降解植物甾醇產(chǎn)雄甾1,4-二烯-3,17-二酮工程菌株的構建及轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基優(yōu)化

劉相岑,郝曉蔚,張瑞婕,馮雯雯,朱晨光,*,張保國,*,史吉平

(1.上海大學生命科學學院,上海 200444;2.中國科學院上海高等研究院,上海 201210;3.河北科技大學,河北石家莊 050018)

甾體藥物作為除抗生素外的第二大類藥物,廣泛應用于消炎、抗菌、抗腫瘤等領域[1]。雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)和雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)作為植物甾醇的代謝產(chǎn)物，是生產(chǎn)甾體藥物不可或缺的關鍵中間體,幾乎所有的激素類藥物都可以其為原料進行生產(chǎn)[2]。傳統(tǒng)工業(yè)多以化學方法合成甾體藥物,但化學合成法存在工業(yè)污染嚴重，且目標產(chǎn)物收率低、成本高等問題,嚴重限制了甾體激素在藥學領域的發(fā)展[3]。目前發(fā)現(xiàn)多種微生物如分枝桿菌、諾卡氏菌等，能通過體內(nèi)相應的酶系高效降解甾醇，得到多種甾藥中間體如9-OH-AD、AD、ADD等;以這些甾藥中間體為前體，合成其他高價值甾體藥物的方法具有產(chǎn)率高、污染小、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點。因此,采用微生物轉(zhuǎn)化法降解植物甾醇獲得ADD等甾體藥物的重要中間體，成為甾體激素類行業(yè)中的一個研究熱點[4-5]。

3-甾酮-Δ1脫氫酶(KstD)是植物甾醇生物轉(zhuǎn)化過程中關鍵酶[6],是一種催化3-酮類固醇1,2-去飽和的誘導型黃素酶,能催化AD的A環(huán)C1,2脫氫形成雙鍵而制得ADD[7],可極大地增加藥物的生物活性和經(jīng)濟價值。例如可的松和皮質(zhì)醇的1-脫氫衍生物較其本身可表現(xiàn)出更強的抗過敏和抗風濕活性,且副作用顯著降低[8]。KstD不僅能夠催化AD轉(zhuǎn)化成ADD,而且對微生物甾醇代謝和其他甾藥合成也起著重要的作用[9-10]。目前大多數(shù)研究都是通過在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等菌體內(nèi)過表達KstD基因構建KstD過表達菌[11-15],然后以價格昂貴的AD為底物進行發(fā)酵脫氫而得到ADD,這種通過AD脫氫生產(chǎn)ADD的方法底物投料量低,生產(chǎn)成本相對增加[16-18],無法滿足工業(yè)應用。

因此,為提高ADD生產(chǎn)水平,本研究通過在一株產(chǎn)AD的基因突變菌Mycobacteriumsp. ZFZ體內(nèi)過表達KstD基因構建一株3-甾酮-Δ1脫氫酶過表達菌直接降解植物甾醇一步生成ADD;通過單因素和響應面實驗，分析優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，來提高其生產(chǎn)ADD的能力,以期實現(xiàn)ADD生產(chǎn)工藝的優(yōu)化和產(chǎn)率的提升。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌EscherichiacoliDH5α、分枝桿菌(Mycobacterium.DSM1381,Mycobacteriumsp. ZFZ)、分枝桿菌整合表達質(zhì)粒pMV306 本實驗室-80 ℃保藏;Prime STAR HS、限制性內(nèi)切酶及in-fusion連接酶 TaKaRa公司;基因組提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒 康寧生命科學有限公司;卡那霉素 上海麥克林生化科技有限公司;植物甾醇 江蘇越紅飼料有限公司;玉米漿 上海源肽生物技術有限公司;牛肉膏、酵母粉、葡萄糖、甘油、蛋白胨 上海生工生物工程有限公司;K2HPO4、NaNO3、甲醇、乙酸乙酯等 分析純,國藥集團(上海)化學試劑有限公司。

