關(guān)鍵環(huán)境因子對螺旋藻營養(yǎng)元素生物積累及有機(jī)化程度的影響

呂冰心,徐青艷,常 蓉,顏志秀,李博生

(北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程系,林業(yè)食品加工與安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京林業(yè)大學(xué)螺旋藻研究所,北京 100083)

螺旋藻(Spirulinaplatensis)是一種絲狀藍(lán)藻,其營養(yǎng)物質(zhì)豐富,作為食物具有悠久的歷史[1]。螺旋藻中蛋白質(zhì)約占60%～70%,且含有豐富的碳水化合物、β-胡蘿卜素及礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì),因而被世界衛(wèi)生組織(WHO)譽(yù)為“人類21世紀(jì)的最佳保健品”[2]。工業(yè)化生產(chǎn)的螺旋藻,已廣泛應(yīng)用于食品保健、醫(yī)藥、化妝品和水產(chǎn)飼料等行業(yè)中[3-5]。

近年來,礦物質(zhì)元素缺乏成為大家普遍關(guān)注的問題。根據(jù)第三次全國營養(yǎng)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示,我國人民的鈣攝入水平只達(dá)到適宜攝入量(Adequate intakes,AI)的20%～50%,硒攝入量僅達(dá)到世界衛(wèi)生組織推薦最低標(biāo)準(zhǔn)的72%,而缺鐵性貧血率仍平均為20%左右,而在中國少年兒童中,缺鋅率高達(dá)60%[6]。已有大量的研究表明螺旋藻能夠通過大分子的吸附作用、與蛋白質(zhì)和脂類等大分子結(jié)合作用以及螯合等不同的方式對不同的金屬離子進(jìn)行有效的富集而極易被人體消化吸收,轉(zhuǎn)化利用率較高[7-10]。因此,利用螺旋藻的優(yōu)勢開發(fā)礦質(zhì)元素高富集產(chǎn)品及相應(yīng)的食品添加將對改善我國人民礦物質(zhì)元素缺乏及螺旋藻產(chǎn)業(yè)化開發(fā)有重要意義及深遠(yuǎn)影響。在實(shí)際生產(chǎn)過程中,環(huán)境因子(溫度、光照、pH)對螺旋藻生長量及其對礦物質(zhì)富集作用具有重要的影響[11-13]。因此,本項(xiàng)研究突破了只通過增加螺旋藻外源培養(yǎng)液離子濃度達(dá)到細(xì)胞積累礦物質(zhì)營養(yǎng)元素的方法,探討通過調(diào)控主要環(huán)境因子(光照、溫度、pH)的交互作用對其生長和元素積累的影響,同時(shí)配合外源離子濃度雙重調(diào)控作用。在獲得螺旋藻較高生物量的同時(shí),達(dá)到螺旋藻最大化富集礦物質(zhì)營養(yǎng)的目的,從而獲得不同礦物質(zhì)營養(yǎng)元素的高富集螺旋藻。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鈍頂螺旋藻 北京林業(yè)大學(xué)螺旋藻研究所。培養(yǎng)液為Zarrouk(簡稱為Z氏)培養(yǎng)液,成分如表1,表2;硫酸銨、十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉、碳酸鈣、亞硒酸鈉、七水合硫酸亞鐵、硫酸鋅、冰醋酸等均為分析純 西隴化工股份有限公司。

