胡璇 葉俊釗 廖獻(xiàn)花 邵琮翔 李福曦 鐘碧慧
中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化科(廣州 510080)
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)導(dǎo)致慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B)的發(fā)生,是肝硬化甚至肝癌的主要病因,造成嚴(yán)重后果。乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen,HBeAg)血清學(xué)轉(zhuǎn)換能夠改善HBV感染免疫調(diào)控,有效降低患者終末期肝病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn),是抗病毒治療的重要目標(biāo)[1]。研究證明白細(xì)胞介素?21(interleukin?21,IL?21)及其下游效應(yīng)細(xì)胞因子干擾素?γ(interferon?γ,IFN?γ)能夠有效抑制HBV復(fù)制,促進(jìn)HBV感染患者抗病毒治療的結(jié)局轉(zhuǎn)歸[2-3]?;颊呖共《久庖邞?yīng)答反應(yīng)與自身遺傳背景的相關(guān)性逐漸受到廣泛關(guān)注與探討,炎癥性細(xì)胞因子基因多態(tài)性與HBV感染患者預(yù)后轉(zhuǎn)歸的關(guān)聯(lián)尚不明確[4-5]。
本研究通過(guò)檢測(cè)接受核苷酸類似物治療的乙型肝炎患者IL?21及其受體和IFN基因特定位點(diǎn)基因多態(tài)性,分析它們與HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換和乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)下降幅度的關(guān)系,旨在明確特定位點(diǎn)基因多態(tài)性對(duì)慢性乙型肝炎療效血清學(xué)應(yīng)答的影響,為患者個(gè)體化治療提供有力證據(jù)。
1.1 病例來(lái)源和診斷標(biāo)準(zhǔn)選取2015年1月至2017年12月中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科門診就診的慢性乙型肝炎患者,根據(jù)我國(guó)《慢性乙型肝炎防治指南》(2015更新版)診斷標(biāo)準(zhǔn)[6],符合口服核苷酸類似物抗病毒治療指征,已接受規(guī)律抗病毒治療3年以上,HBV?DNA<100 IU/mL且剪切波彈性成像(shear wave elastography,SWE)檢測(cè)值均小于10 kPa。入選病例共200例,按照治療3年后是否發(fā)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換分為HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換組(轉(zhuǎn)換組)和非轉(zhuǎn)換組(對(duì)照組),其中轉(zhuǎn)換組50例,對(duì)照組150例。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)其他病毒感染性肝病,膽道相關(guān)疾病,遺傳代謝性肝病,自身免疫性肝病及終末期肝病等;(2)長(zhǎng)期飲酒酗酒史(男 >40 g/d,女 >20 g/d,超過(guò)5年;或者2周內(nèi)大量飲酒史,>80 g/d);(3)正在接受免疫調(diào)節(jié)治療或干擾素治療患者;(4)自身免疫性疾病包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、甲狀腺功能亢進(jìn)等;(5)藥物濫用;(6)妊娠或哺乳。
1.2 研究方法
1.2.1 血清學(xué)指標(biāo)空腹6~8 h無(wú)菌條件下采集靜脈血并完成以下指標(biāo)檢測(cè):血常規(guī),常規(guī)生物化學(xué)指標(biāo)包括丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)、總膽紅素、白蛋白、血尿酸、血肌酐、尿素氮、空腹血糖、空腹胰島素,乙肝血清學(xué)標(biāo)志物(HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb),HBV?DNA定量,甲胎蛋白(AFP)。