LC-20AD型高效液相色譜儀 日本島津公司;GC-2010Plus氣相色譜儀 日本島津公司;BSA 224S-CW型電子天平 德國Sartorius;BX51 型顯微鏡 日本OLYMPUS;ZHWY-2102C型恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司;Centrifuge5430 低溫離心機 德國Eppendorf公司;Molecular Imager? Gel DocTMXR System 生物技術公司;天能EPS 300型電泳儀 上海天能科技有限公司;HWS-12型數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海一恒公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基及母液配制 大腸桿菌LB培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/L,酵母粉5 g/L,氯化鈉10 g/L,pH7.0,121 ℃,滅菌20 min;種子培養(yǎng)基:酵母粉15 g/L,葡萄糖6 g/L,硝酸鈉5.4 g/L,磷酸氫二銨0.6 g/L,吐溫-80 2 g/L,pH7.5,115 ℃,滅菌15 min;初始發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖10 g/L,蛋白胨 10 g/L,K2HPO43 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,吐溫80 2 g/L,植物甾醇10 g/L,pH7.5,115 ℃,滅菌15 min;植物甾醇乳化母液:稱取24 g植物甾醇,加入1 g吐溫80,用去離子水定容至400 mL，配成60 g/L的濃度,攪拌20 min,超聲溶解60 min,121 ℃滅菌1 h備用。

1.2.2 過表達質(zhì)粒pMV306-Psmyc-kstd的構建 分枝桿菌1381基因組DNA的收集參照基因組提取試劑盒的方法。以引物Psmyc-F/R(gatctttaaatctaga GGATCGTCGGCACCGTCA/gct tgatatcgaattc GGATCG TGCTCATTTCGGG)擴增啟動子Psmyc，并利用in-fusion同源重組的方法，將其連接到質(zhì)粒pMV306的XbaI和EcoRI位點之間，構建pMV306-Psmyc質(zhì)粒;然后根據(jù)GENBANK公布的MycobacteriumATCC 25795基因組上的Kstd1序列為模板，設計擴增引物KstD-F/R(tatgggatccgaattcGTGTTCTACATGACTGC CCAGGA/tagttaactacgtcgac TCAGGCCTTTCCAGCGAGA)擴增MycobacteriumneoauriumDSM1381基因組上的kstd基因,并將其重組到pMV306-Psmyc質(zhì)粒的EcoRI和SalI位點之間,構建KstD的過表達質(zhì)粒pMV306-Psmyc-kstd。

1.2.3 分枝桿菌電轉(zhuǎn)與篩選 將構建好的過表達質(zhì)粒pMV306-Psmyc-kstd電擊轉(zhuǎn)入分枝桿菌感受態(tài),在50 μg/mL的卡那霉素抗性平板上挑取單克隆,繼續(xù)進行PCR驗證，得到陽性轉(zhuǎn)化子。

1.2.4 微生物培養(yǎng)及甾體轉(zhuǎn)化條件 將構建的過表達菌和野生菌株于平板培養(yǎng)基活化,30 ℃恒溫培養(yǎng)3 d后，挑取單克隆接種于種子培養(yǎng)基中,30 ℃,160 r/min培養(yǎng)至對數(shù)后期(OD600=6),獲得液體種子。發(fā)酵培養(yǎng)基中接入10%體積的液體菌種，并補加滅菌后的葡萄糖溶液至5 g/L;放置30 ℃,160 r/min振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)至96 h時，取樣進行HPLC和GC檢測產(chǎn)物及底物濃度。

1.2.5 檢測方法 對于具有共軛結(jié)構的甾體化合物AD和ADD及其他甾體中間產(chǎn)物可以利用高效液相色譜檢測其在UV254 nm下的吸收值,通過比對標準品建立的標準曲線,可以測定產(chǎn)物的相對含量。