表1 Zarrouk培養(yǎng)液組成成分Table 1 Compositions of Zarrouk medium

表2 Zarrouk微量元素溶液組成成分Table 2 Compositions of the microelement of Zarrouk medium

721型紫外-可見分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司;FD-I冷凍干燥機(jī) 北京德天佑科技發(fā)展有限公司;人工氣候室 德國;ICPS-7000等離子體原子發(fā)射分光光度計(jì) 北京華科易通分析儀器有限公司;900Z原子吸收光譜儀、Optima700電感耦合等離子光譜發(fā)生儀 美國PE 公司;GTR10-1冷凍離心機(jī) 北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司;XO-1000D超聲波細(xì)胞破碎儀 南京先歐儀器制造有限公司;WSJB-04電磁攪拌器 河南中良科學(xué)儀器有限公司;DK-SD電熱恒溫水浴鍋 江蘇金怡儀器科技有限公司;KDN-12C控溫消煮爐 上海企戈實(shí)業(yè)有限公司;MD1470透析袋(8000～14000 Da) 上海源葉生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 螺旋藻接種及培養(yǎng)方法 選擇對數(shù)生長期的螺旋藻,在Z氏培養(yǎng)液中培養(yǎng),光暗比為12∶12。用紗布過濾除去死藻及結(jié)塊的藻,取濾液,用300目生物網(wǎng)再次過濾,藻細(xì)胞用Z氏培養(yǎng)液沖洗三次后收集濾干。接種于500 mL錐形瓶中,接種量為OD560=0.3,每瓶加入300 mL Z氏培養(yǎng)液,置于恒溫?fù)u床培養(yǎng)(溫度30 ℃,轉(zhuǎn)速120 r/min)。在一定溫度、光照、pH條件下培養(yǎng)7 d后收獲,用300目生物網(wǎng)過濾,過濾得到的藻細(xì)胞用蒸餾水清洗至pH=7后置于冷凍干燥機(jī)(溫度-76 ℃,時(shí)間24 h)中凍干,得螺旋藻干粉。

1.2.2 螺旋藻生長速率測定 將螺旋藻培養(yǎng)液充分搖勻,用紫外可見分光光度計(jì),在波長為560 nm處測定藻液吸光度值,每天進(jìn)行測定,平行三次,連續(xù)測7 d。螺旋藻生長速率公式如下:

式(1)

式中,K為生長速率,N表示培養(yǎng)t天的OD560值,N0表示初始OD560,t為培養(yǎng)天數(shù),d[14]。

1.2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 鈍頂螺旋藻的最適生長范圍為溫度20～40 ℃、光照4～12 kLux、pH在8.5～10.5[7,17]。本實(shí)驗(yàn)對溫度、光照和pH三個(gè)環(huán)境因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)后進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn),探究外界環(huán)境對螺旋藻生長及幾種營養(yǎng)元素積累的交叉作用。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表如下:

表3 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表L9(34)Table 3 Orthogonal experimental factors and levels L9(34)

1.2.4 螺旋藻礦物質(zhì)營養(yǎng)元素積累隨時(shí)間變化規(guī)律 以Z氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ),在最佳生長量條件:光照12 kLux,溫度30 ℃,pH9.5培養(yǎng)3 d達(dá)到對數(shù)生長期后,第4 d調(diào)整環(huán)境條件,同時(shí)在培養(yǎng)液中加入CaCO30.6 g/L、FeSO4·7H2O 40 mg/L、ZnSO4·7H2O 40 mg/L、Na2SeO3100 mg/L[7,17-19],以Z氏培養(yǎng)液為對照,每組設(shè)置三個(gè)平行,連續(xù)培養(yǎng),每天對生長量進(jìn)行測定,其中鈣富集培養(yǎng)條件為:溫度20 ℃,光照12 kLux,pH8.5;鐵富集培養(yǎng)條件為:溫度30 ℃,光照4 kLux,pH10.5;鋅富集培養(yǎng)條件為:溫度30 ℃,光照8 kLux,pH8.5;硒富集培養(yǎng)條件同對照。分別在第3、5、7、9 d(鈣)結(jié)束時(shí)取樣,收集各條件下富營養(yǎng)元素的藻細(xì)胞,凍干(溫度-76 ℃,時(shí)間24 h),測定其中微量元素含量。

1.2.5 富礦物質(zhì)元素螺旋藻樣品收集

1.2.5.1 富鈣螺旋藻樣品收集 富鈣螺旋藻培養(yǎng)一定天數(shù)后,用300生物網(wǎng)過濾得到藻細(xì)胞,用0.1 mol/L醋酸沖洗數(shù)次,再用蒸餾水沖洗至pH為7[20]。收獲,凍干(溫度-76 ℃,時(shí)間24 h),測定螺旋藻細(xì)胞內(nèi)鈣元素含量。

1.2.5.2 富鐵、富鋅、富硒螺旋藻樣品收集 富鐵、鋅、硒螺旋藻培養(yǎng)一定天數(shù)后,用300目生物網(wǎng)過濾得到藻細(xì)胞,用蒸餾水清洗至pH為7,收獲,凍干(溫度-76 ℃,時(shí)間24 h),測定螺旋藻細(xì)胞內(nèi)鐵、鋅、硒元素含量。

