184]。飼養(yǎng)環(huán)境恒溫恒濕，所有大鼠自由飲水，以標準飼料飼養(yǎng)到3月齡，體質量（250±30）g用于實驗。

1.3 儀器 SMP500-17044-CXV型全波長酶標儀為美國Dynatech公司產品，NIS-Element正置顯微鏡為日本Nikon公司產品，HM315切片機為德國Thermo公司產品，S1000型PCR儀購于美國Bio-Rad公司，StepOne Real-Time PCR為美國Applied Biosystems公司產品，化學發(fā)光成像儀購于Clinx Science Instruments公司。

1.4 方法

1.4.1 去勢大鼠模型的建立 60只SD大鼠中50只摘除雙側卵巢。以10%水合氯醛0.3mL/100g腹腔注射麻醉，麻醉成功后，大鼠取俯臥位，沿著脊柱斜向下背部切開，摘除雙側卵巢。其余10只為假手術組，切除卵巢附近與卵巢同等大小的脂肪組織。術后大腿部肌肉注射青霉素預防感染，青霉素80萬單位以0.9%氯化鈉注射液5mL溶解，注射劑量為1mL/只，共注射4次。

1.4.2 動物分組與給藥 術后1個月將大鼠按照隨機區(qū)組法分為6組：模型組、假手術組、雌二醇組、山核桃葉總黃酮低、中、高劑量組，每組10只。模型組和假手術組予0.9%氯化鈉注射液灌胃，雌二醇組予雌二醇1mg/kg灌胃，山核桃葉總黃酮低、中、高劑量組分別予山核桃葉總黃酮50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg灌胃[10-11]。各組大鼠灌胃均為1次/d，灌胃容積0.3～0.4mL/只，連續(xù)給藥2個月。給藥期間每10d眼眶取血1mL監(jiān)測血脂的變化，共取6次。

1.5 檢測指標

1.5.1 一般指標 給藥期間每10d稱量各組大鼠體質量，實驗結束時處死大鼠，稱量各組大鼠的腹部脂肪和主動脈弓脂肪，計算腹部脂肪系數(shù)和主動脈弓脂肪系數(shù)。腹部脂肪系數(shù)=腹部脂肪質量（g）/體質量（g）×100、主動脈弓脂肪系數(shù)=主動脈弓脂肪質量（g）/體質量（g）×100。

1.5.2 血清和肝臟脂代謝指標檢測 末次給藥后，大鼠禁食12h，3%戊巴比妥鈉以0.15mL/100g的劑量腹腔注射麻醉，腹主動脈取血處死。將取得的血液置于2mL離心管中，室溫放置2h或37℃水浴30min后，3 000 轉/min，4℃離心15min，取上層血清，分裝后-80℃保存，酶標比色法測定血清TC、TG水平。取0.1g肝臟組織，加入0.3mL甲醇勻漿和0.6mL氯仿抽提，取下層抽提液，酶標比色法測定肝臟TG、肝臟游離脂肪酸（free fatty acids，F(xiàn)FA）水平。

1.5.3 石蠟切片制作和HE染色 分離大鼠肝臟、腹部脂肪、主動脈弓，以10%甲醛溶液固定后石蠟包埋制備3μm切片，HE染色后鏡下觀察。

做到這一點又難又不難。說難，那是需要高智商和好體力的；說不難，只要準確理解不同的身份要求，并扮演好自己的角色就行了。當然，身份多了，難免會很累。但要在這個世界上出人頭地，就不能怕累。張仲平是一個謀定而后動的人，已經習慣了在做任何事情時都權衡利弊，他覺得，只有這樣，才稱得上一個真正的商人和一個真正成功的男人。

1.5.4 熒光定量PCR檢測PPARγ mRNA表達 分離大鼠腹部脂肪組織，液氮研磨，以Trizol法提取脂肪組織總RNA。引物由上海生工公司合成，內參GAPDH上游引物：5’-GCTAGTTCAACGGCACAG-3’，下游引物：5’-GCCAGTAGACTCCACGACAT-3’；PPARγ 上游引物：5’-CGTCCCCGCCTTATTATTCT-3’，下游引物：5’-GCTTTATCCCCACAGACTCG-3’。逆轉錄反應總體系包括總 RNA 8μL、5×Prime Script Master Mix 2μL，充分混勻后 37℃ 15min，85℃ 5s，4℃ 30min 逆轉錄反應，獲得cDNA。