高效液相色譜(HPLC)檢測條件:采用C18反相層析柱(Agilent SDB-C18,4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相為70%甲醇:30%水(V/V),流速為1.0 mL/min;柱溫為40 ℃;紫外檢測波長為254 nm;進樣體積為20μL。而對于在紫外光下無吸收的植物甾醇，則通過氣相色譜檢測甾醇化合物的含量,具體參考柳相鶴等[19]的方法。

1.2.6 培養(yǎng)基優(yōu)化方法

1.2.6.1 氮源單因素實驗 根據(jù)預實驗選擇的玉米漿作為有機氮源,以ADD產(chǎn)量為指標,設置其濃度梯度為5、10、15、20、25、30、35、40(g/L),其他條件不變(本研究優(yōu)化過程中由于MgSO4·7H2O對菌株發(fā)酵影響較小,因此濃度固定為0.5 g/L暫不做優(yōu)化處理,下同)進行實驗,選出獲得ADD最大濃度的玉米漿濃度。隨后在此玉米漿濃度的基礎上，繼續(xù)添加無機碳源硝酸鈉,設置其濃度梯度為0、3、6、9、12、15 (g/L)分別進行實驗,每組實驗重復3次。

1.2.6.2 碳源單因素實驗 根據(jù)預實驗選擇的葡萄糖作為碳源,以ADD產(chǎn)量為指標,設置濃度梯度為1、5、9、13、17、21 (g/L)進行實驗,選擇適宜的碳源濃度(其他條件不變),每組實驗重復3次。

1.2.6.3 磷酸鹽單因素實驗 根據(jù)預實驗選擇的磷酸氫二鉀作為磷酸源,以ADD產(chǎn)量為指標,設置濃度梯度為0.5、2.0、3.5、5.0、6.5、8.0 (g/L)進行實驗,選擇適宜的磷酸鹽源濃度(其他條件不變),每組實驗重復3次。

1.2.6.4 響應面試驗設計 根據(jù)單因素實驗結(jié)果,選用玉米漿、硝酸鈉、葡萄糖和磷酸鹽磷酸氫二鉀的濃度為考察因素,以ADD產(chǎn)量為指標,采用Design-Expert8.0.6軟件設計4因素3水平實驗響應面試驗,試驗因子和編碼水平如表1所示。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels for response surface methodology

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實驗通過Design-Expert8.0.6軟件，進行響應面實驗設計及數(shù)據(jù)分析，并對最優(yōu)結(jié)果進行預測驗證,采用Origin Pro2017軟件進行數(shù)據(jù)處理。用q檢驗法進行多重比較,標有不同小寫字母表示組間差異顯著(p<0.05),標有相同小寫字母者表示組間差異不顯著(p>0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒的構建與過表達菌株篩選

過表達質(zhì)粒構建方法如圖1所示,以引物Psmyc-F/R、KstD-F/R對pMV306和pMV306-Psmyc-KstD進行PCR驗證(如圖2所示),并送上海金維智測序公司測序防止基因點突變。

圖1 過表達質(zhì)粒pMV306-Psmyc-Kstd的構建策略Fig.1 Construction schematic of over-expression plasmid pMV306-Psmyc-Kstd

在對陽性轉(zhuǎn)化子篩選驗證時發(fā)現(xiàn)，陰性對照和轉(zhuǎn)化子均有kstd條帶(見圖2),原因是出發(fā)菌株Mycobacteriumsp. ZFZ是一株主要產(chǎn)物為AD的基因突變菌,可能菌株本身基因組上脫氫酶僅關鍵活性位點發(fā)生了突變，導致其喪失了脫氫能力,所以基因組中也有相應大小的條帶(圖2泳道4);而轉(zhuǎn)化子PCR產(chǎn)物驗證條帶(圖2泳道5)相比出發(fā)菌株條帶較大,由于模板增加，導致相同時間PCR擴增后的產(chǎn)物濃度比初始菌多一倍，說明轉(zhuǎn)化子菌株基因組已經(jīng)導入了外源KstD基因,而轉(zhuǎn)化子是否具有脫氫效果則需進行甾醇轉(zhuǎn)化進一步驗證。