1.2.6 螺旋藻礦物質(zhì)含量測定 稱取0.2 g培養(yǎng)后收集的藻粉,加入混酸HNO3∶HClO4(5∶1)30 mL,錐形瓶頂部蓋漏斗,輕輕緩慢搖勻之后在控溫消煮爐上進(jìn)行消化,隨著消解作用加強(qiáng),錐形瓶內(nèi)產(chǎn)生黃煙,待黃煙散盡瓶內(nèi)出現(xiàn)白色煙霧裝氣體,消化結(jié)束。冷卻后過濾,用去離子水定容至100 mL,待測。其中鈣元素含量測定需要從定容后的100 mL樣液中取2 mL,加入1 mL硝酸鑭,定容至50 mL,待測。鈣元素、鐵元素、鋅元素采用原子吸收光譜儀測定[21];硒元素采用電感耦合等離子光譜發(fā)生儀測定[22]。

1.2.7 有機(jī)化程度測定

1.2.7.1 螺旋藻藻粉總礦物元素含量測定 螺旋藻藻粉總礦物元素含量測定方法同1.2.6。

1.2.7.2 螺旋藻藻粉無機(jī)化礦物元素測定 稱取0.2 g培養(yǎng)后收集的藻粉,用離子水混合均勻后在超聲破碎儀上破碎30×5 s(間歇5 s),取上清液在4 ℃冷凍離心,離心條件為:8000 r/min、15 min,收集上清液過濾,定容至10 mL,用原子吸收光譜儀檢測鐵、鋅元素含量,硒元素含量用電感耦合等離子光譜發(fā)生儀檢測。鈣元素含量測定需要從定容后的100 mL樣液取2 mL,加入1 mL硝酸鑭,定容至50 mL,用原子吸收光譜儀進(jìn)行測定。

1.2.7.3 螺旋藻藻粉有機(jī)化程度 藻粉內(nèi)各元素與螺旋藻細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的有機(jī)化結(jié)合量用總量與無機(jī)含量之差表示:

式(2)

式中:M1為藻粉總礦物質(zhì)元素含量;M2為藻粉無機(jī)化總礦物質(zhì)元素含量。

1.2.8 螺旋藻蛋白質(zhì)提取及礦物質(zhì)含量測定 稱取一定量富礦物質(zhì)螺旋藻粉,加入蒸餾水混合(過0.45 μm水系微濾膜)以1∶20比例配制成懸浮液,置于4 ℃條件下浸泡過夜。將浸泡后的懸浮液置于-18 ℃的冰箱中反復(fù)凍融三次,然后在400 W功率下進(jìn)行超聲破碎15×3 s(停3 s)后,置于4 ℃冷凍離心,離心條件為:8000 r/min、15 min。用50%的飽和硫酸銨對離心后的上清液進(jìn)行鹽析,鹽析后冷凍離心,離心條件為:4 ℃、6000 r/min、20 min,收集沉淀;用濃度為0.005 mol/L,pH6.86的PBS溶液溶解沉淀后裝于8000～14000 Da透析袋中冷藏透析,透析終點(diǎn)用氯化鋇進(jìn)行檢測[23]。脫鹽后用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥(溫度-76 ℃,時(shí)間24 h),得富礦物質(zhì)螺旋藻粗蛋白,分別用原子吸收光譜儀和電感耦合等離子光譜發(fā)生儀對鈣、鐵、鋅、硒元素含量進(jìn)行檢測。

1.2.9 螺旋藻蛋白質(zhì)含量測定 凱氏定氮法(GB5009.5-2010)。

1.2.10 紅外光譜分析 采用溴化鉀壓片法將富礦物質(zhì)螺旋藻樣品進(jìn)行處理,經(jīng)過紅外掃描得到紅外吸收光譜圖[24]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 24.0軟件及Excel 2010進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度、光照、pH對螺旋藻生長及營養(yǎng)元素積累的影響

2.1.1 吸光度值與生物量之間的關(guān)系曲線 表示螺旋藻生長量的方法通常有兩種,一種為連續(xù)測定螺旋藻的OD560值,另一種是測定螺旋藻細(xì)胞的干重,通過實(shí)驗(yàn)探究兩者之間的關(guān)系,觀察其在螺旋藻生物量表達(dá)上是否呈現(xiàn)一致性[25],其結(jié)果如圖1所示。

