華中地區(qū)漢族人群SLCO1B1與APOE基因多態(tài)性分析及臨床意義

王京偉 李艷 喬斌 陳娟娟

武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科（武漢 430060）

他汀類藥物（statins），亦作羥甲基戊二酰輔酶A（hydroxymethyl?glutaryl coenzyme A，HMG?CoA）還原酶抑制劑，是臨床降脂的首選藥物，也是預(yù)防心腦血管疾病的重要藥物之一。然而，他汀類藥物的使用存在較大個(gè)體差異，部分患者可出現(xiàn)如肌肉毒性、肝毒性、神經(jīng)毒性及胃腸道反應(yīng)等不良反應(yīng)，給臨床醫(yī)生在藥物選擇、用藥劑量個(gè)體化及預(yù)后評(píng)估等方面均帶來困擾。研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物不良反應(yīng)與遺傳因素相關(guān)，尤其與有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽（organic anion transporting polypeptide 1B1，OATP1B1）編碼基因SLCO1B1及載脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）基因的單核甘酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）密切相關(guān)，SLCO1B1與ApoE的不同基因型對(duì)藥物的療效及不良反應(yīng)差異巨大[1]。而我國(guó)由于遺傳背景的差異他汀類藥物使用不良反應(yīng)的發(fā)生率遠(yuǎn)高于歐美國(guó)家[8]。因此進(jìn)行APOE及SLCO1B1基因型檢測(cè)對(duì)用藥不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)提示具有重要的輔助診斷意義，可以協(xié)助臨床對(duì)患者實(shí)施個(gè)體化用藥指導(dǎo)[2]。本研究采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）-熒光探針法對(duì)華中地區(qū)心腦血管疾病患者和健康人群同時(shí)進(jìn)行SLCO1B1和APOE基因多態(tài)性位點(diǎn)分析，從分子水平分析華中地區(qū)SLCO1B1和APOE基因多態(tài)性分布，為華中地區(qū)心腦血管疾病的防止和個(gè)體化治療提供理論基礎(chǔ)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料分別收集從2016年1月至2017年6月武漢大學(xué)人民醫(yī)院就診并接受SLCO1B1和ApoE基因多態(tài)性檢測(cè)的患者的EDTA?K抗凝靜脈血918份，采用多重PCR-探針法對(duì)SLCO1B1和ApoE進(jìn)行基因的多態(tài)性位點(diǎn)分析。就診患者年齡19～99歲，平均年齡（60.06±14.26）歲，其中男604例，平均年齡（59.80±14.10）歲，女314例，平均年齡（60.68±14.50）歲。所有入選者籍貫均為華中地區(qū)漢族人，無血緣關(guān)系和異族通婚史。

1.2 儀器和試劑QuantStudio Dx實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)Life Technologies公司）；Smart LabAss?ist?32核酸自動(dòng)純化提取儀（臺(tái)灣圓點(diǎn)奈米技術(shù)開發(fā)有限公司）；全血基因組核酸提取及純化試劑（上海星耀醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司）；Nanodrop 2000超微量分光光度計(jì)（美國(guó)NanoDrop公司）；人類SLCO1B1和ApoE基因多態(tài)性檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針法）（武漢友芝友醫(yī)療科技有限公司，批號(hào)：18050904質(zhì)控：試劑盒自帶SLCO1B1基因*1b和*5和ApoE基因ε2和ε4弱陽性質(zhì)控及空白對(duì)照）。實(shí)驗(yàn)所用的內(nèi)參基因由武漢友芝友醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn)。

1.3 SLCO1B1和ApoE基因多態(tài)性檢測(cè)

1.3.1 基因組DNA提取采集受檢者靜脈血2 mL，乙二胺四乙酸二鉀抗凝，采用全血基因組核酸提取及純化試劑提取基因組DNA，按試劑盒說明書進(jìn)行操作。在96孔預(yù)裝板的第1列和第7列加入全血樣本400 μL，分別在提取反應(yīng)板中第1列和第 7 列加入蛋白酶 20 μL，選擇 Smart LabAssist?32核酸自動(dòng)純化提取儀上相應(yīng)的提取程序進(jìn)行自動(dòng)化核酸提取。運(yùn)行結(jié)束后第5列和第11列對(duì)應(yīng)槽位為相應(yīng)標(biāo)本提取的DNA。用Nanodrop2000超微量分光光度計(jì)測(cè)量DNA的濃度與純度，A260/A280在1.8～2.0，A260/A230＞2。根據(jù)定量濃度將DNA樣本稀釋至5～15 ng/μL進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，基因組DNA原液-20℃保存。

