脈沖強光對大腸桿菌的滅活效果及其動力學(xué)模型的建立

洪 晨,潘忠禮,王 蓓,馬海樂,*,周存山

(1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 212013) (2.美國加州大學(xué)戴維斯分校生物與農(nóng)業(yè)工程系,美國戴維斯 95616) (3.美國農(nóng)業(yè)部西部研究中心,美國奧爾巴尼 94710)

大腸桿菌是腸道中的正常棲息菌,但一些具有特殊血清性的大腸桿菌如O157∶H7等卻具有病原性,常引起嘔吐、腹瀉、敗血癥等疾病[1],因此控制和殺滅大腸桿菌對提高食品的食用安全性具有重大意義,對于大腸桿菌的殺滅程度直接決定了一種滅菌方法是否能夠達(dá)到工業(yè)生產(chǎn)的要求。

脈沖強光技術(shù)是一種新型的殺菌技術(shù),它利用瞬時高壓脈沖能量產(chǎn)生的光熱效應(yīng)和光化效應(yīng)破壞菌體的結(jié)構(gòu)及其內(nèi)部遺傳物質(zhì),從而殺死食品中的微生物[2]。與傳統(tǒng)熱殺菌和化學(xué)殺菌相比,具有殺菌效率高、能耗低、易操作等優(yōu)點。目前國內(nèi)外大多數(shù)關(guān)于脈沖強光的研究集中于殺菌工藝優(yōu)化以及實際應(yīng)用探討[3-4],已有研究表明，影響脈沖強光滅活效果的因素有很多,如處理條件、介質(zhì)條件和微生物因素等,其中,以脈沖處理條件對滅活效果的影響最大[5]。而關(guān)于脈沖強光殺菌動力學(xué)的研究卻較少。

在眾多動力學(xué)模型中,Linear模型和Weibull模型的運用較為廣泛,分別用于線性模型和非線性模型的擬合。王蓓[6]發(fā)現(xiàn)，Weibull+Tail模型和Weibull模型較Linear模型對脈沖強光滅活黃曲霉菌的殺菌曲線擬合度較高。Chen等[7]用Linear、Weibull和log-logistic模型擬合超高壓對牛奶中食源性病菌的殺菌作用,證明Weibull和log-logistic模型較Linear模型擬合效果更好。目前,尚未見脈沖強光對大腸桿菌殺菌動力學(xué)相關(guān)方面的研究報道,本文將著重對此進(jìn)行研究,從而找到適合描述脈沖強光滅活大腸桿菌的動力學(xué)模型。本文以大腸桿菌為目標(biāo)微生物,研究微生物因素(不同生長期)、介質(zhì)因素(pH和溫度)對脈沖強光殺菌效果的影響,擬采用Linear模型和Weibull模型擬合脈沖強光殺菌曲線,獲得其殺菌特性,為脈沖強光在飲用水處理中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌ATCC 8739 美國農(nóng)業(yè)部西部研究中心;蛋白胨、牛肉浸出粉、氯化鈉、瓊脂粉、氫氧化鈉、鹽酸 美國Sigma-Aldrich公司。

SteriPule-XL? 3000實驗室規(guī)模脈沖強光殺菌系統(tǒng) 美國Xenon公司;NU-425-600型生物安全柜 美國NuAire股份有限公司;FFU20F3AWA型恒溫培養(yǎng)箱 美國Scientific Division Jouan股份有限公司;SR-24C型高壓滅菌鍋 美國Consolidated Stills & Sterilizers公司;PG2002-S型電子秤 美國Mettler-Toledo有限責(zé)任公司;5804R型高速離心機 美國Fisher Scientific公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌懸液的配制 取出斜面冷藏的大腸桿菌菌種,挑取一至三環(huán)接入已滅菌的營養(yǎng)肉湯(NB)培養(yǎng)基中,180 r/min、37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h,進(jìn)行活化。取活化后的大腸桿菌培養(yǎng)液1 mL，接入100 mL NB培養(yǎng)基中,180 r/min、37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，作為種子培養(yǎng)液。取1 mL種子培養(yǎng)液接種到裝有100 mL NB培養(yǎng)基的錐形瓶中(1%接種量),180 r/min、37 ℃振蕩培養(yǎng)一定時間后,離心(4000 r/min,10 min)取沉淀,用已滅菌的生理鹽水洗滌三次,最終重置于100 mL的無菌生理鹽水中,配成待處理的菌懸液。

