不同來(lái)源異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶(IDI)和脫氧木酮糖磷酸合成酶(DXS)對(duì)重組大腸桿菌番茄紅素產(chǎn)量的影響

楊 帆,蘇卜利,姚 青,李華平,朱紅惠,*

(1.廣東省微生物研究所,廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室,省部共建華南應(yīng)用微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州 510070;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,廣東廣州 510642；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東廣州 510642)

番茄紅素是一類含有40個(gè)碳原子的類胡蘿卜素,不僅具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,而且具有保健功效,尤其是具有較高的抗氧化能力,能防治血管硬化、抗衰老及抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng),在食品加工、醫(yī)藥保健、化妝品等行業(yè)用途十分廣泛[1]。目前,番茄紅素的生產(chǎn)方法主要包括以下幾種:a.天然產(chǎn)物提取獲得[2],例如從胡蘿卜、番茄等富含色素的植物中提取;b.利用化學(xué)法對(duì)番茄紅素進(jìn)行全合成[3];c.采用三孢布拉氏霉菌、杜氏鹽藻、紅法夫酵母等天然具有番茄紅素合成能力的微生物進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)[4]。但這三種方法都有相應(yīng)的不足之處,如天然提取成本較高,化學(xué)合成會(huì)產(chǎn)生副產(chǎn)物,天然菌株產(chǎn)量較低,故應(yīng)用基因工程將外源基因?qū)肽Ｊ骄?利用模式菌株繁殖快、產(chǎn)量高、遺傳改造方便等特點(diǎn)制造番茄紅素是番茄紅素生產(chǎn)的主要發(fā)展方向[5]。和其他萜類化合物一樣,番茄紅素是以異戊烯焦磷酸(IPP)作為前體進(jìn)行合成[6]。在自然界,有兩種途徑合成:MVA途徑和MEP途徑[7-9]。

異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶(isopentenyl diphosphate isomerase,IDI)和脫氧木酮糖磷酸合成酶(1-deoxyxylulose-5-phosphate synthase,DXS)是合成番茄紅素等萜類化合物的關(guān)鍵催化酶,也是代謝工程對(duì)萜類化合物合成途徑改造的最重要的靶點(diǎn)之一[10]。IDI編碼大腸桿菌代謝途徑中的IPP異構(gòu)化酶,能夠促進(jìn)1PP向DMAPP的轉(zhuǎn)化[11],通過(guò)在大腸桿菌中過(guò)表達(dá)idi基因，能夠有效提高番茄紅素產(chǎn)量。IDI在基因序列及反應(yīng)機(jī)制上可以分為兩類,但兩類IDI在代謝改造中促進(jìn)番茄紅素合成的作用仍不清楚。DXS編碼脫氧木酮糖磷酸合成酶,主要催化丙酮酸和三磷酸甘油醛之間的反應(yīng)[12]。IDI、DXS在萜類化合物代謝途徑中發(fā)揮著重要的作用,不同來(lái)源IDI、DXS對(duì)工程菌株產(chǎn)番茄紅素的作用也各不相同。目前工程菌株中強(qiáng)化IDI、DXS的策略往往局限在大腸桿菌來(lái)源等自身不能生產(chǎn)番茄紅素的少數(shù)候選基因,而許多產(chǎn)番茄紅素菌株的IDI、DXS并沒(méi)有得到表征。

本課題組有一株能在極端環(huán)境下生存的戈壁奇球菌(Deinococcusgobiensis),該菌株菌落為紅色,基因組中含有合成番茄紅素的CrtE、CrtB和CrtI基因,通過(guò)生物信息學(xué)分析調(diào)取相關(guān)基因,經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化構(gòu)建了合成番茄紅素的重組大腸桿菌。通過(guò)對(duì)不同來(lái)源IDI、DXS進(jìn)行異源過(guò)表達(dá),探索其對(duì)工程菌株合成番茄紅素能力的影響。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

表1 本研究使用的菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

Nexus GSX1 PCR儀 德國(guó)Eppendorf公司;5452型離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司;1645050型電泳儀 北京六一生物科技有限公司;ChemiDoc MP凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)BIO-RAD公司;1200型高效液相色譜(HPLC) 美國(guó)安捷倫科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 目的基因的克隆 根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏好性,將戈壁奇球菌基因組中含有合成番茄紅素的CrtE、CrtB和CrtI基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，并添加合適的RBS位點(diǎn),全基因合成CrtEBI基因。

