丹參內(nèi)生鐮刀菌HBG16胞外多糖發(fā)酵條件優(yōu)化及其抗氧化能力

王玉婷,李存能,石鵬亮,張顯忠,史仁玖,李艷玲

(泰山醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,山東泰安 271016)

丹參是唇形科鼠尾草植物丹參(SalviamilitorrhizaBunge.)的干燥根莖[1]。在我國(guó),云南和四川省的鼠尾草種數(shù)最多,而丹參在橫斷山區(qū)的種植較為豐富[2]。丹參具有抗腫瘤[3]、保護(hù)心血管系統(tǒng)[4]、抗炎[5]、抗氧化[6]等藥理活性,是常用的活血化瘀中藥之一。丹參的有效活性成分主要為脂溶性物質(zhì)和水溶性物質(zhì)兩類。脂溶性物質(zhì)以丹參酮型的二萜醌類化合物為主,主要有丹參酮ⅡA、隱丹參酮、二氫丹參酮Ⅰ、異丹參酮Ⅰ等;水溶性物質(zhì)主要有丹參素、原兒茶醛、丹酚酸A、丹酚酸B等[7]。目前對(duì)丹參的研究主要集中在脂溶性丹參酮類和水溶性酚酸類物質(zhì),對(duì)丹參多糖的研究較少。藥理研究表明,丹參多糖有提高免疫力[8]、抗氧化[9]、保護(hù)肝臟[10]等生物活性,因此具有良好的臨床應(yīng)用前景。但目前野生丹參資源嚴(yán)重匱缺,無(wú)法滿足人們對(duì)丹參多糖的需求。

內(nèi)生真菌(Endophyte fungi)是指在其生活史中的某一階段或者全部階段生活在植物組織、器官或者細(xì)胞間隙內(nèi),沒(méi)有引起植物本身明顯病害癥狀的真菌。近年來(lái),研究表明，內(nèi)生真菌能產(chǎn)生與宿主相同或相似的具有生理活性的次生代謝產(chǎn)物[11]。在前期工作中,課題組從泰山丹參中分離得到多株產(chǎn)具有抗氧化活性的內(nèi)生真菌[12-13]。因此,本實(shí)驗(yàn)在前期研究工作的基礎(chǔ)上,對(duì)內(nèi)生鐮刀菌HBG16產(chǎn)胞外多糖的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,并對(duì)其抗氧化能力進(jìn)行分析,為真菌多糖的臨床應(yīng)用和工業(yè)化生產(chǎn)鑒定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

丹參鐮刀菌HBG16菌株 由泰山醫(yī)學(xué)院中藥生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離保存;PDA液體培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,補(bǔ)足水分至1000 mL,自然pH,121 ℃滅菌20 min;PDA固體培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂20 g,補(bǔ)足水分至1000 mL,自然pH,121 ℃滅菌20 min;基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基:30 g葡萄糖,3 g NaNO3,0.5 g KCl,0.5 g MgSO4·7H2O,0.01 g FeSO4·7H2O,1 g K2HPO4·3H2O,定容至1000 mL,自然pH,121 ℃滅菌20 min;麥芽糖 生化試劑,上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司;可溶性淀粉、尿素、葡萄糖、硝酸鈉 均為分析純,天津市凱通化學(xué)試劑有限公司;蛋白胨、酵母浸粉 均為生化試劑,北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;硫酸銨 分析純,天津市博迪化工有限公司;氯化鉀 分析純,天津市廣成化學(xué)試劑有限公司;硫酸鎂 分析純,天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠;硫酸亞鐵、蔗糖 均為分析純,天津市永大化學(xué)試劑有限公司;磷酸氫二鉀 分析純;天津市巴斯夫化工有限公司;玉米粉、麩皮 食品級(jí)，市售。

V-5100型可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司;RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;TP-114型電子天平 丹佛儀器(北京)有限公司;BS-2F型數(shù)顯振蕩培養(yǎng)箱 上海梅香儀器有限公司;SW-CJ-1FD型凈化工作臺(tái) 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;3-30K型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma離心機(jī)有限公司;OHpak SB-802.5HQ層析柱 島津公司;ELEOS System凝膠滲透色譜儀 美國(guó)Wyatt技術(shù)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HBG16菌株的固體培養(yǎng)及種子液制備 取斜面保存的HBG16菌種轉(zhuǎn)接到PDA固體培養(yǎng)基,28 ℃培養(yǎng)7 d,將長(zhǎng)勢(shì)良好的菌絲接到PDA平板,28 ℃培養(yǎng)7 d,用直徑約70 mm的打孔器，在活化的HBG16平板上打孔,取2個(gè)菌餅接入裝有100 mL PDA液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,置于轉(zhuǎn)速為130 r/min,溫度為28 ℃的搖床中培養(yǎng)3 d,作為種子液。