1.3.2 PCR擴(kuò)增將23 μL SLCO1B1*1b反應(yīng)液、SLCO1B1*5反應(yīng)液、ApoE2反應(yīng)液、ApoE4反應(yīng)液及內(nèi)標(biāo)反應(yīng)液依次加入到200 μL PCR 8聯(lián)管內(nèi)，再依次加入2 μL基因組DNA，總體積25 μL。同時(shí)做弱陽性對(duì)照和空白對(duì)照。將PCR反應(yīng)管放置擴(kuò)增儀中進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?7℃10 min，95℃預(yù)變性5 min；擴(kuò)增階段95℃變性15 s，60℃延伸60 s（設(shè)置在此階段結(jié)束時(shí)采集熒光信號(hào)），共40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)體系為25 μL。熒光信號(hào)采集為FAM 通道（SLCO1B1*1b 388A、SLCO1B1*5 521T、ApoE2 526C和ApoE4 388T）、VIC通道（SLCO1B1*1b 388G、SLCO1B1*5 521C、ApoE2 526T和ApoE4 388C）和ROX通道（內(nèi)標(biāo)基因）。

1.3.3 結(jié)果判斷試劑盒有效性判定：弱陽性對(duì)照：FAM、VIC、ROX通道Ct值 ≤ 32，擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期?？瞻讓?duì)照：FAM、VIC、ROX通道無擴(kuò)增曲線，或者擴(kuò)增曲線為直線或輕微斜線，無明顯指數(shù)增長(zhǎng)期，無Ct值或Ct值≥38。樣本有效性的判定：內(nèi)標(biāo)基因（ROX通道）的Ct值＜38，擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期。樣本基因多態(tài)性判定：相應(yīng)通道的Ct值＜38，擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期，則該通道代表的基因型為陽性。若Ct值≥38或無Ct值，則該通道代表的基因型為陰性。若僅FAM通道Ct值＜38，ROX通道的Ct值≥38或無Ct值則判斷為純和野生型；若僅ROX通道Ct值＜38，F(xiàn)AM通道的Ct值≥38或無Ct值則判斷為純和突變型；若FAM通道與ROX通道的Ct值均＜38，則判斷為雜合型。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法各SNP位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率通過頻率計(jì)算法計(jì)算。采用χ2檢驗(yàn)分析各SNP位點(diǎn)是否符合Hardy?Weinberg遺傳平衡，采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 華中地區(qū)SLCO1B1與apoE基因多態(tài)性分布SLCO1B1基因388A＞G、521T＞C兩個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性與他汀類用藥相關(guān)，攜帶突變基因的人群轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能降低，因此發(fā)生肌病等副作用的風(fēng)險(xiǎn)較正常人群更高。兩個(gè)位點(diǎn)可形成4種單倍型：SLCO1B1*1a（388A ?521T），SLCO1B1*1b（388G ?521T），SLCO1B1*5（388A?521C），SLCO1B1*15（388G?521C）[3-4]，和九種不同表型：*1a/*1a，*1a/*1b，*1b/*1b，*1a/*5，*1a/*15，*1b/*15，*5/*5，*5/*15，*15/*15，華中地區(qū)人群九種表型占比為7.63%、30.83%、40.96%、0.22%、5.12%、13.94%、0%、0%、1.31%，詳見表1。根據(jù)服用他汀類藥物后發(fā)生橫紋肌溶解癥或肌病的風(fēng)險(xiǎn)及服用藥物的劑量將其分為正常代謝型（*1a/*1a，*1a/*1b，*1b/*1b）、中間代謝型（*1a/*5，*1a/*15，*1b/*15）患、弱代謝型（*5/*5，*5/*15，*15/*15）三類。華中地區(qū)上述三類患者的人群占比分別為79.41%，19.28%和1.31%，弱代謝型人群肝臟攝取藥物能力較差，發(fā)生橫紋肌溶解癥或肌病風(fēng)險(xiǎn)較突變型患者高，需減少他汀類藥物使用劑量[5]，是臨床需要關(guān)注的對(duì)象。