圖2 過表達質(zhì)粒的電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR products注:M:DNA Marker;1:Psmyc啟動子驗證條帶;2:Kstd基因驗證條帶;3:質(zhì)粒pMV306-Psmyc-KstD酶切驗證;4:出發(fā)菌株ZFZ對照;5:重組菌ZFZ321驗證。

2.2 過表達菌株的生長狀況

KstD過表達菌株Mycobacteriumsp.ZFZ321與初始菌ZFZ的生長情況如圖3所示,可以看出轉(zhuǎn)入3-甾酮-Δ1脫氫酶的ZFZ321菌株在遲緩期和對數(shù)期都要比無3-甾酮-Δ1脫氫酶活性的初始菌株ZFZ的生長狀況要好,可能是因為，3-甾酮-Δ1脫氫酶除了具有C1,2脫氫效果，還對分枝桿菌的生長具有一定的調(diào)節(jié)作用。

圖3 Mycobacterium sp. ZFZ和ZFZ21的生長曲線Fig.3 Growth curve of Mycobacterium sp. ZFZ and ZFZ321

2.3 過表達菌株的甾醇轉(zhuǎn)化

Mycobacteriumsp. ZFZ and ZFZ321對植物甾醇的轉(zhuǎn)化結(jié)果如圖4所示,ZFZ菌株發(fā)酵液中仍有部分ADD積累,說明此出發(fā)分枝桿菌本身發(fā)生突變的脫氫酶仍有相對較低的脫氫效果，或菌株可能還有具有其他脫氫活性較低的酶存在，故積累量極少，僅有0.21 g/L左右,而過表達菌株ZFZ321的發(fā)酵液中，隨著時間的延長,ADD濃度逐漸增加值1.2 g/L左右,相比初始菌ZFZ產(chǎn)量提高了近5倍,說明Mycobacterium.DSM1381基因組中的KstD脫氫酶對于AD脫氫具有明顯效果。

圖4 ZFZ和ZFZ321對植物甾醇的生物轉(zhuǎn)化Fig.4 Bioconversion of phytosterols by ZFZ and ZFZ321

2.4 單因素實驗

2.4.1 氮源的選擇 作為分枝桿菌生長需求量非常大的組成元素,合適的氮源水平對于微生物生物量的積累和甾醇降解具有非常重要的影響。當發(fā)酵培養(yǎng)基中有過高的氮源水平時,菌體有充分的營養(yǎng)物質(zhì)維持自身的生長代謝，會降低對底物甾醇的利用;而氮源水平不足時,也會影響微生物對底物的利用。

隨著玉米漿濃度增加(圖5),ADD產(chǎn)量也逐漸增加;在玉米漿濃度達25 g/L時,ADD產(chǎn)量達到最高3.57 g/L;玉米漿濃度超過25 g/L時,發(fā)酵液中ADD積累量逐漸降低,這可能是由于，營養(yǎng)物質(zhì)過剩導致菌株降解植物甾醇不充分。因此,選擇25 g/L的玉米漿進行后續(xù)實驗。

圖5 玉米漿濃度對ADD產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of corn steep liquor concentration on ADD yield

圖6為在玉米漿25 g/L濃度下,篩選無機氮源硝酸鈉濃度對ADD產(chǎn)量的影響結(jié)果。由于是在玉米漿存在的基礎上，篩選合適的硝酸鈉濃度,發(fā)酵過程中已經(jīng)存在較多的氮源,因此在0～15 g/L的區(qū)間篩選硝酸鈉濃度水平。由圖6可知，在硝酸鈉濃度為3 g/L時,ADD產(chǎn)量達到最高,為3.69 g/L,隨著硝酸鈉濃度的進一步增加,ADD的積累量逐漸降低,原因可能是，少量的Na+可以促進微生物的代謝并且增加KstD的活性,從而使ADD的產(chǎn)量提高;而高濃度的Na+環(huán)境中,Na+和微生物體內(nèi)的陰離子結(jié)合會對微生物產(chǎn)生毒害作用，從而抑制了微生物的代謝。