1.2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 采用苯酚-硫酸法測(cè)定葡萄糖的濃度,制備葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線[13]。將葡萄糖置于105 ℃烘箱中,烘干至恒重,稱取葡萄糖1.000 g于100 mL容量瓶中,定容,搖勻,即為葡萄糖儲(chǔ)備液。吸取10 mL葡萄糖儲(chǔ)備液于100 mL容量瓶中,定容,搖勻,即為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。取5支試管,用移液槍分別加入0.08、0.16、0.24、0.32、0.40 mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液,并用蒸餾水補(bǔ)足至2 mL,在每支試管中分別加入1 mL 5%苯酚和5 mL濃硫酸,混勻,靜置30 min,以加入2 mL蒸餾水的反應(yīng)液為空白對(duì)照調(diào)零,測(cè)定490 nm下的吸光度值,以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo),以吸光度值為縱坐標(biāo),繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

1.2.3 HBG16胞外多糖產(chǎn)量的測(cè)定 將種子液接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,置于轉(zhuǎn)速為130 r/min,溫度為28 ℃的搖床中培養(yǎng)7 d,發(fā)酵液經(jīng)抽濾,去除菌絲體,將濾液于60 ℃下旋蒸濃縮至原體積的1/3,加入三倍體積的95%乙醇,4 ℃下靜置過(guò)夜,經(jīng)6000 r/min,15 min離心,取沉淀,于60 ℃烘箱內(nèi)烘干至恒重,即為胞外多糖。精確稱量胞外多糖的質(zhì)量,研磨后,稱取20 mg胞外多糖,加蒸餾水定容至100 mL,用移液管吸取2 mL于試管中,加入1 mL 5%苯酚溶液和5 mL濃硫酸,搖勻靜置30 min,于490 nm下測(cè)量胞外多糖的吸光度值,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行換算。

1.2.4 HBG16產(chǎn)胞外多糖發(fā)酵條件優(yōu)化

1.2.4.1 單因素實(shí)驗(yàn) 參考李傳民[14]的方法,以3 g/L NaNO3為唯一氮源,分別以30 g/L的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、玉米粉、麩皮為碳源,保持原發(fā)酵液pH,接種量為10%,130 r/min、28 ℃,培養(yǎng)7 d,檢測(cè)胞外多糖的產(chǎn)量,確定最佳碳源。

在上述試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以30 g/L麥芽糖為唯一碳源,分別以3 g/L硝酸鈉、尿素、胰蛋白胨、硫酸銨、酵母粉為氮源,保持原發(fā)酵液pH,接種量為10%,130 r/min、28 ℃,培養(yǎng)7 d,檢測(cè)胞外多糖的產(chǎn)量,確定最佳氮源。

在上述試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以30 g/L麥芽糖為碳源,3 g/L酵母粉為氮源,用NaOH溶液和稀硫酸調(diào)整液體培養(yǎng)基的pH分別為5.0、6.0、7.0、8.0,130 r/min、28 ℃,培養(yǎng)7 d,檢測(cè)胞外多糖的產(chǎn)量,確定液體培養(yǎng)基的最佳pH。

在上述試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,分別以30 g/L麥芽糖為碳源,3 g/L酵母粉為氮源,培養(yǎng)基pH6.0,以2%、6%、10%、15%、20%的接種量,接入裝有100 mL液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,130 r/min、28 ℃,培養(yǎng)7 d,檢測(cè)胞外多糖的產(chǎn)量,確定最佳接種量。

1.2.4.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,利用Box-Behnken試驗(yàn)原理,選擇碳源、氮源、接種量、pH四個(gè)水平,設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn),Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析因素及水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。并利用Design-Expert軟件對(duì)每個(gè)因素下產(chǎn)生的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合,以此求得產(chǎn)胞外多糖的丹參內(nèi)生鐮刀菌HBG16的最佳發(fā)酵條件。利用最佳發(fā)酵條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)量多糖產(chǎn)量和菌絲干重，做三組平行實(shí)驗(yàn)，取平均值。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素與水平表Table 1 Factors and levels table of Box-Behnken experiment