以實(shí)驗(yàn)室保存的基因組或空載體為模版,按表2中相應(yīng)的配對(duì)引物,分別擴(kuò)增得到載體pTrc99a、pACYCDuet-1片段,以及ECIDI、BSIDI、MXIDI、IOIDI和ECDXS、BSDXS、MXDXS、IODXS目的片段。其中,pTrc99a、pACYCDuet-1、E.C、B.S等基因的PCR擴(kuò)增條件為:95 ℃預(yù)變性5 min;98 ℃變性10 s;55 ℃退火15 s;72 ℃延伸30 s;共進(jìn)行30個(gè)PCR循環(huán);最后在72 ℃繼續(xù)延伸10 min;M.X、I.O基因使用擴(kuò)增高GC基因的PrimeSTAR? HS DNA Polymerase with GC Buffer進(jìn)行擴(kuò)增,PCR條件分別將退火溫度改為60、68 ℃。

表2 本研究使用的引物Table 2 Primers used in this study

1.2.2 表達(dá)載體構(gòu)建 將獲得的目的基因與載體片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,回收條帶。使用CPEC[13]的方法將CrtEBI基因與pTrc99a進(jìn)行連接,并分別將不同IDI、DXS與pACYCDuet-1載體進(jìn)行連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒。連接體系為:目的基因與載體各2.5 μL、Primer Star Max DNA polymerase 5 μL。連接條件為:98 ℃預(yù)變性3 min;98 ℃變性10 s;55 ℃退火30 s;72 ℃延伸1 min后轉(zhuǎn)化E.coliDH5α。含pTrc99a載體的重組質(zhì)粒在含34 mg/L氯霉素抗性的平板上進(jìn)行篩選,含pACYCDuet-1載體的重組質(zhì)粒在含100 mg/L氨芐青霉素抗性的平板上進(jìn)行篩選。在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約12 h后，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證,驗(yàn)證引物為pTrc99a、pACYCDuet-1測(cè)序引物。將驗(yàn)證正確的菌體在37 ℃搖床中培養(yǎng)約12 h后,使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒,送上海美吉公司進(jìn)行測(cè)序,經(jīng)測(cè)序正確的重組質(zhì)粒分別命名為pTrc99aEBI、pACECIDI、pACBSIDI、pACMXIDI、pACIOIDI;pACECDXS、pACBSDXS、pACMXDXS、pACIODXS。

1.2.3 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá) 分別將質(zhì)粒pACECIDI、pACBSIDI、pACMXIDI、pACIOIDI、pACECDXS、pACBSDXS、pACMXDXS、pACIODXS與含有番茄紅素合成基因的pTrc99aEBI質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)中,同時(shí)以空pACYC質(zhì)粒作為對(duì)照。在含有氨芐青霉素和氯霉素的LB平板上進(jìn)行篩選,得到相應(yīng)的重組菌株。

挑取單克隆至5 mL含有氨芐青霉素和氯霉素的LB液體培養(yǎng)基,在37 ℃搖床中培養(yǎng),待菌體長(zhǎng)至OD600值大約1后,轉(zhuǎn)接至50 mL含有100 mg/L氨芐青霉素和34 mg/L氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中。待菌體OD600值達(dá)到0.6～0.8時(shí),用一定濃度的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo),同時(shí)以未誘導(dǎo)的培養(yǎng)基作為對(duì)照,約20 h后檢測(cè)番茄紅素含量。

1.2.4 IDI與DXS的協(xié)同表達(dá) 根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏好性,將粘細(xì)菌中的IDI及DXS進(jìn)行優(yōu)化,并通過(guò)全基因合成得到idi-dxs基因。通過(guò)CPEC方法將idi-dxs基因與載體片段pACYC進(jìn)行連接,獲得質(zhì)粒pACMYIDI-DXS。將質(zhì)粒pACMYIDI-DXS與含有番茄紅素合成基因的pTrc99aEBI質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中,得到相應(yīng)的重組菌株。

1.2.5 番茄紅素的提取與測(cè)定 番茄紅素的提取與測(cè)定參照Sun等[14]方法。具體操作:取3 mL在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至一定時(shí)期的菌液,5000 r/min離心3 min棄上清液;用無(wú)菌水清洗兩次,加3 mL丙酮,于55 ℃水浴鍋中萃取15 min,5000 r/min離心5 min，取上清即為番茄紅素萃取液,保留上清液以備檢測(cè)。另外取9 mL培養(yǎng)液于8000 r/min 離心5 min后棄上清液,沉淀于70 ℃中烘干,然后計(jì)算菌體干重。

