串珠鐮孢菌來(lái)源的角質(zhì)酶基因的克隆表達(dá)及其酶學(xué)性質(zhì)

陳志琳,林青君,王 鵬,葉秀云,李仁寬

(福州大學(xué)福建省海洋酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建福州 350116)

角質(zhì)層是控制植物與環(huán)境之間的屏障,它調(diào)節(jié)植物體溫、水分交換、抵御病菌侵害和防止機(jī)械損傷[1]。角質(zhì)是角質(zhì)層的主要成分,可被角質(zhì)酶高效降解;角質(zhì)是一種不溶性的生物聚合物,主要有脂類(lèi)單體組成,大部分存在于植物中[2]。不同物種角質(zhì)的成分并不相同,如在一些高等植物葉片表面區(qū)域中,角質(zhì)含量為20～600 μg/cm2,而在發(fā)育良好的某些果實(shí)表皮上,角質(zhì)的含量能達(dá)到1.5 mg/cm2[3]。

角質(zhì)酶是一種能降解角質(zhì)的酶,角質(zhì)酶來(lái)源很廣,存在于真菌和細(xì)菌等微生物中[4-5]。天然角質(zhì)酶主要有兩個(gè)來(lái)源途徑:一是真菌植物病原體霉菌,細(xì)菌以及放線菌;二是從花粉中分離純化得到[6-8]。角質(zhì)酶的分子量普遍較小[9],目前對(duì)真菌角質(zhì)酶的研究最多,其相對(duì)分子量一般較小,為20～25 kDa左右,最適酶活溫度一般為30～40 ℃,最適pH偏堿,通常為8～10。角質(zhì)酶在食品也有著廣泛的運(yùn)用,可用于奶牛脂肪的水解;水果外層角質(zhì)層降解加快脫水;可與蛋白酶復(fù)合使用去除煙草中的蛋白。目前國(guó)內(nèi)外研究對(duì)真菌角質(zhì)酶雖然得到了深入的研究,但仍存在基因工程異源表達(dá)時(shí)表達(dá)量較低和穩(wěn)定性較差的問(wèn)題,并且生產(chǎn)成本較高,至今為止沒(méi)有實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn),同時(shí)真菌角質(zhì)酶本身存在熱穩(wěn)定性差的缺點(diǎn),不能適合高溫處理環(huán)境,限制了角質(zhì)酶的開(kāi)發(fā)應(yīng)用[10]。

本文通過(guò)篩選酶活較高的角質(zhì)酶菌株,對(duì)該菌株進(jìn)行克隆表達(dá),并對(duì)其進(jìn)行分離純化和酶學(xué)性質(zhì)研究,為角質(zhì)酶的生產(chǎn)和應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

串珠鐮孢菌(FusariummoniliformeSheld)從福建地區(qū)采集土壤樣品篩選獲得；大腸桿菌(E.coliDH5α)、畢赤酵母菌株(P.pastorisGS115) Invitrogen 公司。pMD-18 T TAKARA公司;pPIC9K Invitrogen公司;限制性內(nèi)切酶(EcoR Ⅰ,NotⅠ)、T4 DNA 連接酶、DNA聚合酶 TaKaRa公司;MMLV第一鏈cDNA合成試劑盒,膠回收試劑盒,質(zhì)粒抽提試劑盒 Sangon Biotech公司;D-半乳糖 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;DNS試劑參照文獻(xiàn)[11]配制;Trizol試劑 Invitrogen公司。

T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;HWS24電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司;THZ-82恒溫振蕩器 國(guó)華企業(yè);BC/BD-320HCN臥式冷藏冷凍轉(zhuǎn)換柜 海爾集團(tuán);TP-114分析天平。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 LB 培養(yǎng)基:酵母膏5 g/L,蛋白胨10 g/L,NaCl 10 g/L,固體培養(yǎng)基再添加瓊脂20 g/L;

BMMY培養(yǎng)基:酵母粉:1.0 g,蛋白胨:2.0 g,YNB:1.34 g,0.1 mol/L磷酸緩沖液,甘油:1.0 mL,蒸餾水定容至100 mL,pH為7.0；

RD培養(yǎng)基:1 M山梨醇,2%葡萄糖,1.34% YNB,4×10-5%生物素,0.005%氨基酸;