ApoE基因388T＞C，526C＞T兩個(gè)位點(diǎn)與他汀類藥物的療效相關(guān)，可產(chǎn)生三種不同的基因亞型 Apoε2（388T?526T），Apoε3（388T?526C），Apoε4（388C?526C）和 6種不同表型：E2/2、E2/3、E2/4、E3/3、E3/4 和 E4/4[3，6]，其中，ApoE3/3 是野生型（Wild?type）。6種表型占比為0.64%、1253%、2.07%、68.41%、14.81%、1.53%，見表1。

根據(jù)不同基因型發(fā)生冠心病、心梗、腦梗、老年癡呆等的風(fēng)險(xiǎn)及服用他汀類藥物的療效將其分為三大類[7-9]，APOE保護(hù)類基因型（ε2/ε2，ε2/ε3），APOE 大眾類基因型（ε2/ε4，ε3/ε3）和 APOE 風(fēng)險(xiǎn)類基因型（ε3/ε4，ε4/ε4），華中地區(qū)這三類人群的占比分別為13.18%。70.48%和16.34%，詳見表1。各個(gè)基因型之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

表1 華中地區(qū)SLCO1B1和ApoE基因多態(tài)性分布結(jié)果Tab.1 General data of patients in Central China with different SLCO1B1 and ApoE genotypes

2.2 不同性別SLCO1B1和ApoE基因多態(tài)性分布差異男性患者的SLCO1B1基因的*1a/*1a、*1a/*1b、*1b/*1b、*1a/*5、*1a/*15、*1b/*15、*5/*5、*5/*15和*15/*15表型所占比例分別為8.11%、30.13%、41.56%、0.33%、3.97%、14.24%、0%、0%、1.66%。女性患者各亞型所占比例分別為6.69%、32.17%、39.81%、0%、7.32%、13.38%、0%、0%、0.64%。男女患者SLCO1B1正常代謝型占比最重，分別為80.33%和78.66%，中間代謝型為18.54%和20.70%，弱代謝型為1.66%和0.64%。不同性別間除1a/15型有差異外其它各亞型間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖1A。

男性患者ApoE 基因ε2/ε2、ε2/ε3、ε2/ε4、ε3/ε 3、ε3/ε4 和 ε4/ε4 表 型 所 占 比例分別為 0.99%、11.59%、2.15%、69.21%、14.40%、1.66%，女性依次為0%、14.33%、1.91%、66.88%、15.61%、1.27%。男女性患者ApoE大眾類基因型占比最重，分別為71.36%和68.79%，保護(hù)類基因型為12.58%和14.33%，風(fēng)險(xiǎn)類基因型為16.06%和16.88%。不同性別間各表型之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1B。

2.3 華中地區(qū)基因型分布及等位基因頻率分布基因型和各等位基因頻率見表2，918例華中地區(qū)漢族人群中，SLCO1B1基因的388A＞G（rs2306283）位點(diǎn)共檢測(cè)出野生型72例，雜合突變型330例，純合突變型516例，等位基因突變發(fā)生率為74.18%。SLCO1B1基因的521T＞C（rs4149056）位點(diǎn)共檢測(cè)出野生型729例，雜合突變型177例，純合突變型12例，等位基因突變發(fā)生率為10.95%。

918例華中地區(qū)漢族人群中APOE基因的388T＞C（rs429358）位點(diǎn)共檢測(cè)出野生型749例，雜合突變型155例，純合突變型14例，等位基因突變發(fā)生率為9.97%。APOE基因的526C＞T（rs7412）位點(diǎn)共檢測(cè)出野生型778例，雜合突變型134例，純合突變型6例，等位基因突變發(fā)生率為7.95%。

圖1 不同性別間SLCO1B1和ApoE基因多態(tài)性分布結(jié)果Fig.1 Distribution of SLCO1B1 and ApoE genotypes between different sexes

表2 SLCO1B1和ApoE基因多態(tài)性頻率分布Tab.2 Frequency distribution of SLCO1B1 and ApoE genotypes

經(jīng)χ2檢驗(yàn)，SLCO1B1及APOE基因的上述多態(tài)性位點(diǎn)突變頻率觀察值符合Hardy?wenberg遺傳平衡（P＞0.05），具有群體代表性。