1.2.5 HBG16胞外多糖的單糖組成分析 采用凝膠滲透色譜法(GPC)進(jìn)行樣品單糖組成分析。前處理:稱取一定量的硝酸鈉溶于蒸餾水并稀釋至1 L,配制成0.2 mol/L的NaNO3溶液,過(guò)0.22 μm孔徑濾膜,50 Hz,超聲脫氣15 min。稱取一定量的樣品溶于流動(dòng)相中,定容至100 mL。移取此溶液10 mL,用流動(dòng)相稀釋并定容至50 mL,過(guò)膜,上機(jī)。檢測(cè)條件:色譜柱:OHpak SB-802.5HQ;進(jìn)樣量:20 μL;柱溫:25 ℃;流動(dòng)相:NaNO3溶液;流速:0.500 mL/min;檢測(cè)器:示差檢測(cè)器(DRI)。

(2)加強(qiáng)管理。目前，煤炭建設(shè)項(xiàng)目在控制和激勵(lì)體制方面還不夠完善。由于控制不足，導(dǎo)致設(shè)計(jì)方案和工程造價(jià)質(zhì)量不高，因此，需要建立健全一套嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)控制其質(zhì)量。另外，還需要有良好的激勵(lì)制度，以調(diào)動(dòng)設(shè)計(jì)人員和造價(jià)人員的工作積極性，達(dá)到有效控制工程造價(jià)的目的。

1.2.6 HBG16胞外多糖的體外抗氧化活性測(cè)定 采用DPPH法[15]對(duì)胞外多糖的體外抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。吸取不同濃度的樣品溶液3.0 mL,分別加入2.0 mL 0.2 mmol/L DPPH·溶液,搖勻后避光放置30 min。以2.0 mL蒸餾水與2.0 mL無(wú)水乙醇的混合溶液為對(duì)照,用分光光度計(jì)分別測(cè)定上述溶液在517 nm處的吸光度值A(chǔ)i,以相同濃度的VC做對(duì)照。吸取不同濃度的樣品溶液3.0 mL,分別加入2.0 mL蒸餾水,混合均勻,以蒸餾水為對(duì)照,用分光光度計(jì)分別測(cè)定各混合液在517 nm處的吸光度值A(chǔ)j,以相同濃度的VC溶液做對(duì)照。吸取2 mL 0.2 mmol/L DPPH·溶液,加入2 mL蒸餾水混合均勻,以2 mL蒸餾水與2 mL無(wú)水乙醇的混合溶液為對(duì)照,用分光光度計(jì)測(cè)定上述溶液在517 nm處吸光度值A(chǔ)0。按下式計(jì)算DPPH·清除率。

DPPH·清除率(%)=[(A0-Ai+Aj)/A0]×100

式中，Ai為樣品溶液和VC溶液與DPPH·溶液混合后在波長(zhǎng)517 nm處的吸光度值;Aj為樣品溶液和VC溶液與等體積溶劑混合后在517 nm處的吸光度值;A0為DPPH·溶液與等體積溶劑混合后在517 nm處的吸光度值。

清除率為50%時(shí),所需抗氧化劑的濃度即為半數(shù)抑制率IC50值(mg/mL)。

2 結(jié)果與分析

2.1 HBG16產(chǎn)胞外多糖發(fā)酵條件的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 碳源對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響 由圖2可知,以麥芽糖為碳源時(shí),多糖產(chǎn)量最高,蔗糖、葡萄糖、玉米粉差異較小,利用麩皮作為碳源,多糖產(chǎn)量最低,以此確定最佳碳源為麥芽糖,出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是當(dāng)碳源為30 g/L時(shí),丹參內(nèi)生鐮刀菌HBG16對(duì)麥芽糖的轉(zhuǎn)化利用率較高[14]。

圖2 碳源對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of carbon sources on theproduction of extracellular polysaccharide注:圖中不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(p<0.05),下同。

2.1.2 氮源對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響 由圖3可知,以酵母粉為氮源時(shí),多糖產(chǎn)量最高,以尿素、硝酸鈉、胰化蛋白胨、硫酸銨為氮源時(shí),多糖產(chǎn)量差異不顯著(p>0.05)。原因可能是當(dāng)?shù)礊? g/L時(shí),鐮刀菌HBG16對(duì)酵母粉的轉(zhuǎn)化率更高[16]。