圖1 鈍頂螺旋藻生物量干重與OD560相關(guān)性Fig.1 Relationship between Spirulina platensis dry cell weight and OD560

由圖1知,在一定范圍內(nèi),鈍頂螺旋藻細(xì)胞干重與其OD560值之間具有較好的線性關(guān)系。回歸方程y=0.5126x-0.0413,其中x為560 nm處OD值,Y為凍干后的螺旋藻細(xì)胞干重,相關(guān)系數(shù)R2=0.9954。因此可用OD560表示螺旋藻生物量變化規(guī)律,并可根據(jù)回歸方程公式進(jìn)行互換。

2.1.2 溫度、光照、pH對螺旋藻生長速率及鈣、鐵、鋅元素積累的影響 由表4中k值分析可知,鈍頂螺旋藻最佳生長速率條件為:A2B3C2,即溫度30 ℃,光照12 kLux,pH9.5。由極差分析可以看出:RB>RA>RC,三個(gè)主要環(huán)境因素對鈍頂螺旋藻生長速率的影響依次是:光照>溫度>pH,即光照對螺旋藻生長量影響最大。

表4 生長速率及鈣、鐵、鋅積累正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與極差分析Table 4 Orthogonal experiment and range analysis of growth rate,calcium,iron and zinc accumulation

由表4中極差分析可見,有利于鈣積累的最佳環(huán)境條件為A1B3C1,即溫度20 ℃,光照12 kLux,pH8.5。影響鈣元素積累的環(huán)境因素主次順序?yàn)?RA>RB>RC,即溫度>光照>pH,溫度對鈍頂螺旋藻鈣積累影響最大。有利于鐵積總累的最佳環(huán)境條件為A2B1C3,即溫度30 ℃,光照4 kLux,pH10.5。由極差分析可知,三個(gè)環(huán)境因素對螺旋藻鐵富集的影響主次順序?yàn)?RB>RC>RA,即光照>pH>溫度,光照對鐵積累影響最大。有利于鋅積總累的最佳環(huán)境條件為A2B2C1,即溫度30 ℃,光照8 kLux,pH8.5。由極差分析可知,三個(gè)環(huán)境因素對螺旋藻鐵富集的影響主次順序?yàn)?RC>RA>RB,即pH>溫度>光照,pH對鋅積累影響最大。

2.2 外源礦物質(zhì)添加對螺旋藻生長及其積累的影響

2.2.1 鈣對螺旋藻生長及其積累的影響

2.2.1.1 不同鈣富集時(shí)間對鈍頂螺旋藻生長的影響 不同鈣富集時(shí)間對鈍頂螺旋藻生長的影響如圖2所示。

圖2 鈣富集時(shí)間對螺旋藻生長的影響Fig.2 Effect of different calcium accumulation time on the growth of Spirulina

由圖2可見,對照組與實(shí)驗(yàn)組螺旋藻生長量隨時(shí)間延長均呈線性增加關(guān)系。在生長前期和中期實(shí)驗(yàn)組與對照組生長量差異(p<0.05)不明顯,生長末期從第7 d開始實(shí)驗(yàn)組相對生長量略低于對照組,至培養(yǎng)周期結(jié)束第9 d收獲時(shí),實(shí)驗(yàn)組生長量相比于對照組降低了2.5%。

2.2.1.2 螺旋藻富集鈣元素含量隨培養(yǎng)時(shí)間變化規(guī)律 通過上述實(shí)驗(yàn)獲得富鈣螺旋藻,分別于初始、第3、5、7、9 d進(jìn)行鈣元素含量及有機(jī)化測定,其結(jié)果如圖3所示。

圖3 螺旋藻培養(yǎng)過程中鈣元素含量及有機(jī)化程度變化Fig.3 Calcium accumulation and organic level during Spirulina’s culturing

