分散液-液微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定中毒樣品中有毒生物堿和鼠藥

麥沛明 余勝兵 吳西梅 蘇廣寧 鐘秀華 朱炳輝

1(中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東510080)

2(廣東省疾病預(yù)防控制中心，廣東511430)

1 引言

生物堿和鼠藥均可引起急性中毒，危及人體安全。我國(guó)民間常使用中草藥浸泡藥酒，甚至以此“進(jìn)補(bǔ)”，容易因誤食、過量使用而引發(fā)急性中毒;不法分子利用含有毒生物堿的中草藥用于謀殺而引起的中毒事故屢有發(fā)生［1～3］。另外，由于鼠藥導(dǎo)致的食物中毒事件頻繁發(fā)生。部分鼠藥和生物堿中毒的臨床癥狀相似，如毒鼠強(qiáng)與東莨菪堿中毒初期癥狀均有視力模糊、心跳紊亂等癥狀。當(dāng)疑似有毒生物堿或鼠藥中毒事件發(fā)生時(shí)，醫(yī)生僅根據(jù)患者的臨床表現(xiàn)進(jìn)行診斷，可能存在誤診的風(fēng)險(xiǎn)。實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)?zāi)茉诙虝r(shí)間內(nèi)檢測(cè)出致毒物質(zhì)，讓中毒患者得到及時(shí)的對(duì)癥搶救，還可為公安機(jī)關(guān)偵破案件提供技術(shù)支持。因此，建立快速、準(zhǔn)確的生物堿和鼠藥同時(shí)篩查的方法具有較好的實(shí)用意義［4～7］。

目前，對(duì)有毒生物堿和鼠藥的研究多針對(duì)單一生物堿或鼠藥。有毒生物堿和鼠藥的常用分析方法包括薄層色譜法(TLC)［8］、液相色譜法(LC)［9］、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)［10］、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS/LC-MS/MS)［4，11，12］、毛細(xì)管電泳-電噴霧飛行時(shí)間質(zhì)譜(CE-ESI-TOF-MS)［13］等。TLC 和LC無(wú)法對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)定性，而LC-MS/LC-MS/MS 和CE-ESI-TOF-MS 價(jià)格昂貴，較難在一般實(shí)驗(yàn)室普及。GC-MS 具有價(jià)格適中、分析速度快、可對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行準(zhǔn)確定性的優(yōu)點(diǎn)，在一般實(shí)驗(yàn)室中普及率較高。尚未見對(duì)上述5 種生物堿和3 種鼠藥采用GC-MS 同時(shí)檢測(cè)的報(bào)道。另外，中毒樣品的前處理多采用液-液萃?。?4，15］、固相萃?。?6］等方法，這些前處理方法需求樣品量較大、操作繁瑣，耗時(shí)，消耗試劑較多，不能很好地適應(yīng)中毒應(yīng)急檢測(cè)的需要。分散液-液微萃取技術(shù)(DLLME)是由Rezaee 等［17］于2006 年提出的一種環(huán)保、高效、簡(jiǎn)便、成本低、富集倍數(shù)高的樣品富集技術(shù)。目前，DLLME 已被廣泛應(yīng)用于不同基質(zhì)樣品痕量分析［18～22］。本研究對(duì)DLLME 過程中的各種影響條件進(jìn)行優(yōu)化，采用GC-MS 檢測(cè)方法，成功將其應(yīng)用于水、尿液、黃酒及米飯等模擬毒樣品中鼠藥和生物堿的同時(shí)測(cè)定。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Trace GC Ultra-ISQ 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Thermo Fisher 公司);HS20500D 離心機(jī)(中國(guó)恒奧公司);漩渦振蕩器(美國(guó)SI 公司);Milli Q Biocel A10 超純水系統(tǒng)(法國(guó)Millipore 公司);生物堿及鼠藥標(biāo)準(zhǔn):莨菪堿、東莨菪堿(98.87%，TRC 公司);馬錢子堿(98.87%)、士的寧(99.5%)，Chem Service公司);鉤吻素甲(98.87%)、毒鼠強(qiáng)(99.5%)、溴鼠靈(98.87%)、溴敵隆(99.5%)均由北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司提供;甲醇、乙腈、丙酮、四氫呋喃、氯仿、四氯化碳、氯苯、二硫化碳(分析純，廣州化學(xué)試劑廠);混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中各目標(biāo)物濃度見表1。