圖3 氮源對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of nitrogen sources on theproduction of extracellular polysaccharide

2.1.3 pH對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響 由圖4可知,當(dāng)pH5.0和pH6.0時(shí),內(nèi)生鐮刀菌HBG16胞外多糖產(chǎn)量均較高。在pH6.0之后,隨pH增加,HBG16多糖產(chǎn)量減少。說(shuō)明丹參內(nèi)生鐮刀菌HBG16在弱酸條件下,胞外多糖的產(chǎn)量比中性及弱堿條件下更高[17]。

圖4 pH對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of pH on theproduction of extracellular polysaccharide

圖5 接種量對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of inoculum amout on theproduction of extracellular polysaccharide

2.2 響應(yīng)面法對(duì)丹參內(nèi)生鐮刀菌HBG16胞外多糖產(chǎn)量的優(yōu)化

2.2.1 根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)原理,以丹參內(nèi)生鐮刀菌HBG16胞外多糖產(chǎn)量為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果如表2所示。利用Design-Expert軟件對(duì)每個(gè)因素下產(chǎn)生的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合。得到丹參內(nèi)生鐮刀菌HBZ16胞外多糖產(chǎn)量(Y)對(duì)麥芽糖(A)、酵母粉(B)、接種量(C)、pH(D)的二次回歸多項(xiàng)方程為:

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken

Y=0.95+0.11A-0.082B+0.008083C+0.011D-0.14AB+0.12AC+0.017AD-0.00375BC+0.00075BD-0.02CD-0.32A2-0.3B2-0.36C2-0.38D2

表3 回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis of regression equatio

2.2.2 因素間交互作用的影響 圖6響應(yīng)面的等高線為橢圓形,坡度較陡,說(shuō)明麥芽糖和酵母粉交互作用強(qiáng),對(duì)于胞外多糖產(chǎn)量的影響較大;同時(shí)麥芽糖對(duì)應(yīng)的曲面相對(duì)于酵母粉而言較陡,說(shuō)明麥芽糖對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響要大于酵母粉。圖7響應(yīng)面的等高線為橢圓形,坡度較陡,說(shuō)明麥芽糖和接種量交互作用強(qiáng),對(duì)于胞外多糖產(chǎn)量的影響較大;同時(shí)麥芽糖對(duì)應(yīng)的曲面相對(duì)于接種量而言較陡,說(shuō)明麥芽糖對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響要大于接種量。圖8 響應(yīng)面的等高線為近似于圓形的橢圓形,坡度較緩,說(shuō)明麥芽糖和pH交互作用不強(qiáng),對(duì)于胞外多糖產(chǎn)量的影響較小;同時(shí)麥芽糖對(duì)應(yīng)的曲面相對(duì)于pH而言較陡,說(shuō)明麥芽糖對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響要大于pH。圖9響應(yīng)面的等高線為近似于圓形的橢圓形,坡度較緩,說(shuō)明接種量和酵母粉交互作用不強(qiáng),對(duì)于胞外多糖產(chǎn)量的影響較小;同時(shí)酵母粉對(duì)應(yīng)的曲面相對(duì)于接種量而言較陡,說(shuō)明酵母粉對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響要大于接種量。圖10響應(yīng)面的等高線為近似于圓形的橢圓形,坡度較緩,說(shuō)明接pH和酵母粉交互作用不強(qiáng),對(duì)于胞外多糖產(chǎn)量的影響較小;同時(shí)酵母粉對(duì)應(yīng)的曲面相對(duì)于pH而言較陡,說(shuō)明酵母粉對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響要大于pH。圖11響應(yīng)面的等高線為近似于圓形的橢圓形,坡度較緩,說(shuō)明接種量和pH交互作用不強(qiáng),對(duì)于胞外多糖產(chǎn)量的影響較小;同時(shí)pH對(duì)應(yīng)的曲面相對(duì)于接種量而言較陡,說(shuō)明pH對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響要大于接種量。

圖6 麥芽糖和酵母粉的交互作用及對(duì)多糖產(chǎn)量的影響Fig.6 The response surface analysis chart of maltose and yeast powder

圖7 麥芽糖和接種量的交互作用及對(duì)多糖產(chǎn)量的影響Fig.7 The response surface analysis chart of maltose and inoculums size

圖8 麥芽糖和pH的交互作用及對(duì)多糖產(chǎn)量的影響Fig.8 The response surface analysis chart of interaction of maltose and pH