由圖3可見,在整個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi),鈍頂螺旋藻鈣元素富集總量呈上升趨勢,第5 d比第3 d鈣含量增加了1.24倍,第7 d比第5 d鈣含量增加了2.23倍,在培養(yǎng)的第9 d達(dá)到最大值18.62 mg/g。螺旋藻鈣元素有機(jī)化程度呈先上升后平穩(wěn)的趨勢,在第7 d時(shí),達(dá)到最大有機(jī)化程度84.17%。由于螺旋藻鈣元素富集最佳培養(yǎng)周期為7 d,在最有利于鈣富集條件下,螺旋藻生長所受影響較小。因此,第7 d作為螺旋藻鈣元素富集最佳采收時(shí)間,此時(shí)細(xì)胞內(nèi)鈣有機(jī)化程度達(dá)為84.17%,鈣含量為18.21 mg/g。

2.2.2 鐵對螺旋藻生長及其積累的影響

2.2.2.1 不同鐵富集時(shí)間對鈍頂螺旋藻生長的影響 不同鐵富集時(shí)間對鈍頂螺旋藻生長的影響見圖4。

圖4 鐵富集時(shí)間對螺旋藻生長的影響Fig.4 Effect of different iron accumulation time on the growth of Spirulina

由圖4可見,在整個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi),實(shí)驗(yàn)組螺旋藻生長速率低于對照組,鐵富集條件對螺旋藻生長產(chǎn)生一定影響。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中,在第3、5、7 d時(shí),實(shí)驗(yàn)組相比于對照組光密度下降百分比分別為:11.96%、15.55%、17.92%,隨時(shí)間延長,實(shí)驗(yàn)組生長量比對照組生長量降低幅度呈增加趨勢。

2.2.2.2 鈍頂螺旋藻富集鐵元素含量隨時(shí)間變化規(guī)律 通過上述實(shí)驗(yàn)獲得富鐵螺旋藻,分別于第3、5、7 d,收獲螺旋藻細(xì)胞,凍干后進(jìn)行鐵元素含量及有機(jī)化測定,鈍頂螺旋藻鐵總含量及有機(jī)化程度隨培養(yǎng)時(shí)間變化規(guī)律見圖5。

圖5 鈍頂螺旋藻富集鐵元素含量隨時(shí)間變化規(guī)律Fig.5 Iron accumulation and organic level during Spirulina’s culturing

由圖5可知,螺旋藻鐵的富集總量隨時(shí)間延長呈先上升后下降,在生長周期末期又回升的現(xiàn)象,螺旋藻鐵的有機(jī)化程度在這個(gè)培養(yǎng)期內(nèi)均在80%以上。螺旋藻鐵積累量第3 d比初始值增加了59%,達(dá)到最高值1634 ppm,此時(shí)有機(jī)化程度為89.98%。而到達(dá)第5 d時(shí),螺旋藻鐵有機(jī)化程度比第3 d增加0.12%，但由于部分二價(jià)鐵離子被氧化成為三價(jià)鐵,生成磚紅色氫氧化鐵不溶性沉淀,使得鐵總含量卻降低了15.24%。

因此,鈍頂螺旋藻鐵元素最佳培養(yǎng)周期為3 d,此時(shí)螺旋藻生長所受影響較小,鐵元素富集量最多,含量為1634 ppm,螺旋藻鐵的有機(jī)化程度為89.98%,維持較高水平。

2.2.3 鋅對螺旋藻生長及其積累的影響

2.2.3.1 不同鋅富集時(shí)間對鈍頂螺旋藻生長的影響 不同鋅富集時(shí)間對鈍頂螺旋藻生長的影響生長曲線見圖6。

圖6 鋅富集時(shí)間對螺旋藻生長的影響Fig.6 Effect of different Zinc accumulation time on the growth of Spirulina

由圖6可見,在整個(gè)培養(yǎng)期內(nèi),實(shí)驗(yàn)組與對照組螺旋藻均成穩(wěn)定增長的趨勢,對照組光密度值略大于實(shí)驗(yàn)組,但兩者之間生長速率差異不大,實(shí)驗(yàn)組比對照組生長速率平均降低4.2%。最佳鋅富集條件下,螺旋藻生長未受到顯著(p<0.05)影響。

2.2.3.2 鈍頂螺旋藻富集鋅元素含量隨時(shí)間變化規(guī)律 上述實(shí)驗(yàn)中,分別于第3、5、7 d,收獲螺旋藻細(xì)胞,凍干后進(jìn)行鋅元素含量及有機(jī)化測定,其結(jié)果見圖7。