以 0.5μL cDNA 為模板，2×SYBR Premix Ex TagTM10μL，上下游引物各 0.5μL，ddH2O 8.5μL，總體系20μL進行熒光定量PCR反應。反應條件：94℃5min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，共 30 個循環(huán)；最后72℃延伸3min。每個樣本擴增3個復孔，熒光定量PCR儀檢測記錄數(shù)據(jù)，以2－△△Ct法計算mRNA相對表達量?！鳌鰿t=[實驗組目的基因平均Ct值-實驗組內參基因平均Ct值]-[對照組目的基因平均Ct值-對照組內參基因平均Ct值]。

1.5.5 Western blot檢測PPARγ蛋白表達 RIPA裂解液抽提脂肪組織中總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，SDS-PAGE電泳上樣量40μg/孔，電泳后轉膜，加入一抗、二抗孵育，用ECL發(fā)光，圖片用Image J軟件進行分析。蛋白相對表達量以目的蛋白光密度與βactin光密度比值表示。

1.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，滿足方差齊性用LSD法，方差不齊用 Dunnett's T3法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠脂代謝指標比較 各組大鼠體質量、腹部脂肪系數(shù)、主動脈弓脂肪系數(shù)都無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。假手術組組血清TC水平高于模型組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），雌二醇組低于模型組（P＜0.01），山核桃葉總黃酮低、高劑量組均高于模型組，其中山核桃葉總黃酮高劑量組與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；中劑量組低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。模型組與假手術組血清TG水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與模型組比較，雌二醇組和山核桃葉總黃酮各劑量組血清TG水平呈下降趨勢，其中雌二醇組、山核桃葉總黃酮高劑量組與模型組比較具有統(tǒng)計學差異（P＜0.01）。模型組肝臟TG水平高于假手術組（P＜0.01），雌二醇組和山核桃葉總黃酮各劑量組肝臟TG水平均低于模型組，其中雌二醇組、山核桃葉總黃酮中劑量組和高劑量組與模型組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，P＜0.05）。模型組肝臟FFA水平高于假手術組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；雌二醇組和山核桃葉總黃酮各劑量組肝臟FFA水平有下降趨勢，但無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。這表明山核桃葉總黃酮能夠下調血清TG和肝臟TG水平。見表 1、2。

表1 各組大鼠體質量及脂肪系數(shù)比較（±s）Tab.1 Comparison of body mass and fat coefficient in each group（±s）

表1 各組大鼠體質量及脂肪系數(shù)比較（±s）Tab.1 Comparison of body mass and fat coefficient in each group（±s）

組別 n 體質量（g） 腹部脂肪系數(shù) 主動脈弓脂肪系數(shù)山核桃葉總黃酮低劑量組山核桃葉總黃酮中劑量組山核桃葉總黃酮高劑量組雌二醇組模型組假手術組1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 3 2 9.7 0 8±3 3.7 7 5 3 0 6.7 6 4±2 8.7 1 8 3 2 3.6 6 0±3 3.3 4 8 3 2 4.5 0 4±3 1.6 2 9 3 1 0.8 5 0±2 7.9 8 0 3 2 0.3 7 9±2 7.2 8 6 1.7 7 4±0.4 2 5 1.3 1 5±0.7 0 6 1.7 4 6±0.8 9 4 1.0 3 4±0.3 8 4 1.5 3 9±0.8 5 7 1.2 0 6±0.2 0 0 0.1 3 2±0.0 3 3 0.0 8 8±0.0 2 5 0.1 2 5±0.0 7 5 0.1 3 7±0.0 3 3 0.1 1 7±0.0 5 7 0.1 2 7±0.0 4 5

2.2 各組大鼠肝臟、腹部脂肪、主動脈弓脂肪病理形態(tài)比較 假手術組肝臟、腹部脂肪、主動脈弓處脂肪細胞數(shù)量較少，且體積較小，主動脈弓內膜較光滑。模型組肝索清晰，可見輕微炎性細胞浸潤，肝細胞內可見脂肪滴積聚；腹部脂肪細胞較多，大小不一且聚集；主動脈弓處有較多脂肪細胞聚集，內膜增厚，管腔狹窄，內有泡沫細胞沉積。雌二醇組與假手術組相似。山核桃葉總黃酮低劑量組肝組織切片可見肝索清晰，伴有輕微的炎性細胞浸潤，但脂肪滴的數(shù)量較模型組減少。雌二醇組、山核桃葉總黃酮高劑量組肝細胞內脂肪滴數(shù)量明顯減少，炎性細胞浸潤改善；腹部脂肪細胞體積出現(xiàn)不同程度減?。恢鲃用}弓處脂肪明顯減少，內膜光滑，管腔狹窄減輕，改善程度隨山核桃葉總黃酮劑量升高而更明顯。見圖1～3。