YPD培養(yǎng)基:1% 酵母膏,2% 蛋白胨,2%葡萄糖,若制固體培養(yǎng)基,加入2%瓊脂。

1.2.2 高產(chǎn)角質(zhì)酶菌株的篩選 從福建地區(qū)采集土壤樣品,用無(wú)菌袋裝好,-20 ℃保藏備用,初篩[12-13]:取10 g土樣加入90 mL帶有小玻璃珠的無(wú)菌生理鹽水中,充分振蕩后用無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋。用移液槍分別吸取合適稀釋度的稀釋液0.1 mL涂布于篩選平板,于30 ℃培養(yǎng)數(shù)天,挑取單菌落進(jìn)行平板劃線分離純化。將單菌落接種到角質(zhì)酶篩選培養(yǎng)基上,30 ℃培養(yǎng)數(shù)天,觀察菌落周?chē)欠癯霈F(xiàn)水解透明圈,并記錄H/C值(透明圈直徑/菌落直徑)。

復(fù)篩[14-15]:將初篩得到的產(chǎn)角質(zhì)酶菌株接種于種子培養(yǎng)基(裝液量25 mL/100 mL)中,30 ℃,200 r/min培養(yǎng)12 h后,按1%(v/v)的接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基(裝液量50 mL/250 mL),30 ℃,200 r/min培養(yǎng),定期取樣測(cè)定發(fā)酵上清液酶活力。

采用細(xì)菌16S rDNA通用引物從菌株的基因組DNA中擴(kuò)增得到16S rDNA序列(PCR擴(kuò)增條件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,48 ℃ 30 s,72 ℃ 90 s,25個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min),將PCR擴(kuò)增得到的DNA片段在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳分離,用試劑盒回收純化DNA直接送測(cè)。測(cè)序結(jié)果通過(guò)在NCBI中進(jìn)行序列同源性比對(duì)分析,選取同源性較高的菌株利用Mega5.2構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[16-18]。

1.2.3 產(chǎn)角質(zhì)酶基因的克隆 按照Trizol試劑說(shuō)明書(shū),取串珠鐮孢菌50 mg用液氮進(jìn)行研磨,再加入0.5 mL的Trizol進(jìn)行研磨使得樣品裂解;加入0.2 mL的氯仿進(jìn)行RNA提取;提取物經(jīng)吸附柱進(jìn)行純化,最終獲得純的RNA。

參照第一鏈cDNA合成試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明將mRNA反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA。在20 μL體系中,加入1 μg總RNA、1μL Oligo dT18(500 μg/mL)和Rnase-free水,在70 ℃水浴溫育10 min后,立即置于冰浴冷卻;繼續(xù)向冷卻的管中加入4μL 5×Buffer、2 μL 0.1 M的DTT和1 μL 10 mmol/L的dNTPs,混勻后于42 ℃水浴保溫2 min;再加入1 μL(200 U)反轉(zhuǎn)錄酶,42 ℃繼續(xù)保溫50 min;最后,置于70 ℃水浴保溫15 min,滅活反轉(zhuǎn)錄酶,獲得第一鏈cDNA。

根據(jù)NCBI檢索獲得串珠鐮孢菌來(lái)源的角質(zhì)酶基因并進(jìn)行比對(duì),設(shè)計(jì)角質(zhì)酶基因的特異性引物。引物由上海生工合成。

上游引物1:ATGAAGTTCTCCATCATCTCTACTC

上游引物2:AAGGAATTCCTTCCCGCTGGTC AGGATG(下劃線為EcoR I酶切位點(diǎn))

下游引物3:AATTGCGGCCGCTCAAGCGGCTCC AGCAGCAT(下劃線為Not I酶切位點(diǎn))

以第一鏈cDNA為模板,用上游引物1和下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序如下:95 ℃,3 min;95 ℃,30 s,60 ℃,30 s,72 ℃,1 min,30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min。獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1,再以產(chǎn)物1為模板,用上游引物2和下游引物,按上述程序進(jìn)行擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物用1.2%的瓊膠糖電泳進(jìn)行檢測(cè),回收與理論大小相同的基因片段。將純化的目的基因進(jìn)行TA克隆,選取陽(yáng)性克隆子進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 角質(zhì)酶工程菌的構(gòu)建及其在畢赤酵母中的表達(dá) 將測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆子質(zhì)粒和pPIC9K質(zhì)粒分別用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ進(jìn)行雙酶切,回收目的基因和線性載體。用T4 DNA鏈接酶將角質(zhì)酶目的片段和pPIC9K進(jìn)行連接,獲得重組質(zhì)粒pPIC9K-Cut。用堿裂解法大量提取和純化pPIC9K-cut質(zhì)粒,并用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行37 ℃保溫,使質(zhì)粒單限制性內(nèi)切酶酶切線性化;參照畢赤酵母表達(dá)試劑盒操作說(shuō)明,線性化后的質(zhì)粒用電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入pichia pastoris GS115細(xì)胞中;涂布在RD培養(yǎng)基中,置于28 ℃培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)2～4 d。挑取平板上生長(zhǎng)出來(lái)的菌落于液體YPD培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)過(guò)夜,按1%比例將菌液轉(zhuǎn)入100 mL的小搖瓶,并將培養(yǎng)基替換成BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基,并用1%甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),誘導(dǎo)后收集表達(dá)上清,上清樣品用15% SDS-PAGE電泳檢測(cè)。挑遺囑表達(dá)量較高的菌株在最優(yōu)條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),每24 h取樣,樣品用于酶活力檢測(cè)和蛋白濃度測(cè)定。