1.2.2 脈沖強光處理 將直徑為95 mm的無菌平板至于脈沖強光殺菌室中央,向其中加入20 mL菌懸液,此時菌液厚度約為3 mm[8],進(jìn)行脈沖強光處理。以未經(jīng)脈沖強光處理的相同菌懸液為空白對照,每個實驗重復(fù)三次。脈沖強光設(shè)備參數(shù)設(shè)為:脈沖距離13 cm(0.35 J/cm2/pulse)、脈沖頻率4 pulses/s、脈沖時間1 s。在此條件下,選擇大腸桿菌不同生長期、菌液pH、菌液初始溫度作為影響因素,研究微生物因素和介質(zhì)因素對脈沖強光殺菌效果的影響。

1.2.3 單因素實驗參數(shù)設(shè)置 本試驗采用單因素逐級優(yōu)化的方法，來確定微生物因素和介質(zhì)因素對脈沖強光殺菌效果的影響,選取最優(yōu)條件為研究脈沖強光殺菌動力學(xué)建模做準(zhǔn)備,具體實驗條件如下。

1.2.3.1 大腸桿菌生長曲線的測定 分別取1 mL大腸桿菌種子培養(yǎng)液,接種到已編號的14個裝有100 mL NB培養(yǎng)基的錐形瓶中,180 r/min、37 ℃振蕩培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h時,取出大腸桿菌培養(yǎng)液，并以未接種的NB培養(yǎng)基作空白對照,在600 nm波長下進(jìn)行比濁測定,重復(fù)三次。對于濃度較大的培養(yǎng)液，需用培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋后測定,使其光密度值在0.1～0.65之間。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo),繪制生長曲線。

1.2.3.2 大腸桿菌不同生長時期對脈沖強光殺菌效果的影響 因為大腸桿菌培養(yǎng)到不同的生長時間其菌落濃度不一樣,經(jīng)測定延遲期為107cfu/mL,穩(wěn)定期為109cfu/mL。已有研究表明，大腸桿菌菌液濃度對脈沖強光殺菌效果有影響,殺菌效果會隨著菌液濃度的增大而逐漸減小[9]。為測定脈沖強光對不同生長時期大腸桿菌殺菌效果的影響,本實驗將培養(yǎng)到對數(shù)期和穩(wěn)定期制備的菌懸液統(tǒng)一稀釋到107cfu/mL進(jìn)行處理。在介質(zhì)溫度35 ℃,pH7.0條件下，對培養(yǎng)了1.5、4、6、8、10、12、14、16、18 h的大腸桿菌的菌懸液進(jìn)行殺菌實驗,研究大腸桿菌不同生長時期對脈沖強光殺菌效果的影響。大腸桿菌不同生長期參數(shù)設(shè)置:依據(jù)生長曲線的結(jié)果選取不同的培養(yǎng)時間。

1.2.3.3 pH對脈沖強光殺菌效果的影響 大腸桿菌培養(yǎng)6 h之后,將其配成不同pH的菌懸液,在菌液初始溫度35 ℃條件下利用脈沖強光對不同pH(4、5、6、7、8)的菌懸液進(jìn)行殺菌實驗,研究pH對脈沖強光殺菌效果的影響。pH參數(shù)設(shè)置:根據(jù)菌種自身可生長pH范圍并參考文獻(xiàn)[9]確定其參數(shù),采用1 mol/L的HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH。

1.2.3.4 溫度對脈沖強光殺菌效果的影響 大腸桿菌培養(yǎng)6 h之后,將其配成pH4.0的菌懸液,利用脈沖強光對不同初始溫度(5、15、25、35、45 ℃)的菌懸液進(jìn)行殺菌實驗,研究溫度對脈沖強光殺菌效果的影響。初始溫度參數(shù)設(shè)置:根據(jù)菌種自身可存活溫度范圍并參考文獻(xiàn)[10]確定其參數(shù),采取冰浴及恒溫箱冷卻和恒溫水浴鍋加熱的方式控制菌液溫度。

1.2.4 殺菌效果檢驗 菌落總數(shù)的測定按照GB 4789.2-2016[11]。對脈沖強光處理后的樣品立即進(jìn)行微生物計數(shù),吸取1 mL殺菌完成的菌液,按1∶10的比例進(jìn)行梯度稀釋,選取三個適合的稀釋梯度的菌液,用傾注法進(jìn)行平板接種,37 ℃下培養(yǎng)48 h進(jìn)行計數(shù)。殺菌效果采用殘存率的對數(shù)值lg(N/N0)表示,即為處理前后大腸桿菌降低的對數(shù)。

式(1)