表2 各組大鼠血清及肝臟脂代謝指標比較（±s）Tab.2 Comparison of index of lipid metabolism in blood and hepatic in each group（±s）

表2 各組大鼠血清及肝臟脂代謝指標比較（±s）Tab.2 Comparison of index of lipid metabolism in blood and hepatic in each group（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與假手術組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。Note:Compared with model group,*P＜0.05,**P＜0.01;compared with sham operation group,#P＜0.05,##P＜0.01.

組別 n 血清TC（mmol·L-1） 血清TG（mmol·L-1） 肝臟TG（mmol·gprot-1） 肝臟FFA（μmol·gprot-1）山核桃葉總黃酮低劑量組山核桃葉總黃酮中劑量組山核桃葉總黃酮高劑量組雌二醇組模型組假手術組54.717±4.114 52.111±3.097 49.864±6.179 50.143±6.202 55.010±2.494 47.116±4.342 10 10 10 10 10 10 2.314±0.297 1.829±0.335**##2.343±0.382**##1.386±0.657**2.100±0.306 2.150±0.288 0.499±0.041 0.489±0.043 0.406±0.029**##0.407±0.046**##0.535±0.061 0.523±0.081 2.616±0.239 2.707±0.926*#2.696±0.291*#2.115±0.252**3.222±0.130 2.003±0.465**

圖1 各組大鼠肝臟組織病理形態(tài)比較（HE染色，200×）Fig.1 Comparison of pathological features of liver tissue in each group(HE staining,200×)

圖2 各組大鼠腹部脂肪組織病理形態(tài)比較（HE染色，200×）Fig.2 Comparison of histopathological features of abdominal adipose tissue in each group(HE staining,200×)

圖3 各組大鼠主動脈弓病理形態(tài)比較（HE染色，200×）Fig.3 Comparison of pathological features of aortic arch in each group(HE staining,200×)

2.3 各組大鼠脂肪組織中PPARγ蛋白表達比較與假手術組比較，模型組PPARγ蛋白表達顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，雌二醇組PPARγ蛋白表達降低（P＜0.01），山核桃葉總黃酮中、高劑量組PPARγ蛋白表達也降低且具有統(tǒng)計學差異（P＜0.01）。見圖4、表 3。

圖4 各組大鼠脂肪組織中PPARγ蛋白Western blot檢測結果Fig.4 Western blot results of PPARγ protein in adipose tissue in each group

表3 各組大鼠脂肪組織中PPARγ蛋白表達量比較（±s）Tab.3 Comparison of PPARγ protein in adipose tissue in each group（±s）

表3 各組大鼠脂肪組織中PPARγ蛋白表達量比較（±s）Tab.3 Comparison of PPARγ protein in adipose tissue in each group（±s）

注：與模型組比較，**P＜0.01；與假手術組比較，##P＜0.01。Note:Compared with model group,**P＜0.01;compared with sham operation group,##P＜0.01.

組別 n PPARγ蛋白表達量山核桃葉總黃酮低劑量組山核桃葉總黃酮中劑量組山核桃葉總黃酮高劑量組雌二醇組模型組假手術組10 10 10 10 10 10 5.038±0.130##2.295±0.067**2.347±0.316**3.133±0.209**##4.836±0.121 2.330±0.267**

2.4 各組大鼠脂肪組織中PPARγ mRNA表達比較模型組與假手術組比較，脂肪組織中PPARγ mRNA表達無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。與模型組比較，雌二醇組PPARγ mRNA表達量降低（P＜0.05），山核桃葉總黃酮低、中、高劑量組PPARγ mRNA表達呈下降趨勢，山核桃葉總黃酮中劑量組與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表4。

表4 各組大鼠脂肪組織中PPARγ mRNA表達量比較（±s）Tab.4 Expression of PPARγ mRNA in adipose tissue in each group（±s）

表4 各組大鼠脂肪組織中PPARγ mRNA表達量比較（±s）Tab.4 Expression of PPARγ mRNA in adipose tissue in each group（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05；與假手術組比較，#P＜0.05。Note:Compared with model group,*P＜0.05;compared with sham operation group,#P＜0.05.