3 討論

他汀類藥物不良反應(yīng)相關(guān)的癥狀（statin?asso?ciate symptom，SAS），如肌肉癥狀、肝臟損害、中樞神經(jīng)癥狀、糖尿病等[10-11]是導(dǎo)致患者早期減藥或停藥的主要原因之一。此外，長(zhǎng)期服用他汀類可誘發(fā)輕度認(rèn)知障礙或永久的癡呆[12]，減藥或停藥則可增加臨床動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病事件。因此，他汀類藥物使用的獲益與潛在風(fēng)險(xiǎn)間的評(píng)估已成為醫(yī)患共同關(guān)注的問題。SLCO1B1和ApoE基因的SNP是藥物代謝個(gè)體差異的分子基礎(chǔ)，也是影響藥物相互作用的重要原因。

位于12號(hào)染色體上的SLCO1B1基因的388A＞G、521T＞C多態(tài)性可引發(fā)功能缺陷，導(dǎo)致他汀藥效和毒副作用的個(gè)體差異，是明確的遺傳影響因素。SLCO1B1基因的388G會(huì)增加OATP1B1對(duì)某些他汀類藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，個(gè)體血脂的降低水平明顯高于其它基因型個(gè)體，因此388GG可增加他汀的藥效[13]。521C可降低OATP1B1與底物的親和力及轉(zhuǎn)運(yùn)活性，減慢藥物代謝速率[14]，長(zhǎng)期高劑量辛伐他汀會(huì)增加橫紋肌溶解癥的風(fēng)險(xiǎn)[15-17]。388A＞G、521T＞C兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)可形成4種單倍型和9種不同表型。

位于人類19號(hào)染色體上ApoE基因的388T＞C、526C＞T基因多態(tài)性是機(jī)體脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)因子，也是影響他汀類降脂療效的主要因素，被認(rèn)為是高脂血癥及動(dòng)脈粥樣硬化性心腦血管病的候選易感基因。正常人群中Apoε2（388T?526T）攜帶者血漿TC、LDL?C水平低于Apoε3（388T?526C）型患者，他汀類藥物降脂效果相對(duì)其它2型最好。而Apoε4（388C?526C）型患者TC、LDL?C水平要遠(yuǎn)高于Apoε3型，他汀類藥物的降脂療效往往不佳或無效，同時(shí)患冠心病、阿爾茲海默癥（Alzheimer′s disease，AD）和血管性癡呆（VD）的危險(xiǎn)性也相對(duì)增加[18-19]。388T＞C，526C ＞T兩個(gè)基因多態(tài)性可產(chǎn)生3種基因亞型和6種不同表型。

華中地區(qū)漢族人群中SLCO1B1基因以*1a/*1b、*1b/*1b基因型為主，占71.79%，說明華中地區(qū)多數(shù)漢族人群可耐受大劑量他汀類藥物；APOE基因型中以ε3/ε3為主，占68.4%，說明華中地區(qū)多數(shù)漢族人群服用他汀類藥物相對(duì)安全，堅(jiān)持服藥可以取得預(yù)期療效。不同性別SLCO1B1及APOE基因型分布與人群總體分布趨勢(shì)相同[12]。除SLCO1B1基因的*1a/*15亞型在男女性別中有差異外，其它均無差異?？梢娙A中地區(qū)漢族人群中他汀藥物的治療有較高的敏感性，中等強(qiáng)度他汀類藥物治療便可有效地將多數(shù)患者的LDL?C水平將至可接受范圍，因此不推薦華中地區(qū)患者大劑量、高強(qiáng)度使用他汀類藥[20]。

918例受檢者中發(fā)現(xiàn)同時(shí)具有APOE保護(hù)類基因型（ε2/ε2、ε2/ε3）和SLCO1B1正常代謝型（*1a/*1a、*1a/*1b、*1b/*1b）患者94例（10.24%），此類人群藥物劑量耐受能力強(qiáng)，發(fā)生SAS、冠心病、心梗、腦梗、老年癡呆等疾病的風(fēng)險(xiǎn)較低，療效好，是他汀類藥物的最佳受益人群。同時(shí)具有APOE風(fēng)險(xiǎn)類基因型（ε3/ε4、ε4/ε4）和 SLCO1B1弱代謝型（*5/*5、*5/*15、*15/*15）的患者1例（0.11%），該類人群藥物代謝能力較差，發(fā)生上述不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)較高，治療效果較差。該類人群應(yīng)為他汀類藥物的禁用人群。