空白水樣為自來(lái)水;空白尿樣由志愿者提供;空白酒樣為客家黃老酒(廣東省河源市紫金縣紫金實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司);空白飯樣為熟米飯。

2.2 疑似中毒模擬樣品制備與處理

2.2.1 樣品制備 分別取空白水樣、尿樣、酒樣1 mL，米飯樣1 g 于15 mL 離心管中，加入適量目標(biāo)物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，振蕩搖勻，得到模擬中毒樣品。

2.2.2 樣品處理 經(jīng)2.2.1 節(jié)處理后的樣品，加入10 mL 5%(w/V)NaCl 溶液，經(jīng)NaOH 溶液調(diào)節(jié)至pH 8。米飯樣品先經(jīng)離心，取上層清液5 mL 再進(jìn)行后續(xù)步驟。將100 μL 氯仿和600 μL 甲醇的混合液快速注入樣品中，獲得渾濁、霧化乳濁液。10 s 后8000 r/min 離心5min，取下層有機(jī)相進(jìn)行測(cè)定。

2.3 色譜與質(zhì)譜條件

色譜條件:色譜柱:DB-5MS UI 毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，進(jìn)樣口溫度:280 ℃;柱溫升溫程序:初始溫度80 ℃，保持1 min，以20 ℃/min 升溫到280 ℃，保持23 min，再以40 ℃/min 升溫到300 ℃，保留1 min;質(zhì)譜條件:離子源溫度:280 ℃;傳輸線溫度:280 ℃;EI 電壓:70 eV;選擇離子模式測(cè)定，各種待測(cè)物選擇離子見表1。

表1 目標(biāo)物的保留時(shí)間、定性離子和定量離子及混標(biāo)中的濃度Table 1 Retention time，qualitative ion，quantitative ion，concentrations of target analytes in standard stock solution

3 結(jié)果與討論

3.1 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

3.1.1 萃取劑種類與體積的選擇 傳統(tǒng)的分散液-液微萃取常采用密度高于水且在水中溶解度小、對(duì)目標(biāo)成分具有良好萃取能力、色譜出峰不影響目標(biāo)物的有機(jī)溶劑作為萃取劑。本實(shí)驗(yàn)分別考察了氯苯、二硫化碳、氯仿和四氯化碳4 種有機(jī)溶劑作為萃取劑時(shí)目標(biāo)物的回收率。圖1A 表明，氯仿對(duì)8 種目標(biāo)物均具有較好的萃取效率。因此，選氯仿作為萃取劑。考察氯仿體積在40 ～120 μL 時(shí)各目標(biāo)物的回收率，如圖1B 所示，大多數(shù)目標(biāo)物在100 μL 時(shí)達(dá)到最佳萃取效果，因此，選擇氯仿的優(yōu)化體積為100 μL。

3.1.2 分散劑種類與體積的選擇 分散液-液微萃取要求分散劑與萃取劑和水均可混溶，兩者混合加入，使萃取劑以微小液滴高度分散于水相中，增大兩相接觸的比表面積，有效縮短萃取時(shí)間，同時(shí)提高萃取效率。本實(shí)驗(yàn)分別考察了丙酮、乙腈、甲醇、四氫呋喃作為分散劑時(shí)目標(biāo)物的回收率。結(jié)果表明，甲醇對(duì)大多數(shù)目標(biāo)物有較好萃取效率，選取甲醇作為分散劑并考察其在400 ～1500 μL 范圍內(nèi)對(duì)回收率的影響，發(fā)現(xiàn)甲醇的體積為600 μL 時(shí)目標(biāo)物回收率較高。因此，選擇甲醇的優(yōu)化體積為600 μL。

圖1 萃取劑種類(A)及其體積(B)對(duì)目標(biāo)物萃取效率的影響Fig.1 Effect of (A)extraction solvent and (B)extractant volume on the extraction efficiency of analytes Conditions:sample volume，5 mL;extraction volume，100 μL;dispersive agent type，methanol;dispersive agent volume，600 μL;pH，8;salt concentration，5%(w/V).1.Tetramine;2.Bromadiolone;3.Hyoscyamine;4.Scopolamine;5.Gelsemine;6.Brodifacoum;7.Strychnine;8.Brucine.