1.2.2 單核苷酸多態(tài)性(single?nucleotide poly?morphism,SNP)分型檢測(cè)HapMap數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選IL?21、IL?21R和IFN尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道或已在免疫方向文獻(xiàn)報(bào)道較多的SNP位點(diǎn),并選擇等位基因頻率>0.05的多態(tài)性位點(diǎn)。最終遴選15個(gè)SNP位點(diǎn)(IL?21rs13143866,rs10032644,rs12505138,rs12508721,rs17005929,rs6840978,IL?21Rrs2214537,rs8057551,rs8061992,rs3093390,rs3093301,IFNA rs1831391,rs674189,IFNG rs7956688,rs2069705)采用Assay Designer 3.1軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)和單堿基擴(kuò)展引物。MassArray技術(shù)進(jìn)行SNP分型檢測(cè)。步驟如下:美國(guó)Agena公司基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI?TOF MS)對(duì)200個(gè)樣本15個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè),經(jīng)PCR擴(kuò)增反應(yīng),產(chǎn)物堿性磷酸酶處理及單堿基延伸反應(yīng)后,啟動(dòng)MassARRAY Nanodispenser RS1000點(diǎn)樣儀芯片點(diǎn)樣,MALDI?TOF質(zhì)譜儀(MassARRAY Analyzer 4.0)分析點(diǎn)樣后的芯片,TYPER4.0軟件獲取原始數(shù)據(jù)及基因分型圖。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件,正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述,非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用中位數(shù)及四分位數(shù)間距進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述。定量資料采用t檢驗(yàn)或者非參數(shù)檢驗(yàn),定性資料采用卡方檢驗(yàn),基因頻率及基因型頻率采用卡方檢驗(yàn)或者Fisher精確概率法,多元回歸分析采用相對(duì)危險(xiǎn)度(odds ratio,OR)和95%置信區(qū)間(95%confidence interval,95%CI)表示,哈迪-溫伯格平衡(hardy?weinberg equilibrium,HWE)檢測(cè) 采 用 SHEsis軟 件(http://analysis.bio?x.cn/my?Analysis.php)。所有數(shù)據(jù)均使用雙側(cè)檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 一般資料共納入臨床資料完整的200例患者,其中轉(zhuǎn)換組50例,對(duì)照組150例,兩組間年齡、性別比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。轉(zhuǎn)換組的HBsAg濃度水平、ALT水平和AFP水平均顯著高于對(duì)照組(P值依次為0.012、0.010、0.035,表1)。
2.2 IL?21及其受體與IFN基因多態(tài)性預(yù)測(cè)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換分析SNP分型檢測(cè)原始結(jié)果見(jiàn)圖1。15個(gè)SNP位點(diǎn)中共發(fā)現(xiàn)7個(gè)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換陽(yáng)性關(guān)聯(lián)位點(diǎn)(表2),均具有群體代表性(基因型分布均符合HWE平衡,P>0.05),分別是IL?21 rs12505138(A >G)等位基因A(36.0%vs.23.8%,P=0.017)及 AA基因型(14.0%vs.5.3%,P=0.045)、rs17005929(T > C)等位基因T(35.0%vs.23.5%,P=0.024)、rs6840978(C> T)等位基因C(93.0%vs.83.9%,P=0.022)、IL?21R基因rs8057551(A >G)等位基因A(60.0%vs.46.0%,P=0.015)及 AA基因型(40.0%vs.22.1%,P=0.023)、rs8061992(C>A)等位基因C(62.0%vs.47.7%,P=0.013)及CC基因型(44.0%vs.23.5%,P=0.027)、rs3093301(T>C)TT基因型(34.0%vs.20.0%,P=0.043)和IFNA基因rs1831391(A >C)等位基因A(54.1%vs.41.2%,P=0.026)及AA基因型(26.5%vs.26.9%,P=0.026)在轉(zhuǎn)換組中的頻率均顯著高于對(duì)照組。其中IL?21 rs12505138,rs17005929及IFNA rs1831391尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。
表1 轉(zhuǎn)換組與對(duì)照組的基線資料Tab.1 Baseline characteristics of HBeAg seroconversion group and control group