圖6 硝酸鈉濃度對ADD產(chǎn)量的影響(玉米漿25 g/L)Fig.6 Effect of sodium nitrate concentration on ADD yield(corn steep liquor concentration 25 g/L)

綜上所述,在玉米漿作為主要氮源條件下,少量的硝酸鈉會促進重組菌ZFZ321降解植物甾醇生產(chǎn)ADD;因此選擇玉米漿25 g/L和硝酸鈉3 g/L作為氮源進行后續(xù)研究。

2.4.2 碳源的選擇 碳源作為微生物培養(yǎng)基的基本成分,能夠為菌體的生長代謝提供能量及菌體細胞組成原料、噬菌體生長的必需能源物質(zhì),合適的碳源有利于促進某些酶的合成,增強分枝桿菌對甾醇的降解活性。

圖7展示了葡萄糖濃度對菌株ZFZ321轉(zhuǎn)化甾醇的影響。如圖7所示,葡萄糖濃度對菌株生產(chǎn)ADD濃度有顯著性影響(p<0.05)。隨著葡萄糖濃度升高,ADD積累量也隨之增加,葡萄糖濃度為9 g/L時,發(fā)酵液中ADD濃度達到最大值(3.82 g/L);當葡萄糖濃度繼續(xù)增加時,ADD產(chǎn)量隨之降低,原因可能是，低濃度的葡萄糖影響了菌體的生長狀態(tài)而導致轉(zhuǎn)化效率不高,而過高濃度的葡萄糖導致菌體攝取過多的糖用于生長代謝，而減少了對甾醇的攝取,使得ADD積累量降低。因此,后續(xù)實驗選擇9 g/L的葡萄糖作為碳源進行后續(xù)研究。

圖7 不同葡萄糖濃度對ADD產(chǎn)量的影響Fig.7 Effect of glucose concentration on ADD yield

2.4.3 磷酸鹽的選擇 磷元素作為生物體核酸蛋白等的主要成分,影響菌體的能荷狀態(tài),且磷酸鹽作為緩沖鹽,對于發(fā)酵培養(yǎng)pH的穩(wěn)定有重要作用。圖8顯示了磷酸氫二鉀濃度梯度對重組菌ZFZ321積累ADD的影響。在磷酸氫二鉀濃度為2 g/L的發(fā)酵液中，ADD的積累量達4.21 g/L,當濃度繼續(xù)增加時,ADD的積累量逐漸降低。

圖8 不同磷酸鹽濃度對ADD產(chǎn)量的影響Fig.8 Effect of phosphate source concentration on ADD

2.5 響應面試驗優(yōu)化結(jié)果

2.5.1 模型的建立及顯著性檢驗 利用軟件Design-Expert 8.0.6對表2結(jié)果進行分析,方差分析結(jié)果如表3所示。對實驗結(jié)果進行多元回歸擬合,得到Mycobacteriumsp.ZFZ321發(fā)酵植物甾醇產(chǎn)ADD濃度Y對玉米漿(A)、磷酸氫二鉀(B)、硝酸鈉(C)、葡萄糖(D)的多項回歸方程式:

表2 響應面試驗設計及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface test

Y=3.86-0.44A-0.031B-0.091C+8.667E-004D+0.18AB+0.13AC-0.16AD+7.200E-003BC-0.036BD+0.34CD-1.21A2-1.06B2-0.55C2-0.61D2

表3 ADD產(chǎn)量多項式回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance(ANOVA)for the quadratic polynomial model for dehydrogenases