圖9 接種量和酵母粉的交互作用及對(duì)多糖產(chǎn)量的影響Fig.9 The response surface analysis chart of interaction of inculum amout and yeast powder

圖10 pH和酵母粉的交互作用及對(duì)多糖產(chǎn)量的影響Fig.10 The response surface analysischart of interaction of pH and yeast powder

圖11 pH和接種量的交互作用及對(duì)多糖產(chǎn)量的影響Fig.11 The response surface analysischart of interaction of pH and inoculum amout

2.2.3 丹參內(nèi)生鐮刀菌HBG16培養(yǎng)條件優(yōu)化及驗(yàn)證 通過(guò)對(duì)回歸模型進(jìn)行分析,得出鐮刀菌HBG16的最佳培養(yǎng)條件為麥芽糖32.2 mg/mL,酵母粉2.62 mg/mL,接種量為6.2%,pH為6.0,模型預(yù)測(cè)值0.97 mg/mL,考慮到實(shí)際操作的可行性,對(duì)最佳培養(yǎng)條件進(jìn)行修正,麥芽糖32 mg/mL、酵母粉2.6 mg/mL、接種量為6%、pH為6.0,以此條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),得到HBG16胞外多糖產(chǎn)量、菌絲干重隨培養(yǎng)時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化,如圖12。結(jié)果表明,在第1 d時(shí),HBG16胞外多糖產(chǎn)量最高,主要是由于麥芽糖未被HBG16充分吸收利用,此時(shí)測(cè)得的結(jié)果應(yīng)主要為培養(yǎng)基中麥芽糖在苯酚-硫酸反應(yīng)中的結(jié)果,而胞外多糖含量較少,在第7 d得到多糖產(chǎn)量0.95 mg/mL,模型預(yù)測(cè)值0.97 mg/mL,與預(yù)測(cè)值的偏差為2.06%,說(shuō)明該模型擬合度良好。

圖12 胞外多糖產(chǎn)量、菌絲干重動(dòng)態(tài)變化Fig.12 Dynamic changes of pplysaccharideyield and mycelial dry weight

2.3 HBG16胞外多糖的單糖組成分析

凝膠柱色譜利用分子篩的分離原理,樣品進(jìn)入色譜柱后，在流動(dòng)相的帶動(dòng)下，按照分子量由大到小的順序流出色譜柱。本實(shí)驗(yàn)分別以甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、核糖、巖藻糖為標(biāo)準(zhǔn)品作對(duì)照，進(jìn)行單糖組分分析,結(jié)果表明胞外多糖的單糖組成主要是半乳糖,其含量為52.09 mg/kg。

2.4 HBG16胞外多糖對(duì)DPPH·的清除作用

圖13表明,在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),隨著濃度上升,多糖對(duì)DPPH自由基清除率增大,當(dāng)胞外多糖濃度為1.0 mg/mL時(shí)，清除率為87.85%,VC清除率隨VC濃度增加而增加,結(jié)果表明,胞外多糖對(duì)DPPH清除率與VC相比略低,但胞外多糖濃度越高,清除率越高,胞外多糖的IC50值為0.38 mg/mL。

圖13 胞外多糖對(duì)DPPH自由基清除作用Fig.13 Scaveging effect of polysaccharide on DPPH radicals

3 結(jié)論

本研究采用單因素實(shí)驗(yàn)分析了麥芽糖、酵母粉、接種量、pH對(duì)丹參內(nèi)生真菌胞外多糖產(chǎn)量的影響,在此基礎(chǔ)上,通過(guò)Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)確定了HBG16胞外多糖產(chǎn)生的最佳培養(yǎng)條件為麥芽糖32 mg/mL,酵母粉2.6 mg/mL,pH為6.0,接種量為6%。這四個(gè)因素對(duì)HBG16胞外多糖產(chǎn)量的影響順序依次為麥芽糖>酵母粉>pH>接種量。在該優(yōu)化條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),多糖產(chǎn)量為0.95 mg/mL,與預(yù)測(cè)值偏差較小,充分證明了方法的可靠性,可應(yīng)用于丹參內(nèi)生鐮刀菌HBG16液體發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖。清除DPPH自由基實(shí)驗(yàn)表明，丹參內(nèi)生鐮刀菌HBG16胞外多糖具有一定的抗氧化能力,研究結(jié)果為丹參內(nèi)生真菌胞外多糖的開(kāi)發(fā)利用和工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。