圖7 鈍頂螺旋藻富集鋅元素含量隨時(shí)間變化規(guī)律Fig.7 Zinc accumulation and organic level during Spirulina’s culturing

由圖7可見,螺旋藻鋅含量呈逐漸上升趨勢,在培養(yǎng)周期的第3 d,鈍頂螺旋藻鋅元素有機(jī)化程度最高,為58.28%,是初始值的3.4倍,鋅元素的富集量為88.30 ppm;到達(dá)第7 d時(shí),雖然鋅元素的富集量可達(dá)132.75 ppm,但有機(jī)化程度僅為5.34%。因此,螺旋藻鋅富集最佳培養(yǎng)周期為3 d,此時(shí)螺旋藻鋅的有機(jī)化程度達(dá)到58.28%,鋅富集量為88.30 ppm。

2.2.4 硒對螺旋藻生長及其積累的影響

2.2.4.1 不同硒富集時(shí)間對鈍頂螺旋藻生長的影響 不同硒富集時(shí)間對鈍頂螺旋藻生長的影響結(jié)果見圖8。

圖8 硒富集時(shí)間對螺旋藻生長的影響Fig.8 Effect of different selenium accumulation time on the growth of Spirulina

由圖8可知,隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,實(shí)驗(yàn)組光密度值顯著(p<0.05)低于對照組,說明硒對螺旋藻細(xì)胞產(chǎn)生一定脅迫作用,并且在培養(yǎng)后期由于藻細(xì)胞將亞硒酸根離子轉(zhuǎn)化成易揮發(fā)性硒化物而導(dǎo)致培養(yǎng)液散發(fā)出一股刺激性氣味[26],但選擇合適的硒離子濃度添加,可使得這種對于生長量的影響維持在20%以內(nèi)。

2.2.4.2 鈍頂螺旋藻富集硒元素含量隨時(shí)間變化規(guī)律 由圖9可見,在100 mg/L Na2SeO3添加濃度下,螺旋藻硒元素含量及有機(jī)化程度均呈先上升后下降的趨勢,變化趨勢相同,兩者均在周期培養(yǎng)第5 d達(dá)到最大值,螺旋藻總硒含量為1011 ppm,有機(jī)化程度為70.54%;相比于培養(yǎng)第3 d,螺旋藻含硒總量增加153%,有機(jī)化程度增加20%,增幅明顯。

圖9 鈍頂螺旋藻富集硒元素含量隨時(shí)間變化規(guī)律Fig.9 Selenium accumulation and organic level during Spirulina’s culturing

因此,鈍頂螺旋藻對硒元素最佳富集時(shí)間為5 d,此時(shí)螺旋藻硒總含量最高達(dá)到1011 ppm,有機(jī)化程度為70.54%,在此條件下,螺旋藻生長量相比于最佳生長量降低12.9%。

2.3 螺旋藻蛋白與幾種礦物質(zhì)元素結(jié)合及其有機(jī)化程度分析

2.3.1 富鈣、富鐵、富鋅、富硒螺旋藻蛋白分別與鈣、鐵、鋅、硒的有機(jī)化結(jié)合程度分析 由表5可見,在富鈣條件下培養(yǎng)的螺旋藻干粉的總鈣含量為18.21 mg/g,從藻粉中提取的總蛋白含量為470 mg/g,由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知總蛋白中鈣含量為1.07 mg/g,經(jīng)測定,螺旋藻總蛋白含量是67.6%,以提取總蛋白含鈣量計(jì)算藻粉總蛋白中鈣的含量為1.04 mg/g;對比富鈣螺旋藻粉蛋白含鈣量與螺旋藻含鈣總量,富鈣螺旋藻粉總蛋白中鈣含量占總鈣的5.71%,占有機(jī)鈣含量的6.78%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,鈣與蛋白質(zhì)有機(jī)結(jié)合程度較低,而鈣具體有機(jī)化結(jié)合方式還有待進(jìn)一步研究。

表5 富鈣螺旋藻蛋白與鈣的有機(jī)結(jié)合情況Table 5 Calcium-rich Spirulina protein’s organic binding of calcium