3.1.3 pH 值及鹽濃度的影響 考察了pH 2 ～14 范圍內(nèi)目標(biāo)物的回收率。結(jié)果表明，大多數(shù)目標(biāo)物在pH=8 時(shí)有較高回收率。一般情況下，水相離子強(qiáng)度增加會(huì)降低目標(biāo)物在水中的溶解度，從而提高萃取效率。實(shí)驗(yàn)考察了NaCl 濃度在0 ～15%(w/V)范圍內(nèi)對(duì)目標(biāo)物回收率的影響，結(jié)果表明不同濃度NaCl 對(duì)生物堿的萃取效率影響較大，對(duì)鼠藥的萃取效率影響不明顯。這可能是由于鼠藥在氯仿中溶解度較大，在萃取過程中鼠藥受水相鹽濃度的影響較小。因此，選擇pH =8，NaCl 濃度為5%(w/V)的條件對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行萃取。

3.2 方法學(xué)考察

3.2.1 方法的線性關(guān)系與檢出限、定量限 取空白液態(tài)樣品1 mL，米飯樣品1 g，將儲(chǔ)備液(濃度見表1)用甲醇稀釋1，2，5，10，20 倍后加入樣品中，每一濃度5 份，再按2.2 節(jié)對(duì)樣品進(jìn)行提取，在優(yōu)化的色譜-質(zhì)譜條件下，對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行分析。考察了方法的線性范圍、檢出限(LOD，S/N =3)和定量限(LOQ，S/N=10)，結(jié)果見表2。表明本方法靈敏度遠(yuǎn)低于各目標(biāo)物的中毒劑量，可用于疑似鼠藥或生物堿中毒癥狀的快速篩查。

表2 DLLME-GC-MS測(cè)定模擬中毒樣品中目標(biāo)物的線性關(guān)系、檢出限、定量限Table 2 Linear relationships，LOD and LOQ for analytes in simulated toxic samples determined by dispersive liquid-liquid microextraction-GC-MS (DLLME-GC-MS)

3.2.2 方法的回收率與精密度 取空白樣品，準(zhǔn)確加入適量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照2.2 節(jié)進(jìn)行提取，在相同的色譜-質(zhì)譜條件下平行測(cè)定3 次，計(jì)算回收率和精密度(表3)。結(jié)果表明，目標(biāo)化合物在不同基質(zhì)中加標(biāo)回收率為81.0% ～110%。圖2 為標(biāo)準(zhǔn)溶液、尿液、黃酒、米飯加標(biāo)后的典型色譜圖。研究結(jié)果表明，本方法可快速測(cè)定食物中毒樣品中3 種鼠藥(毒鼠強(qiáng)、溴鼠靈、溴敵隆)和5 種有毒生物堿(莨菪堿、東莨菪堿堿、鉤吻堿、士的寧、馬錢子堿)。與傳統(tǒng)萃取方法相比，DLLME 具有所需樣品量少，萃取時(shí)間短，操作簡(jiǎn)單、快速的特點(diǎn)，適用于中毒事件和法醫(yī)毒物分析中鼠藥和生物堿中毒的快速分析。

圖2 目標(biāo)物的色譜圖Fig.2 Chromatograms of standard solution of target analytes

表3 模擬中毒樣品中目標(biāo)物的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)Table 3 Result of recovery test for the target analytes in simulated toxic samples (n=3)