其中:N0為脈沖強光處理前的初始大腸桿菌數(shù)量(cfu/mL);N為處理后的大腸桿菌數(shù)量(cfu/mL)。

1.2.5 脈沖強光殺菌動力學(xué)建模 在以上微生物因素和介質(zhì)因素確定的基礎(chǔ)上,本文分別研究了脈沖距離為13 cm(0.35 J/cm2/pulse)和17 cm(0.30 J/cm2/pulse)條件下脈沖強光的殺菌動力學(xué),采用Linear和Weibull模型來進(jìn)行殺菌動力學(xué)擬合[7]。

Linear數(shù)學(xué)模型為:

式(2)

式(3)

其中:D為指數(shù)遞減時間即殺滅90%的微生物所用的時間(s),t為脈沖強光處理時間(s),F為輻射通量(J/cm2),β為殺滅90%的微生物所需的輻射通量(J/cm2)。

式(4)

式(5)

其中:b為尺度參數(shù),n為形態(tài)參數(shù),t為脈沖強光處理時間(s),F為輻射通量(J/cm2)。當(dāng)n=1時,Weibull模型與Linear模型一致,此時一級動力學(xué)方程可以看成Weibull模型的特定形式。

F輻射通量與輻射強度和處理時間之間的關(guān)系為:

F=I×t

式(6)

其中:I為輻射強度(W/cm2),t為輻射處理時間(s)。

1.2.6 模型擬合度評價 采用Matlab R2014b軟件對Weibull模型進(jìn)行擬合,得到殺菌效果隨時間和輻射量變化的動力學(xué)方程,以均方根誤差RMSE、決定系數(shù)R2、精確因子Af和偏差因子Bf這四個參數(shù)來評判擬合度的優(yōu)劣[12]。計算公式如:

式(7)

式(8)

式(9)

其中:p為預(yù)測值,a為實際值,n為實驗次數(shù)。Af反映了預(yù)測值與實際值偏離的程度,其值越接近1,表明模型的預(yù)測值與實際值相差越小,模型越精確。當(dāng)Bf>1表示模型的預(yù)測值比實際值高,相反則表示模型預(yù)測值比實際值低,其值越接近1模型擬合度越高。決定系數(shù)R2和RMSE表示模型的精確度、可靠度,R2越接近于1,RMSE越小,模型擬合度越髙[13]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

本文中所有實驗均平行三次。所有數(shù)據(jù)均以平均(mean)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示。運用Microsoft Excel 2016軟件統(tǒng)計,采用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行顯著性差異分析(p<0.05)。模型擬合圖由Matlab軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌的生長曲線

大腸桿菌在NB培養(yǎng)基中的生長曲線如圖1所示。由圖1可知,大腸桿菌ATCC 8739的延遲生長期處于0～1.5 h,而1.5～14 h為對數(shù)生長期,培養(yǎng)14 h后進(jìn)入穩(wěn)定生長期,這為后續(xù)實驗中大腸桿菌不同生長時期參數(shù)的設(shè)置提供依據(jù)。

圖1 大腸桿菌在NB培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.1 Growth curve of E. coli in the nutrient broth medium

2.2 大腸桿菌不同生長時期對脈沖強光殺菌效果的影響

大腸桿菌不同生長期對脈沖強光殺菌效果的影響見圖2。如圖2所示,結(jié)果表明:大腸桿菌ATCC 8739在對數(shù)生長期的前期，比延遲生長期和穩(wěn)定生長期對脈沖強光更敏感,特別在大腸桿菌生長6 h時，對其滅活效果最好,這與王合利等[10]和Ortuno等[14]的研究結(jié)果類似。這可能是因為此時的大腸細(xì)菌形態(tài)、染色、生物活性都很典型,細(xì)菌以最大速率生長和分裂,代謝旺盛,當(dāng)受到外界環(huán)境因素干擾時,DNA復(fù)制容易出錯,此時作用效果才會較為明顯。因此,選取培養(yǎng)時間為6 h用來制備菌懸液,此時菌懸液濃度為109cfu/mL。

圖2 大腸桿菌不同生長期對脈沖強光殺菌效果的影響Fig.2 Effect of different growth phases on the log reduction of E. coli treated by pulsed light

2.3 pH對脈沖強光殺菌效果的影響

未經(jīng)脈沖強光作用時不同pH條件下大腸桿菌的初始菌落數(shù)如圖3所示。由圖3可知，不同pH環(huán)境下,任意兩組之間大腸桿菌的初始菌落數(shù)沒有顯著性差異(p>0.05)。因此,在后續(xù)實驗中可以排除pH本身對大腸桿菌死亡的影響,因為單純的酸堿性并不是造成大腸桿菌死亡的原因。這與張策[15]的結(jié)論類似。