2.5.2 響應面優(yōu)化及分析 根據(jù)回歸模型作出響應面圖和等高線圖,考察各因素交互作用[20]對ADD產(chǎn)量的影響,結(jié)果見圖9。

圖9 因素間交互作用的響應面分析Fig.9 Response surface analysis of the interaction of different factors

交互作用的大小可由等高線的形狀來反映,若呈橢圓形,說明兩因素的交互作用顯著,若呈圓形則相反,而響應面曲線較陡也說明兩因素交互作用顯著。如圖9所示,AB、AD、CD之間交互作用對ADD產(chǎn)量的影響顯著,表現(xiàn)為響應曲線較陡。其中AB、AD為顯著(p<0.05),CD為極顯著(p<0.01)。

根據(jù)響應面結(jié)果分析計算,可得到Mycobacteriumsp. ZFZ321發(fā)酵轉(zhuǎn)化植物甾醇產(chǎn)ADD的最佳培養(yǎng)基配方:玉米漿23.11 g/L、硝酸鈉2.78 g/L、磷酸氫二鉀1.95 g/L、葡萄萄糖8.97 g/L,在此條件下ADD的產(chǎn)量預測值可達3.97 g/L。

2.5.3 驗證實驗 考慮到實際操作的便捷性,將響應面優(yōu)化結(jié)果校正為玉米漿23 g/L、硝酸鈉2.8 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、葡萄萄糖9 g/L,在此條件下進行3次平行實驗,得到的實際發(fā)酵96 h的ADD積累量達到最大值為(4.12±0.18) g/L,與預測值3.97 g/L的相對誤差為3.83%,說明該方程與實際轉(zhuǎn)化情況的擬合度較好,驗證了所建模型的正確性,并且與初始菌Mycobacteriumsp. ZFZ的0.21 g/L相比,ADD產(chǎn)量提高了近18倍,為提高甾體藥物雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮生產(chǎn)提供了一定的工業(yè)基礎。

3 結(jié)果與討論

本實驗通過在產(chǎn)AD的Mycobacteriumsp. ZFZ菌株體內(nèi)過表達高活性的3-甾酮-Δ1-脫氫酶，獲得一株直接降解植物甾醇產(chǎn)ADD的菌株Mycobacteriumsp. ZFZ321。通過單因素實驗確定了Mycobacteriumsp. ZFZ321發(fā)酵轉(zhuǎn)化甾醇生產(chǎn)ADD的培養(yǎng)基成分;在單因素實驗的基礎上利用響應面試驗設計,得到最優(yōu)培養(yǎng)基條件為玉米漿23 g/L、硝酸鈉2.8 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、葡萄糖9 g/L。在此條件下ADD產(chǎn)量為(4.12±0.18) g/L，接近理論預測值,說明該模型比較合理。通過培養(yǎng)基優(yōu)化,相比初始菌Mycobacteriumsp. ZFZ,ADD產(chǎn)量提高了近18倍，遠高于現(xiàn)有的研究水平[12]。

目前國內(nèi)外利用微生物直接降解生產(chǎn)ADD的研究仍較少,大多都是利用脫氫酶以AD為底物，脫氫得到ADD,而且產(chǎn)量也不高[22]。本研究直接利用能夠降解植物甾醇產(chǎn)AD的Mycobacteriumsp. ZFZ，體內(nèi)過表達3-甾酮-Δ1脫氫酶,使分枝桿菌降解甾醇的同時一步獲得ADD,減少了生產(chǎn)步驟,降低了成本。但發(fā)酵過程中，仍有部分底物沒有被微生物所利用而損失,而且實際ADD可能被菌體降解導致產(chǎn)量與理論值仍有差距,因此下一步工作可利用基因工程切斷ADD降解途徑,并尋找合適的分散劑增大甾醇與細菌的接觸，來進一步提高ADD的產(chǎn)量。