圖1 SNP分型原始結(jié)果Fig.1 The original results of SNP
2.3 HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換陽(yáng)性關(guān)聯(lián)位點(diǎn)基因型與HBsAg下降幅度的關(guān)系200例患者中共126例繼續(xù)原抗病毒藥物治療并隨訪至第48周(轉(zhuǎn)換組42例,對(duì)照組84例)。在基線或隨訪第48周HBsAg比較發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)換組相比對(duì)照組HBsAg水平明顯更低(基線:3.25±0.62vs.3.52±0.66 Log10IU/mL,P=0.012,48周:3.06±0.79vs.3.41±0.67 Log10IU/mL,P=0.011),但基線至隨訪第48周的HBsAg下降幅度(△HBsAg)組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.11±0.28vs.0.11±0.20 Log10IU/mL,P=0.887)(表3)。而繼續(xù)將△HBsAg與7個(gè)陽(yáng)性關(guān)聯(lián)位點(diǎn)基因型進(jìn)行單因素和多因素分析比較發(fā)現(xiàn),攜帶IFNA rs1831391CC基因型與HBsAg下降幅度獨(dú)立相關(guān)(β=-0.200,95%CI:-0.122~-0.008,P=0.027),其他6個(gè)陽(yáng)性位點(diǎn)與HBsAg下降幅度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。
流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示我國(guó)普通人群HBsAg攜帶率為7%,HBV感染導(dǎo)致的終末期肝硬化和肝癌所占比例高達(dá)60%~80%,HBV的高度流行對(duì)家庭、社會(huì)乃至國(guó)家?guī)?lái)極大的經(jīng)濟(jì)壓力與健康影響,造成嚴(yán)重的社會(huì)危害[7-8]。直接抗病毒藥物即核苷類似物是現(xiàn)階段慢性HBV感染患者的基本治療藥物,以往Ⅲ期臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)提示,規(guī)律接受替諾福韋治療患者第48周HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率為21%,恩替卡韋治療患者第96周HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率為31%,而藥物上市后實(shí)際數(shù)據(jù)顯示接受治療患者中HBeAg血清學(xué)清除率遠(yuǎn)未達(dá)到該比例[9-11]。
IL?21及IFN?γ是調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答過(guò)程中的重要細(xì)胞因子,其血清學(xué)水平也被證實(shí)與肝臟疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān),已被認(rèn)為是抑制HBV的重要分子[2,12]。一項(xiàng)納入395例慢性HBV感染患者、75例HBV自愈和174例健康對(duì)照的研究發(fā)現(xiàn),HBV感染患者攜帶 IL?21 rs2221903/IL?21R rs3093301 AA/CC基因型相比AA/CT或AA/TT基因型具有更高的IL?21及IgE水平,提示攜帶IL?21R rs3093301CC基因型在HBV感染中可誘導(dǎo)更高的IL?21及IgE水平繼而影響HBV感染免疫狀態(tài)[13]。
本研究以探討HBV感染抗病毒治療患者IL?21與IFN相關(guān)基因多態(tài)性與血清學(xué)應(yīng)答的關(guān)聯(lián)為目的,通過(guò)分析規(guī)律核苷酸類似物抗病毒治療3年后實(shí)現(xiàn)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換患者(轉(zhuǎn)換組)和尚未發(fā)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換患者(對(duì)照組)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),檢測(cè)的15個(gè)SNP位點(diǎn)中共7個(gè)位點(diǎn)特定等位基因或基因型頻率在轉(zhuǎn)換組顯著高于對(duì)照組,有助于預(yù)測(cè)HBV抗病毒治療患者HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換。其中有3個(gè)位點(diǎn)既往未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外的文獻(xiàn)報(bào)道,分別為IL?21 rs12505138(A > G)、rs17005929(T > C)和IFNA rs1831391(A>C),首次在中國(guó)漢族人群中檢測(cè)出其單核苷酸多態(tài)性,為中國(guó)HBV感染患者抗病毒治療提供了新的數(shù)據(jù)支持。