圖3 未經(jīng)脈沖強光作用不同pH下大腸桿菌的初始菌落數(shù)Fig.3 Initial microbial count of E. coli at different pH untreated by pulsed light注:相同字母表示差異不顯著(p>0.05),不同字母表示差異顯著(p<0.05);圖5同。

pH對脈沖強光滅活大腸桿菌的影響如圖4所示。脈沖處理1 s后,與未經(jīng)脈沖強光處理的菌懸液相比,當(dāng)pH為4.0時,大腸桿菌降低了(3.61±0.05) lg cfu/mL;當(dāng)pH為5.0時,降低了(3.10±0.07) lg cfu/mL;當(dāng)pH為6.0時,降低了(2.89±0.01) lg cfu/mL;當(dāng)pH為7.0時,降低了(2.60±0.09) lg cfu/mL;當(dāng)pH為8.0時,降低了(3.24±0.15) lg cfu/mL。大腸桿菌在pH為7.0時，對脈沖強光的抗性最大,這可能是因為，pH7.0是大腸桿菌的最適生長pH,此時微生物生長速度最快,生存狀態(tài)最佳,導(dǎo)致強光作用后不易死亡。而在過酸(pH4.0～6.0)或過堿(pH8.0)環(huán)境中,脈沖強光的滅活作用增強,尤其是在酸性環(huán)境中,隨著pH的降低,大腸桿菌的殘留越來越少。

圖4 介質(zhì)pH對脈沖強光殺菌效果的影響Fig.4 Effect of pH on the germicidal efficacy of E. coli treated by pulsed light

2.4 溫度對脈沖強光殺菌效果的影響

在脈沖強光處理前,用不同溫度溫育菌懸液30 min。初始菌落數(shù)如圖5所示,可以發(fā)現(xiàn)不同溫度環(huán)境下,任意兩組之間大腸桿菌的初始菌落數(shù)沒有顯著性差異(p>0.05)。因此,后面的實驗中溫度本身對大腸桿菌的影響可以排除。

圖5 未經(jīng)脈沖強光作用不同溫度下大腸桿菌的初始菌落數(shù)Fig.5 Initial microbial count of E. coli at different temperature untreated by pulsed light

介質(zhì)溫度對脈沖強光滅活效果的影響見圖6。由圖6可知,介質(zhì)溫度在5～25 ℃時,脈沖強光對大腸桿菌的殺菌效果影響較小,處理1 s后,與未經(jīng)脈沖強光處理的菌懸液相比,大腸桿菌數(shù)量降低了3.30 lg cfu/mL左右。當(dāng)介質(zhì)溫度上升至35 ℃之后,殺菌效果較好且趨于平緩,與未經(jīng)脈沖強光處理的菌懸液相比,35、45 ℃條件下分別降低(3.72±0.19)、(3.87±0.11) lg cfu/mL,且沒有顯著性差異(p>0.05)?？紤]到能耗問題,選取35 ℃進(jìn)行后續(xù)試驗。35 ℃的溫度略低于大腸桿菌的最適生長溫度37 ℃,此時大腸桿菌較為敏感，容易被殺死。而在較低溫度下,殺菌效果較差,一方面可能由于微生物本身對不利生存環(huán)境的抗逆性,使它對脈沖強光的作用產(chǎn)生抵抗,另一方面可能與脈沖強光的殺菌機理有關(guān),光熱作用在低溫下并不能達(dá)到很好的效果。

圖6 介質(zhì)溫度對脈沖強光殺菌效果的影響Fig.6 Effect of temperature on the germicidal efficacy of E. coli treated by pulsed light

2.5 脈沖強光對大腸桿菌的殺菌動力學(xué)建模

2.5.1 以時間為變量的Linear模型和Weibull模型 在大腸桿菌培養(yǎng)6 h,菌液pH4.0,溫度35 ℃,脈沖強光距離13 cm(0.35 J/cm2/pulse),脈沖頻率4 pulses/s條件下處理1 s,大腸桿菌可以降低(3.72±0.19) lg cfu/mL。為擬合脈沖強光殺菌曲線,調(diào)整脈沖強光儀器參數(shù)為:脈沖頻率1 pulse/s。否則過高頻率下,大腸桿菌很快就死亡,無法深入探究脈沖強光殺菌動力學(xué)。在上述條件下,用Linear模型和Weibull模型擬合不同脈沖距離下大腸桿菌的失活曲線如圖7所示,并對不同距離條件下的模型參數(shù)進(jìn)行計算,見表1。從圖7可以看出,不同脈沖距離下脈沖強光對大腸桿菌的殺菌動力學(xué)模型一致,Weibull模型和Linear模型都能較好地擬合大腸桿菌失活曲線。隨著處理時間的增加,大腸桿菌殘存的活菌數(shù)逐漸減少。而且達(dá)到相同的殺菌效果時,近距離的處理方式比遠(yuǎn)距離的處理方式效率高。另外,表1列出了Linear模型和Weibull模型的參數(shù),包括D值、尺度因子、形狀因子和回歸參數(shù)等,可以發(fā)現(xiàn)Weibull模型較Linear模型可以更好地擬合了實驗數(shù)據(jù)(R2>0.997),體現(xiàn)了較高的精確性。