考察學(xué)習(xí)中，考察團(tuán)一行先后來(lái)到長(zhǎng)治市武鄉(xiāng)八路軍紀(jì)念館和平順縣，進(jìn)行重溫入黨誓詞，并聽(tīng)全國(guó)勞動(dòng)模范申紀(jì)蘭老人上黨課，接受愛(ài)國(guó)主義教育。同時(shí)結(jié)合此行考察重點(diǎn)，考察團(tuán)還對(duì)長(zhǎng)治市幾個(gè)鄉(xiāng)、縣的種植、養(yǎng)殖合作社、集體經(jīng)濟(jì)示范村、鄉(xiāng)村旅游示范點(diǎn)的運(yùn)營(yíng)管理、農(nóng)村“兩委”建設(shè)、民主管理、村委會(huì)民主監(jiān)督等典型經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行了學(xué)習(xí)和交流。對(duì)長(zhǎng)治市城區(qū)相關(guān)社區(qū)基層黨建和社會(huì)管理工作進(jìn)行了深入了解。

番茄紅素含量的測(cè)定使用高效液相色譜儀(HPLC)。色譜柱:反相色譜柱C18;流動(dòng)相為乙腈∶甲醇∶異丙醇(80∶15∶5,v∶v∶v),流速1.2 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為472 nm,柱溫40 ℃,進(jìn)樣量10 μL。使用番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,通過(guò)稀釋番茄紅素母液,配制了以下濃度番茄紅素樣品:18、16、14、12、6、4、2、1 mg/L,根據(jù)相應(yīng)濃度番茄紅素樣品對(duì)應(yīng)的峰面積,可以得到其標(biāo)準(zhǔn)曲線為:Y=0.0286X-0.1968,R2=0.9972,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算番茄紅素的產(chǎn)量。

1.2.6 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1.2.6.1 不同誘導(dǎo)劑濃度對(duì)菌株生產(chǎn)番茄紅素的影響 以LB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,以含有pACMXDXS與pTrc99aEBI的菌株為優(yōu)化對(duì)象。待菌體OD600值達(dá)到0.6～0.8時(shí),用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo),選用誘導(dǎo)劑終濃度分別為0.025、0.05、0.1、0.2 mmol/L。

1.2.6.2 不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)菌株生產(chǎn)番茄紅素的影響 以LB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,以含有pACMXDXS與pTrc99aEBI的菌株為優(yōu)化對(duì)象。待菌體OD600值達(dá)到0.6～0.8時(shí),用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo),選取誘導(dǎo)劑添加時(shí)間分別為2、3、4、5 h。

1.2.6.3 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株生產(chǎn)番茄紅素的影響 以LB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,以含有pACMXDXS與pTrc99aEBI的菌株為優(yōu)化對(duì)象。選取菌株培養(yǎng)時(shí)間分別為12、18、24、30 h提取番茄紅素。

1.3 數(shù)據(jù)處理

以上實(shí)驗(yàn)分別重復(fù)2次,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用Microsoft Office Excel 2007。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同來(lái)源IDI基因與DXS基因的獲得

以本實(shí)驗(yàn)室保存的基因組為模板,依次用表1中的引物,分別對(duì)ECIDI、BSIDI、MXIDI、IOIDI和ECDXS、BSDXS、MXDXS、IODXS各種來(lái)源的目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,已知的各個(gè)基因大小分別為549、1050、1059、912、1863、1902、1752、1845 bp。PCR結(jié)果與各個(gè)基因的大小吻合,所得的核酸電泳圖如圖1所示。

圖1 不同來(lái)源IDI、DXS PCR擴(kuò)增產(chǎn)物核酸電泳圖Fig.1 Nucleic acid electrophoresis of the different IDI and DXS’s PCR products注:M.marker;1.ECIDI;2.BSIDI;3.MXIDI;4.IOIDI;5.ECDXS;6.BSDXS;7.MXDXS;8.IODXS。

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將合成番茄紅素CrtEBI基因及不同來(lái)源的4種idi、dxs基因分別插入質(zhì)粒pTrc99a、pACYC,構(gòu)建合成番茄紅素的99aEBI質(zhì)粒及含有idi、dxs基因的多種質(zhì)粒。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliDH5α,待培養(yǎng)后提取質(zhì)粒送測(cè)序,測(cè)序結(jié)果用軟件Vector NT1進(jìn)行比對(duì),結(jié)果表明各個(gè)質(zhì)粒均構(gòu)建成功。