蛋白濃度的定量:利用BCA 蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。

酶活力的測(cè)定:用連續(xù)分光光度計(jì)法,在30 ℃條件下,20 μL酶液加入980 μL 含50 mM對(duì)硝基苯丁酸脂(pNPB)、0.2%的Triton X-00、0.43 M的四氫呋喃,50 mmol/L的Tris-Hcl緩沖液中(pH8.0),在405 nm處,記錄對(duì)硝基酚的生成速率。酶活定義:在30 ℃和pH8.0條件下,每分鐘催化對(duì)硝基苯丁酸脂水解生成1 μmol對(duì)硝基酚的酶量即為一個(gè)酶活力單位。

1.2.5 重組角質(zhì)酶的分離純化 收集重組菌株發(fā)酵液上清100 mL,用55%硫酸銨進(jìn)行鹽析。10000×g,離10 min,去上清,取沉淀,用5 mL的25 mml/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行重懸。重懸后12000×g,離心15 min,取上清液用于下一步的純化。

將鹽析獲得的樣品用脫鹽柱HiTrapTMDesalting,替換成25 mmol/L pH7.4磷酸緩沖液。將脫鹽的收集樣品用高效離子交換色譜(CM)進(jìn)一步分離。分離純化的條件如下:用平衡液平衡柱子后進(jìn)行上樣,并用平衡沖平上樣柱,0～100%洗脫液梯度洗脫30 min,收集洗脫峰。平衡液:25 mmol/L pH7.4磷酸緩沖液;洗脫液:25 mmol/L pH7.4含1 mol/L NaCl的磷酸鹽緩沖液;流速為1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。

經(jīng)CM離子交換柱純化收集的樣品,用凝膠過(guò)濾注進(jìn)行進(jìn)一步分離純化,并把收集的樣品SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

1.2.6 重組角質(zhì)酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

1.2.6.1 最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性 在37 ℃條件下,測(cè)定重組角質(zhì)酶在不同pH5.0～11.0緩沖液體系中的酶活力:pH3.0～7.0的McIlvaine緩沖液(0.2 mol/L磷酸氫二鈉/0.1 mol/L檸檬酸),pH7.0～9.0的0.1 mol/L的Tris-HCl緩沖液,以及pH9.0～11.0的0.1 mol/L的Gly-NaOH緩沖液。以測(cè)定的最高酶活力為100%,計(jì)算不同pH下的相對(duì)酶活力,確定最適反應(yīng)pH。

將重組酶放在不同pH緩沖液中37 ℃水浴中保溫1 h,在最適反應(yīng)條件下測(cè)定酶活力。以未經(jīng)保溫的酶液為100%,計(jì)算各pH下的殘余酶活力,確定該酶的pH穩(wěn)定性。

1.2.6.2 最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性 在最適pH的條件下,測(cè)定酶液在不同溫度(20、30、40、45、50、55、60 ℃)下的酶活力,以測(cè)定的最高酶活力為100%,計(jì)算不同溫度下的相對(duì)酶活力,確定最適反應(yīng)溫度。

將酶液分別于不同溫度水浴中保溫,并在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)取樣,測(cè)定該酶在最適反應(yīng)條件下的酶活力。將未處理的酶液作為100%對(duì)照,計(jì)算各溫度條件下重組酶的殘余酶活力,確定該酶的溫度穩(wěn)定性。

1.2.6.3 金屬離子和表面活性劑及抑制劑對(duì)角質(zhì)酶活性的影響 在重組酶的最適反應(yīng)條件下,在酶促反應(yīng)體系中分別加入9種金屬離子及5種表面活性劑及抑制劑(終濃度分別為10 mmol/L),包括:NaCl、KCl、MgSO4、BaCl2、CuSO4、FeSO4、ZnSO4、MnCl2、NiCl2,測(cè)定酶活力,以同樣條件下未加金屬離子和表面活性劑,抑制劑的酶促反應(yīng)作為對(duì)照組,分析不同金屬離子及表面活性劑及抑制劑對(duì)重組酶活性的影響。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)中每個(gè)處理重復(fù)3次,采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的顯著性分析,應(yīng)用Origin 7.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)角質(zhì)酶菌株的篩選