表1 不同距離下大腸桿菌的失活模型參數(shù)Table 1 Parameters of Linear and Weibull model for inactivation by PL under different distances

圖7 Linear和Weibull模型擬合大腸桿菌的脈沖強光輻射失活曲線Fig.7 PL inactivation curves of E. coli applying Linear and Weibull model

2.5.2 以輻射通量為變量的Linear和Weibull模型 為了簡化模型,以不同距離下處理不同時間所對應(yīng)的脈沖強光輻射量作為變量,將圖7中各曲線合并,把所有試驗點重新作圖就可以得到圖8,并計算出此時的模型參數(shù)如表2所示,可得到輻射通量與大腸桿菌失活量之間的關(guān)系式:

表2 大腸桿菌的失活模型參數(shù)Table 2 Parameters of Linear and Weibull model for inactivation by PL

式(10)

式(11)

此時Linear模型和Weibull模型仍能較好地擬合脈沖強光殺菌動力學(xué),但依舊是Weibull模型更為精確。從圖8還可以看出,在脈沖距離13 cm、脈沖時間6 s條件下和脈沖距離17 cm、脈沖時間7 s條件下,大腸桿菌分別降低了(4.56±0.08) lg cfu/mL和(4.56±0.10) lg cfu/mL,脈沖強光殺菌效果沒有顯著性差異(p>0.05),但此時輻射通量相同,都為2.10 J/cm2。因此可以發(fā)現(xiàn),在微生物因素、介質(zhì)因素等相同的條件下,決定脈沖強光殺菌效果的主要是輻射通量這一因素,輻射通量相同,脈沖強光殺菌效果就沒有顯著性差異。脈沖強光參數(shù)(如脈沖距離、脈沖時間)的變化引起的殺菌效果的改變,追根究底其實是樣品表面輻射通量的變化造成的,輻射通量可以通過脈沖強光參數(shù)進(jìn)行調(diào)節(jié)。

圖8 Linear和Weibull模型擬合大腸桿菌的脈沖強光輻射失活曲線Fig.8 PL inactivation curves of E. coli applying Linear and Weibull model

3 結(jié)論與討論

脈沖強光對大腸桿菌有著明顯的殺菌效果,處于不同生長期的大腸桿菌對脈沖強光的敏感性不同,在對數(shù)生長前期(培養(yǎng)6 h時)殺菌效果最好。菌液的pH和溫度對脈沖強光殺菌效果有一定的影響,在介質(zhì)溫度35～45 ℃,酸性(pH4.0～6.0)或者堿性(pH8.0)條件下,脈沖強光對大腸桿菌的殺菌效果具有較強促進(jìn)作用。

在大腸桿菌培養(yǎng)6 h,菌液pH4.0,溫度35 ℃,脈沖距離為13 cm(0.35 J/cm2/pulse)和17 cm(0.30 J/cm2/pulse),脈沖頻率1 pulse/s條件下,Linear模型和Weibull模型都能很好地擬合脈沖強光對大腸桿菌殺菌動力學(xué)(R2>0.99),且Weibull模型更為精確。Weibull模型靈活實用,對脈沖強光在飲用水中的應(yīng)用有一定的參考作用,簡單而精確的滅菌模型的建立有助于控制食品工業(yè)中微生物的安全性。

此外,本文還發(fā)現(xiàn)在微生物因素、介質(zhì)因素條件相同時,輻射通量對殺菌效果起決定性作用。輻射通量相同時,脈沖強光殺菌效果沒有顯著性差異。輻射通量是由脈沖強光各種參數(shù)如脈沖距離、脈沖時間等綜合作用的,在實際生產(chǎn)應(yīng)用中,需要同時考慮殺菌效果和成本,因此可合理地調(diào)節(jié)這些參數(shù)來增強脈沖強光殺菌效應(yīng),降低工業(yè)生產(chǎn)成本,如為了節(jié)約處理時間,可以減少燈管到樣品表面的距離,這對優(yōu)化食品工業(yè)中脈沖強光殺菌工藝具有重要的指導(dǎo)意義。