由表6可見,富鐵螺旋藻干粉的總鐵含量為1634.34 ppm,有機(jī)鐵含量為1470.63 ppm,有機(jī)化程度為89.98%,有機(jī)化程度較高,這表明螺旋藻有效的將無機(jī)鐵在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為有機(jī)鐵。從藻粉中分離提取的總蛋白含量為474 mg/g,提取總蛋白中鐵含量為872.64 ppm,經(jīng)測定,螺旋藻總蛋白含量是67.5%,以經(jīng)計(jì)算得出螺旋藻干粉中蛋白的含鐵量為838.81 ppm;對比富鐵螺旋藻粉蛋白含鐵量與螺旋藻含鐵總量,富鐵螺旋藻粉總蛋白中鐵含量占總鐵含量的51.32%,占有機(jī)鐵含量的57.00%。

表6 富鐵、富鋅、富硒螺旋藻蛋白與鈣的有機(jī)結(jié)合情況Table 6 Iron-rich,zinc-rich and selenium-rich Spirulina protein’s organic binding of calcium

富鋅螺旋藻干粉的總鋅含量為88.30 ppm,有機(jī)鋅含量為36.84 ppm,螺旋藻鋅有機(jī)化程度為58.28%,這表明螺旋藻在一定程度上將無機(jī)鋅轉(zhuǎn)化為有機(jī)鋅。從藻粉中分離提取的總蛋白含量為466 mg/g,提取總蛋白中鋅含量為30.26 ppm,經(jīng)測得螺旋藻粉總蛋白含量是66.8%,計(jì)算得知螺旋藻粉總蛋白中鋅含量為28.98 ppm;對比富鋅螺旋藻粉蛋白含鋅量與螺旋藻含鋅總量,富鋅螺旋藻粉總蛋白中鋅含量占總鋅的32.82%。占有機(jī)鋅含量的78.66%。這表明,有機(jī)鋅的結(jié)合態(tài)中,超過三分之二是與蛋白質(zhì)結(jié)合。

富硒螺旋藻干粉的總硒含量為1011.00 ppm,而從藻粉中分離提取的總蛋白含量為455 mg/g。提取總蛋白中硒含量為513.64 ppm,經(jīng)測定,螺旋藻總蛋白含量是66.3%,以提取總蛋白含硒量推算螺旋藻粉總蛋白中硒含量為496.22 ppm,對比富硒螺旋藻粉蛋白含硒量與螺旋藻含硒總量,富硒螺旋藻粉總蛋白中硒含量占總硒的49.08%。占有機(jī)硒含量的69.58%,這說明硒在螺旋藻中主要是與蛋白質(zhì)結(jié)合。

2.3.2 螺旋藻蛋白結(jié)合礦物質(zhì)營養(yǎng)元素有機(jī)化程度分析 對Z氏培養(yǎng)液培養(yǎng)的螺旋藻干粉(對照組)及最優(yōu)富礦物質(zhì)營養(yǎng)元素條件下培養(yǎng)的螺旋藻干粉(實(shí)驗(yàn)組)進(jìn)行紅外圖譜掃描,圖譜結(jié)果見圖10。

圖10 紅外吸收光譜圖Fig.10 Infrared absorption spectroscopy注:a為對照組;b為富鈣培養(yǎng)螺旋藻;c為富鐵培養(yǎng)螺旋藻;d為富鋅培養(yǎng)螺旋藻;e為富硒培養(yǎng)螺旋藻。