2.3 重組質(zhì)粒的過(guò)表達(dá)及其對(duì)番茄紅素產(chǎn)量的影響

將含有番茄紅素合成基因的質(zhì)粒與新構(gòu)建的含有IDI、DXS的質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)中,獲得含不同來(lái)源功能基因的菌株。重組菌株培養(yǎng)離心結(jié)果如圖2,表明過(guò)表達(dá)DXS和IDI后重組菌產(chǎn)番茄紅素能力有所提升。在過(guò)表達(dá)不同來(lái)源IDI、DXS基因后,重組菌株番茄紅素產(chǎn)量得到了不同程度的提高,結(jié)果如圖3、圖4。在重組菌株中,目的基因來(lái)源于大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、粘細(xì)菌的菌株番茄紅素產(chǎn)量都有一定提升,添加誘導(dǎo)劑后，番茄紅素產(chǎn)量要明顯高于未添加誘導(dǎo)劑。

圖2 過(guò)表達(dá)DXS和IDI重組菌產(chǎn)番茄紅素情況Fig.2 Production of lycopene by strain with IDI注:A.對(duì)照菌株;B.過(guò)表達(dá)DXS的重組菌株;C.過(guò)表達(dá)IDI的重組菌株。

圖3 不同來(lái)源IDI對(duì)番茄紅素產(chǎn)量的影響Fig.3 Effects of IDIs on lycopene production 注:+表示添加IPTG進(jìn)行誘導(dǎo);圖4同。

圖4 不同來(lái)源DXS對(duì)番茄紅素產(chǎn)量的影響Fig.4 Effects of DXSs on lycopene production

表達(dá)ECIDI、BSIDI、MXIDI、IOIDI的菌株番茄紅素產(chǎn)量分別可以達(dá)到4.23、4.87、5.28、3.23 mg/g DCW。添加誘導(dǎo)劑IPTG后的菌株番茄紅素產(chǎn)量分別達(dá)到6.55、8.24、10.86、3.70 mg/g DCW,其中最高的M.XIDI比沒(méi)有轉(zhuǎn)化IDI的對(duì)照菌株產(chǎn)量(3.58 mg/g DCW)提高了約2.0倍。

表達(dá)ECDXS、BSDXS、MXDXS、IODXS的菌株番茄紅素產(chǎn)量分別可以達(dá)到4.88、2.79、3.18、3.03 mg/g DCW。添加誘導(dǎo)劑IPTG后的菌株番茄紅素產(chǎn)量分別達(dá)到5.19、4.33、7.94、4.07 mg/g DCW,其中最高的MXDXS比沒(méi)有轉(zhuǎn)化DXS的對(duì)照菌株產(chǎn)量(3.58 mg/g DCW)提高了約1.2倍。

2.4 IDI與DXS的協(xié)同表達(dá)對(duì)番茄紅素產(chǎn)量的影響

以上結(jié)果表明,相對(duì)于大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等菌株,來(lái)自粘細(xì)菌的IDI、DXS對(duì)MEP途徑的強(qiáng)化具有更明顯的作用。為了構(gòu)建高水平合成番茄紅素的大腸桿菌工程菌株,將粘細(xì)菌IDI及DXS進(jìn)行密碼子優(yōu)化獲得idi-dxs基因。通過(guò)協(xié)同表達(dá)IDI和DXS來(lái)進(jìn)一步提高番茄紅素的合成水平。將質(zhì)粒pACMYIDI-DXS和pTrc99aEBI轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)中,獲得高水平合成番茄紅素的菌株。在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 h后，添加IPTG進(jìn)行誘導(dǎo),約20 h后提取番茄紅素。在協(xié)同表達(dá)IDI、DXS后,重組菌株番茄紅素產(chǎn)量得到最高,達(dá)到15.26 mg/g DCW,比沒(méi)有轉(zhuǎn)化IDI、DXS的對(duì)照菌株產(chǎn)量(3.58 mg/g DCW)提高了約3.3倍。

2.5 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.5.1 不同誘導(dǎo)劑濃度對(duì)菌株生產(chǎn)番茄紅素的影響 添加誘導(dǎo)劑可顯著影響菌株生產(chǎn)番茄紅素的能力。從圖5可以看出，工程菌在添加了不同濃度的誘導(dǎo)劑培養(yǎng)時(shí),番茄紅素含量并沒(méi)有明顯差異,但終濃度為0.1、0.2 mmol/L的效果要稍好于其它濃度。

圖5 不同誘導(dǎo)劑濃度對(duì)番茄紅素產(chǎn)量的影響Fig.5 Effects of different inducerconcentration on lycopene production