由表1可見(jiàn),10株能產(chǎn)生透明圈的細(xì)菌中有4株菌具有角質(zhì)酶活力,其中菌株K35酶活力最高,選取菌株K35進(jìn)行菌種鑒定、酶學(xué)性質(zhì)研究。

表1 產(chǎn)角質(zhì)酶菌株的篩選結(jié)果Table 1 Screening of strains producing cutinase

2.2 串珠鐮孢菌角質(zhì)酶基因的克隆

提取串珠鐮孢菌RNA,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到第一鏈cDNA,以cDNA為模板,用角質(zhì)酶特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖電泳檢測(cè),從圖1中可以看到,一條清晰的、大小約為700 bp的特異性條帶,角質(zhì)酶基因的理論大小為693 bp左右,電泳圖與理論值相近,初步確定為所需的目的條帶。基因測(cè)序結(jié)果(圖2)表明,該基因全長(zhǎng)693 bp,編碼231個(gè)氨基酸的成熟蛋白,經(jīng)NCBI序列比對(duì)可確定為來(lái)源于串珠鐮孢菌(FusariummoniliformeSheld)的角質(zhì)酶蛋白。

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 PCR product in cutinase gel

圖2 角質(zhì)酶基因核酸序Fig.2 Nucleic acid sequence of cutinase gene

2.3 重組角質(zhì)酶的構(gòu)建與表達(dá)

所獲得的角質(zhì)酶基因,經(jīng)過(guò)酶切、連接和鑒定獲得重組質(zhì)粒,重組質(zhì)粒被轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。搖瓶誘導(dǎo)篩選的表達(dá)上清經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè),在20.1 kDa附近有一表達(dá)條帶,這與角質(zhì)酶蛋白的理論大小21 kDa相近。一株高表達(dá)量的角質(zhì)酶重組菌株用1%甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),在表達(dá)過(guò)程中收集樣品用于酶活測(cè)定和蛋白含量測(cè)定,表明在甲醇誘導(dǎo)96 h時(shí),角質(zhì)酶的活性為71.68 U/mL,蛋白表達(dá)量達(dá)到0.25 mg/mL。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是一個(gè)高效、穩(wěn)定的表達(dá)系統(tǒng),可以實(shí)現(xiàn)蛋白的分泌表達(dá),易于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。角質(zhì)酶基因在畢赤酵母中GS115實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá),這將解決角質(zhì)酶工業(yè)化應(yīng)用中產(chǎn)量不足的問(wèn)題。

2.4 重組角質(zhì)酶的分離純化

表達(dá)的重組角質(zhì)酶發(fā)酵液,經(jīng)過(guò)硫酸銨沉淀、脫鹽、離子交換色譜和分子篩純化,圖3為純化過(guò)程中收集樣品的SDS-PAGE電泳檢測(cè)圖譜,可見(jiàn)最終獲得了電泳純的重組角質(zhì)酶蛋白,其大小約為20 kDa。表2為重組角質(zhì)酶純化過(guò)程,重組角質(zhì)酶發(fā)酵液的比活力為286.6 U/mg,經(jīng)過(guò)純化得到比活為2490.1 U/mg的純蛋白,純化倍數(shù)為8.69。由畢赤酵母表達(dá)所得到的重組角質(zhì)酶,易于分離純化,步驟簡(jiǎn)單,能夠獲得高純度的角質(zhì)酶蛋白。

圖3 重組角質(zhì)酶rAgaLJ-2 SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analyses of recombinant cutinase注:1:粗酶液;2:脫鹽;3:穿透峰;4～8:洗脫樣品。

表2 角質(zhì)酶純化表Table 2 Cutinase purification table

2.5 重組角質(zhì)酶的酶學(xué)特性

2.5.1 最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性 酶的活力受到所處緩沖體系pH的影響,過(guò)酸或過(guò)堿都會(huì)破壞酶的空間構(gòu)象,以及有關(guān)基團(tuán)的解離,影響酶活部位的構(gòu)象,導(dǎo)致酶活的喪失;同時(shí)pH也影響底物的解離狀態(tài),使底物和酶無(wú)法結(jié)合或催化,導(dǎo)致酶活力低。不同的緩沖體系中測(cè)定重組酶的酶活結(jié)果,由圖4可知,pH范圍在5.0～9.0之間重組角質(zhì)酶的酶活相對(duì)穩(wěn)定;圖5可知,重組酶的最適反應(yīng)pH為9.0。