圖10中,與對照相比,添加過四種不同離子的樣品在原波長為3352 cm-1處的吸收峰都有不同程度的藍(lán)移現(xiàn)象,并且吸收峰減小,造成這種藍(lán)移的現(xiàn)象是由于在加入以上四種離子后,羥基和胺基的混合峰的吸收峰減小,說明細(xì)胞表面氫鍵減弱,同時(shí)也說明藻體結(jié)合上述四種離子之后,羥基和胺基可能參與離子吸附與吸收,引起伸縮振動(dòng)的最大峰位移。在2927 cm-1處甲基和亞甲基伸縮振動(dòng)的相對強(qiáng)度減弱,這表明脂質(zhì)對上述離子吸收也產(chǎn)生了不同程度的作用;由于螺旋藻是一種蛋白含量極其豐富的藻類,所以存在兩個(gè)顯著的紅外光譜特征峰,分別是由于C=O的伸縮振動(dòng)產(chǎn)生位于1658 cm-1吸收峰對應(yīng)于酰胺I,由于 NH2剪式振動(dòng)吸收產(chǎn)生的位于1545 cm-1處的吸收峰是酰胺II。與對照相比,僅鈣離子可造成酰胺I特征的位移,這說明酰胺I中的C=O參與鈣離子配位,而四種離子都造成了酰胺II特征峰的改變。很顯然,上述的四種離子都與氨基酸中N-H彎曲振動(dòng)(60%)和多肽鏈、碳骨架中的 C-N伸縮振動(dòng)(40%)產(chǎn)生,這說明N-H同時(shí)參與離子配位[27]。由于多糖分子中存在多個(gè)C-OH基團(tuán),因此在1100～1000 cm-1之間出現(xiàn)多個(gè)C-O伸縮振動(dòng)吸收峰,可能含有P-O-C伸縮振動(dòng)的貢獻(xiàn);同時(shí),在1000～800 cm-1之間發(fā)生了糖環(huán)的環(huán)振動(dòng),推測螺旋藻上述四種離子積累與糖類物質(zhì)密不可分。

另外,由于藻細(xì)胞的細(xì)胞壁對鈣離子進(jìn)行有效吸附和吸收,因此位于1160 cm-1由于細(xì)胞壁上主要成分-碳水化合物中C-O鍵的伸縮振動(dòng)產(chǎn)生吸收峰峰面積增加;螺旋藻富集鐵離子和硒離子之后1320 cm-1處C-O振動(dòng)收縮峰消失,1240 cm-1C-O伸縮振動(dòng)加強(qiáng),這是蛋白質(zhì)和脂肪酸吸收鐵離子后的結(jié)構(gòu)變化。在添加硒離子后,在624 cm-1處,峰位由624.93 cm-1偏移至577.92 cm-1,吸收峰強(qiáng)度降低,這是由N-H面外變形振動(dòng)形成氫鍵,使波峰向低波數(shù)移動(dòng)[28]。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過對主要影響螺旋藻生長的環(huán)境因子(溫度、光照、pH)進(jìn)行調(diào)控,確定螺旋藻最佳生長量的環(huán)境條件為:溫度30 ℃,光照12 kLux,pH9.5。鈣積累的最佳條件為:溫度20 ℃,光照12 kLux,pH8.5,鈣積累量提高了97%,外源添加0.6 g/L CaCO3,培養(yǎng)7 d收獲,螺旋藻鈣總含量和其有機(jī)化程度分別達(dá)到18.21 mg/g,84.17%。鐵元素積累最佳條件為:溫度30 ℃,光照4 kLux,pH10.5,鐵積累量提高了175%,外源添加FeSO4·7H2O濃度至40 mg/L,培養(yǎng)3 d后收獲,螺旋藻中鐵總含量及有機(jī)化程度分別達(dá)到1634.34 ppm,89.98%。鋅元素積累最有佳條件為:30 ℃,8 kLux,pH8.5,在此條件下同時(shí)外源添加ZnSO4·7H2O濃度至40 mg/L,培養(yǎng)3 d后收獲,鋅有機(jī)化程度最高,螺旋藻最高鋅含量和有機(jī)化程度分別達(dá)到88.30 ppm,58.28%。硒元素積累最有利條件為:30 ℃,12 kLux,pH9.5,在此條件下外源添加100 mg/L Na2SeO3培養(yǎng)5 d后收獲,螺旋藻中硒元素總含量及有機(jī)化程度達(dá)到最大值,螺旋藻中硒元素總含量及有機(jī)化程度分別為1011.00 ppm,70.54%。

由此可見,鋅、硒和鐵與蛋白質(zhì)結(jié)合程度較高,占有機(jī)化程度的50%以上,這具有開發(fā)富礦質(zhì)營養(yǎng)蛋白粉和食品添加的潛力。只有鈣與蛋白質(zhì)結(jié)合不足10%,定性研究表明其還可能與多糖和脂類結(jié)合,其他三種元素也具有此共性。本項(xiàng)研究實(shí)現(xiàn)了螺旋藻生長和營養(yǎng)元素積累同時(shí)調(diào)控,無機(jī)元素通過螺旋藻細(xì)胞載體實(shí)現(xiàn)高度有機(jī)化,在醫(yī)藥、食品、化妝品領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。