2.5.2 不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)菌株生產(chǎn)番茄紅素的影響 菌株生長(zhǎng)到不同時(shí)間添加誘導(dǎo)劑可顯著影響菌株生產(chǎn)番茄紅素的能力。從圖6可以看出,菌株在生長(zhǎng)3 h添加誘導(dǎo)劑時(shí),番茄紅素含量最高,效果明顯好于其它時(shí)間。因此確定工程菌培養(yǎng)最適宜的誘導(dǎo)劑添加時(shí)間為培養(yǎng)3 h。

圖6 不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)番茄紅素產(chǎn)量的影響Fig.6 Effects of different inducer time on lycopene production

2.5.3 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株生產(chǎn)番茄紅素的影響 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)于番茄紅素產(chǎn)量有著明顯的影響,從圖7可以看出,工程菌在培養(yǎng)24 h左右,番茄紅素含量達(dá)到最高。因此確定工程菌培養(yǎng)最適宜的發(fā)酵時(shí)間為24 h。

圖7 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)番茄紅素產(chǎn)量的影響Fig.7 Effects of different incubation time on lycopene production

3 討論與結(jié)論

為達(dá)到利用大腸桿菌高效生產(chǎn)番茄紅素的目的,需要對(duì)番茄紅素的代謝途徑進(jìn)行改造和優(yōu)化[15]。其中,通過(guò)過(guò)表達(dá)番茄紅素代謝途徑中的關(guān)鍵酶基因,可以有效提高番茄紅素產(chǎn)量。IDI、DXS是合成番茄紅素等萜類化合物的關(guān)鍵催化酶,也是代謝工程對(duì)萜類化合物合成途徑改造的最重要的靶點(diǎn)之一[16]。Rad等[17]報(bào)道，II型IDI在大腸桿菌工程菌株中更有利于番茄紅素的合成,通過(guò)過(guò)表達(dá)II型枯草芽孢桿菌idi基因,將番茄紅素產(chǎn)量提高了約1.6倍;韓莉等[18]對(duì)2類IDI進(jìn)行了系統(tǒng)性分析,通過(guò)優(yōu)化多靶點(diǎn)組合及轉(zhuǎn)化時(shí)間將番茄紅素的產(chǎn)量提高到10.29 mg/g DCW。翁志明[19]通過(guò)對(duì)dxs基因啟動(dòng)子的置換將番茄紅素的產(chǎn)量提高到15.6 mg/g DCW。本研究中,選取了典型的大腸桿菌及枯草芽孢桿菌IDI、DXS作為對(duì)照,選取了本身能生產(chǎn)番茄紅素的戈壁奇球菌和粘細(xì)菌的IDI、DXS,比較了不同來(lái)源IDI、DXS對(duì)番茄紅素產(chǎn)量的影響。

本研究結(jié)果顯示,II型的枯草芽孢桿菌idi基因?qū)χ亟M大腸桿菌合成番茄紅素能力的促進(jìn)效果要優(yōu)于I型的大腸桿菌idi基因,這與文獻(xiàn)[20]報(bào)道所一致,但其dxs基因的促進(jìn)效果要比大腸桿菌差。而來(lái)自粘細(xì)菌的idi基因和dxs基因的促進(jìn)效果都優(yōu)于枯草芽孢桿菌和大腸桿菌。在發(fā)酵培養(yǎng)24 h后,番茄紅素產(chǎn)量達(dá)到10.86、7.94 mg/g DCW。協(xié)同表達(dá)經(jīng)過(guò)優(yōu)化后的idi-dxs基因,番茄紅素產(chǎn)量達(dá)到了15.26 mg/g DCW,比對(duì)照菌株提高了約3.3倍。由此可以說(shuō)明,來(lái)自粘細(xì)菌的idi、dxs基因優(yōu)于代謝工程改造中常用的基因。目前還未見(jiàn)報(bào)道利用粘細(xì)菌來(lái)源基因優(yōu)化MEP途徑,提高番茄紅素產(chǎn)量。這為后續(xù)代謝工程改造提供了新的基因資源。

為了進(jìn)一步提高番茄紅素產(chǎn)量,下一步的工作考慮把產(chǎn)番茄紅素基因及idi基因、dxs基因整合到基因組上,同時(shí)嘗試不同的啟動(dòng)子和RBS位點(diǎn)來(lái)改造和優(yōu)化代謝途徑。另外,進(jìn)一步對(duì)產(chǎn)番茄紅素工程菌株進(jìn)行培養(yǎng)條件的優(yōu)化及高密度發(fā)酵培養(yǎng),來(lái)提高番茄紅素產(chǎn)量。