圖4 重組角質(zhì)酶的pH穩(wěn)定性Fig.4 pH stability of recombinant cutinase

圖5 重組角質(zhì)酶的最適pHFig.5 Optimal pH of recombinant cutinase

2.5.2 最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性 酶的反應(yīng)在某一低溫范圍內(nèi),反應(yīng)速率隨溫度升高而增大。目前大部分的真菌角質(zhì)酶的最適反應(yīng)溫度也在32～40 ℃之間。從圖6可以看出,重組角質(zhì)酶在20～35 ℃之間隨著溫度升高,相對(duì)酶活也逐漸升高,從35～50 ℃之間隨著溫度升高,相對(duì)酶活逐漸降低,當(dāng)溫度高于50 ℃時(shí),酶活快要降到0,重組角質(zhì)酶的最適反應(yīng)溫度為35 ℃。從圖7中可知,重組酶在40 ℃穩(wěn)定性好,保溫一個(gè)小時(shí)65%以上的酶活,45 ℃保溫1 h能保持40%左右的活性,55 ℃保溫30 min能保持20%左右的活性。

圖6 重組角質(zhì)酶的最適反應(yīng)溫度Fig.6 Optimal temperature of recombinant cutinase

圖7 重組角質(zhì)酶的熱穩(wěn)定性Fig.7 Temperature stability of recombinant cutinase

2.5.3 金屬離子和表面活性劑及抑制劑對(duì)角質(zhì)酶活性的影響 不同金屬離子及表面活性劑及抑制劑會(huì)破壞角質(zhì)酶結(jié)構(gòu)進(jìn)而影響角質(zhì)酶活力。不同金屬離子及表面活性劑及抑制劑對(duì)重組酶活力的影響如表3所示:KCl、Triton X-100、MnCl2、SDS對(duì)該酶活有促進(jìn)作用,NaCl、BaCl2、CuSO4、Tween-20、FeSO4、ZnSO4、NiCl2、EDTA、Tween-80對(duì)該酶活有抑制作用。

表3 金屬離子和表面活性劑及抑制劑對(duì)角質(zhì)酶酶活的影響(%)Table 3 Effects of metal ions,surfactants and inhibitors on the activity of cutinase(%)

3 結(jié)論

角質(zhì)酶在工業(yè)上具有廣泛的應(yīng)用前景,如在除草劑中加入角質(zhì)酶,能提高除草劑的效果;在洗衣液中加入角質(zhì)酶,能提高洗液的去污能力等[19]。本文通過(guò)大通量的篩選,獲取產(chǎn)角質(zhì)酶的菌株,選取其中酶活力較高的菌株進(jìn)行種屬鑒定,通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察以及16S/18S rDNA序列分析,確定該菌株的種屬為Fusariummoniliforme。再通過(guò)克隆角質(zhì)酶基因,運(yùn)用pPIC9K質(zhì)粒及選取畢赤酵母工程菌,成功構(gòu)建重組角質(zhì)酶。重組后的工程菌純化的酶學(xué)性質(zhì)研究表明:其最適反應(yīng)pH為9.0,在pH5.0～9.0范圍內(nèi)重組角質(zhì)酶的酶活相對(duì)穩(wěn)定;最適反應(yīng)溫度為35 ℃,溫度低于40 ℃時(shí)重組角質(zhì)酶的酶活相對(duì)穩(wěn)定,比活為2490.1 U/mg,純化倍數(shù)為8.70;KCl、Triton X-100、MnCl2、SDS對(duì)該酶活有促進(jìn)作用,NaCl、BaCl2、CuSO4、Tween-20、FeSO4、ZnSO4、NiCl2、EDTA、Tween-80對(duì)該酶活有抑制作用。據(jù)報(bào)道,陳晟[20]等一種嗜熱細(xì)菌的研究中純化后的比活為400.75 U/mg,純化倍數(shù)為8.11;麻瑩等[21]在桃褐腐菌角質(zhì)酶的克隆與表達(dá)中純化后的比活為102.00 U/mg。目前報(bào)道的角質(zhì)酶只有少數(shù)比活能達(dá)到2000 U/mg,說(shuō)明在畢赤酵母表達(dá)純化方面有了較大的提高,具有良好的開(kāi)發(fā)價(jià)值。