組別n PPARγ mRNA表達量山核桃葉總黃酮低劑量組山核桃葉總黃酮中劑量組山核桃葉總黃酮高劑量組雌二醇組模型組假手術組10 10 10 10 10 10 0.669±0.148 0.317±0.136*#0.556±0.254 0.272±0.101*#0.931±0.328 1.000±0.000

3 討論

絕經期婦女容易發(fā)生向心性肥胖，導致心血管疾病高發(fā)[12]。脂肪異位沉積是指脂質在非脂肪組織中的

積聚，主要表現(xiàn)為TG在肝臟、肌肉等組織中的沉積，是肥胖、糖尿病、非酒精性脂肪肝、多種心血管疾病等的發(fā)病原因之一[13]。體內幾乎所有血管周圍都被脂肪組織包繞，通常將其稱為血管周圍脂肪組織(perivascular adipose tissue，PVAT)。PVAT 與血糖、血脂都具有相關性[14]，其含量的增高將可能成為新的代謝性心血管病危險因素[4]。

Xu等[15]研究發(fā)現(xiàn)，補充雌激素可抑制去勢大鼠腹內脂肪和主動脈周圍脂肪積聚以及缺氧的影響，從而可以緩解去勢大鼠代謝性心血管危險因素的惡化；同時還能改善去勢大鼠肝臟組織的異位脂肪沉積。盡管補充外源性雌激素的方法治療絕經期綜合征及其相關疾病已得到公認，但是外源性雌激素會刺激乳腺和子宮內膜增生，增大惡性腫瘤的發(fā)生概率[16]。美國國立衛(wèi)生院于2000年已將人工合成的雌激素列入致癌物質的黑名單。因此尋找具有雌激素效應但副作用小的藥物已經成為治療絕經期綜合征的重要研究方向。研究發(fā)現(xiàn)，植物類雌激素在體內能與雌激素受體結合，具有雌激素樣調節(jié)作用，如大豆異黃酮已廣泛應用于絕經期綜合征的治療[17]。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠主動脈弓脂肪系數(shù)和腹部脂肪系數(shù)與假手術組比較均無統(tǒng)計學差異，但腹部脂肪組織切片顯示，模型組大鼠腹部脂肪細胞體積大于假手術組，而山核桃葉總黃酮能夠減少脂肪細胞數(shù)量，同時縮小脂肪細胞體積，這對改善脂肪組織功能紊亂有重要的意義[18]。模型組大鼠血清TC水平無顯著變化，而肝臟組織的TG水平顯著升高，經過山核桃葉總黃酮干預后，肝組織FFA和TG升高得到抑制；肝組織切片顯示，山核桃葉總黃酮干預后，大鼠肝細胞內脂滴數(shù)量逐漸減少，表明山核桃葉總黃酮能夠通過降低肝臟組織中FFA的水平從而減少TG的產生，具有植物類雌激素功效。

脂肪細胞分化和功能異常是導致脂肪過度堆積的原因之一，脂肪細胞分化能力將直接影響脂肪細胞數(shù)量。許多轉錄因子、信號通路均作用于脂肪細胞分化過程[19]，如PPARγ、CCAAT增強子結合蛋白家族（CCAAT/enhance binding proteins，C/EBPs） 等對前體脂肪細胞向成熟脂肪細胞分化起決定性的作用[20-21]。本研究顯示山核桃葉總黃酮能夠明顯降低PPARγ的表達，抑制脂肪細胞的分化，從而減少體內脂肪組織的聚集。

綜上所述，本研究結果表明山核桃葉總黃酮可以改善去勢大鼠脂肪異位沉積，其機制與降低肝臟TG和FFA，降低脂肪組織PPARγ的表達，抑制脂肪細胞分化有關。脂肪的沉積是一個復雜綜合的過程，脂質的攝入、生成、氧化、再酯化和輸出的任一步失衡都會影響脂肪的沉積[22]，山核桃葉總黃酮對于脂質的合成和氧化的調控是否有直接的作用，本課題組繼續(xù)開展進一步的深入研究。