此外,IL?21 rs6840978被證實(shí)是炎癥性腸病的易感位點(diǎn),并指出其與潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生密切相關(guān)[14],而在HBV感染中未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道,本研究結(jié)果提示攜帶rs6840978等位基因C患者相較于等位基因T患者經(jīng)抗病毒治療后發(fā)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率更高(93.0%vs.83.9%,P=0.022)。IL?21R rs8057551、rs8061992僅在一項(xiàng)白人受試者研究中發(fā)現(xiàn)其單核苷酸多態(tài)性與骨代謝相關(guān),為骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生提供了遺傳學(xué)依據(jù)[15]。而本研究證實(shí)轉(zhuǎn)換組中rs8057551(A>G)等位基因A及AA基因型、rs8061992(C>A)等位基因C及CC基因型頻率顯著高于對(duì)照組(均P<0.05)。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)IL?21R rs3093301 TT基因型相較于CC/CT在抗病毒治療中患者實(shí)現(xiàn)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的預(yù)測(cè)作用(34.0%vs.20.0%,P=0.043),該結(jié)果與前人報(bào)道結(jié)果一致[13]。
表2 IL?21及其受體和IFN基因HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換陽(yáng)性關(guān)聯(lián)位點(diǎn)基因頻率及基因型分布Tab.2 Allele and genotype frequencies of HBeAg seroconversion associated SNPs in IL?21,IL?21R and IFN gene例(%)
表3 轉(zhuǎn)換組與對(duì)照組不同時(shí)期HBsAg及差值比較結(jié)果Tab.3 Comparison of HBsAg loss between HBeAg seroconversion group and control group ±s
表3 轉(zhuǎn)換組與對(duì)照組不同時(shí)期HBsAg及差值比較結(jié)果Tab.3 Comparison of HBsAg loss between HBeAg seroconversion group and control group ±s
注:△HBsAg,HBsAg下降幅度
例數(shù)42 84組別轉(zhuǎn)換組對(duì)照組P值HBsAg(Log10IU/mL)基線3.25±0.62 3.52±0.66 0.012 48周3.06±0.79 3.41±0.67 0.011△HBsAg 0.11±0.28 0.11±0.20 0.887
HBsAg清除亦是HBV感染抗病毒治療患者臨床療效和隨訪過(guò)程中重點(diǎn)關(guān)注的方面,持續(xù)高水平的HBsAg濃度加劇患者肝臟相關(guān)事件的發(fā)生。本研究進(jìn)一步將HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換陽(yáng)性關(guān)聯(lián)位點(diǎn)基因多態(tài)性與隨訪48周HBsAg下降幅度分析發(fā)現(xiàn)攜帶IFNA rs1831391 CC基因型與HBsAg下降幅度獨(dú)立相關(guān),該結(jié)果為抗病毒治療患者尋找臨床治愈線索提供新的方向與思路。
本研究在中國(guó)人群檢測(cè)發(fā)現(xiàn)7個(gè)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換陽(yáng)性關(guān)聯(lián)位點(diǎn),其中包括3個(gè)國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道的新發(fā)現(xiàn)位點(diǎn),2個(gè)與其他疾病相關(guān)但首次發(fā)現(xiàn)與HBV感染相關(guān)的位點(diǎn),均有助于預(yù)測(cè)慢性乙型肝炎療效血清學(xué)應(yīng)答。本研究的不足之處有:(1)陽(yáng)性位點(diǎn)的功能驗(yàn)證有待繼續(xù)完善;(2)乙型肝炎患者治療隨訪時(shí)間尚需適當(dāng)延長(zhǎng)以進(jìn)一步驗(yàn)證療效。本研究為在宿主自身遺傳背景相關(guān)的IL?21及其受體和IFN特定位點(diǎn)SNP多態(tài)性與乙型肝炎治療中患者抗病毒免疫功能及血清學(xué)清除的關(guān)系探討方面提供了有力的證據(jù)支持,給乙型肝炎患者臨床治療領(lǐng)域帶來(lái)新的理念和希望。