1 CAI Xue-Ying，MENG Bo，YANG Bing.Beijing J.Tradit.Chin.Med.，2006，25(3):171 －172

蔡雪映，孟礴，楊冰.北京中醫(yī)，2006，25(3):171 －172

2 Li J，Jiang Y.Biomed.Chromatogr.，2010，24(2):186

3 Yu Z H，Wu Z P，Gong F J，Wong R，Liang C，Zhang Y R，Yu Y Q.J.Sep.Sci.，2012，35(20):2773 －2780

4 Fourel I，Hugnet C，Goy-Thollot I，Berny P.J.Anal.Toxicol.，2010，34(2):95 －102

5 ZHANG Chun-Hua，WU Hui-Qin，HUANG Xiao-Lan，ZHU Zhi-Xin，HUANG Fang，LIN Xiao-Shan，LUO Hui-Tai.Chinese J.Anal.Chem.，2012，40(6):862 －869

張春華，吳惠勤，黃曉蘭，朱志鑫，黃芳，林曉珊，羅輝泰.分析化學(xué)，2012，40(6):862 －869

6 WU Hui-Qin，ZHANG Chun-Hua，HUANG Xiao-Lan，ZHU Zhi-Xin，HUANG Fang，LIN Xiao-Shan，LUO Hui-Tai.Journal of Instrumental Analysis，2013，32(9):1031 －1037

吳惠勤，張春華，黃曉蘭，朱志鑫，黃芳，林曉珊，羅輝泰.分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2013，32(9):1031 －1037

7 YAN Hui，SHEN Min.Fudan Univ.J.Med.Sci.，2011，38(4):361 －366

嚴(yán)慧，沈敏.復(fù)旦大學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2011，38(4):361 －366

8 Dhalwal K，Shinde V M，Namdeo A G，Mahadlik K R，Kadam S S.J.Chromatogr.Sci.，2007，45:706 －709

9 WANG Xue Hu，YUAN Min，ZHANG Qian-Shang，ZHAO Wu-Sheng，GU Yue-Bao.Physical Testing and Chemical Analysis(Part B:Chemical Analysis)，2011，47(4):427 －432

王學(xué)虎，袁敏，張前上，趙武生，顧月保.理化檢驗(yàn)(化學(xué)分冊(cè))，2011，47(4):427 －432

10 ZHANG Rui，LEI Ning-Sheng，LIN Ying，SHU Xiao-Chuan.Guangxi J.Med.，2012，19(3):239 －243

張瑞，雷寧生，林瑩，蘇小川.廣西醫(yī)學(xué)，2012，19(3):239 －243

11 Wu X M，Huang W X，Lu L，Lin L，Yang X F.Anal.Bioanal.Chem.，2010，398(3):1319 －1327

12 John H，Eyer F，Zilker T，Thiermann H.Anal.Chim.Acta，2010，680(1 ～2):32 －40

13 Sasajima Y，Lim L W，Takeuchi T，Suenami K，Sato K，Takekoshi Y.J.Chromatogr.A，2010，1217(48):7598 －7604

14 Zhang C H，Wu H Q，Huang X L，Zhu Z X，Huang F，Lin X S，Luo H T.Chinese J.Anal.Chem.，2012，40(6):862 －869

15 FAN Jie-Ping，QIN Yu.J.Nanchang U.Eng.Techno.，2014，36(1):1 －6

范杰平，秦玉.南昌大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，36(1):1 －6

16 LIU Jie，HE Bi-Ying，SUN Jun-Hong.Chinese J.Health Lab.Tech.，2005，15(9):1025 －1028

柳潔，何碧英，孫俊紅.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2005，15(9):1025 －1028

17 Rezaee M，Assadi Y，MilaniHosseini M R，Ahmadi F，Berijani.S.J.Chromatogr A，2006，1116(1-2):1 －9

18 Andrascikova M，Hrouzkova S，Cunha S C.Food Addit.Contam.A，2013，30(2):286 －297

19 Sereshti H，Samadi S，Jalali-Heravi M.J.Chromatogr.A，2013，1280:1 －8

20 Zacharis C K，Rotsias I，Zachariadis P G，Zotos A.Food Chem.，2012，134(3):1665 －1672

21 Han Y，Jia X，Duan T，Chen H.Anal.Methods，2011，3(4):842 －848

22 Fontana A R，de Toro M M，Altamirano J C.J.Agric.Food Chem.，2011，59(8):3559 －3565