單獨(dú)具有APOE風(fēng)險(xiǎn)類基因型患者149例（16.23%），該類患者發(fā)生冠心病、心梗、腦梗、老年癡呆等患病風(fēng)險(xiǎn)較高，療效較差。有AD家族史或記憶力已經(jīng)明顯衰退的人群需進(jìn)行ApoE基因多態(tài)性檢測(cè)，E4攜帶者的一級(jí)親屬（父母、子女以及同胞兄弟姐妹）均應(yīng)進(jìn)行ApoE基因多態(tài)性的檢測(cè)及遺傳咨詢，對(duì)于患者健康生活指導(dǎo)和合理化用藥都有重要意義，對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)人群進(jìn)行早期干預(yù)延緩AD的發(fā)生。單獨(dú)具有SLCO1B1弱代謝型患者11例（1.20%），該類患者需嚴(yán)格控制藥物使用劑量監(jiān)測(cè)藥物不良反應(yīng)或考慮他汀類替代方案。由于患者長(zhǎng)期服藥，為了達(dá)到最大療效和避免不良反應(yīng)，篩查APOE風(fēng)險(xiǎn)類基因型及SLCO1B1弱代謝型，關(guān)注特殊人群對(duì)他汀藥物的反應(yīng)，對(duì)臨床用藥指導(dǎo)及健康管理至關(guān)重要[13]。

SLCO1B1基因的388A＞G和521T＞C存在高度的連鎖不平衡，不同種族人群的分布存在很大差異。已有研究報(bào)道388A＞G在高加索人、非洲人和亞洲人中的突變頻率分別為30%～45%、70%～80%和60%～90%。521T＞C在高加索人、非洲人和亞洲人中的突變頻率分別為15%～20%，1%～2%和10%～15%[21]。本研究發(fā)現(xiàn)華中地區(qū)漢族人群中SLCO1B1 388A＞G和521T＞C的突變頻率分別為74.18%和10.95%，均在已報(bào)道的亞洲人的突變頻率范圍內(nèi)。本研究發(fā)現(xiàn)華中地區(qū)漢族人群中弱代謝型（*5/*5、*5/*15、*15/*15）患者占比1.20%（11/918），同華南及云南地區(qū)分布比例接近，這可能與華中地區(qū)以漢族人群為主，民族多樣性不強(qiáng)有關(guān)?？梢娙A中地區(qū)漢族人群服用等量他汀藥物后血藥濃度低于其它種族人群，患肌病的風(fēng)險(xiǎn)性也相對(duì)更低。

因此，華中地區(qū)漢族人群的SLCO1B1 388A＞G和521T＞C基因突變具有自己的特點(diǎn)，臨床用藥時(shí)可根據(jù)這一特點(diǎn)適當(dāng)調(diào)整給藥劑量。

由上可知，APOE、SLCO1B1基因多態(tài)性檢測(cè)對(duì)他汀類藥物的療效有重要聯(lián)系，不同的基因型其用藥風(fēng)險(xiǎn)不同，所使用的的藥物劑量也有較大差異；華中地區(qū)漢族人群大部分人群對(duì)他汀類藥物的敏感性較高（98.69%），只有極少數(shù)人群對(duì)他汀耐受性較差（1.31%），臨床需要提高警惕，尤其是人群中分布較少的SLCO1B1弱代謝型（*5/*5、*5/*15、*15/*15）及APOE風(fēng)險(xiǎn)類基因型（ε3/ε4、ε4/ε4）患者，加強(qiáng)臨床用藥指導(dǎo)及健康管理至關(guān)重要。

因此，檢測(cè)SLCO1B1與APOE基因多態(tài)性檢測(cè)對(duì)實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療具有重要意義，正在使用或考慮使用他汀類藥物進(jìn)行治療的患者進(jìn)行SL?CO1B1和ApoE基因多態(tài)性檢測(cè)，可實(shí)現(xiàn)個(gè)體化用藥和安全用藥。