MAPK信號(hào)通路及STAT3、STAT5A/B在銀屑病皮損中表達(dá)增高

劉鳳杰 栗玉珍

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院皮膚科（哈爾濱150001）

銀屑病是一種常見的慢性炎癥性皮膚病，病因復(fù)雜，主要由遺傳、免疫、環(huán)境相互作用引起，病理表現(xiàn)為皮膚淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、表皮增生及角化不全[1]。有絲分裂原激活蛋白激酶（mitogen?activated protein kinase，MAPK）是一種重要的生長(zhǎng)信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、應(yīng)激、炎癥以及免疫反應(yīng)等多種生理和病理過程發(fā)揮重要作用[2]。研究較為廣泛的通路為p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）和c?Jun氨基末端激酶（c?Jun N?terminal kinase，JNK）。

信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transduc?ers and activators of transcription 3，STAT3）、STAT5A/B、蛋白 S6激酶 1（170 kDa ribosomal proteinS6 ki?nase，p70S6k）、核因子?кB（nuclear factor?кB，NF?кB）、鈣反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cyclic?AMP response?binding protein，CREB）均屬于MAPK下游的相關(guān)因子。ERK1/2影響細(xì)胞增殖、分化，作用于NF?кB直接調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)[3]。CREB是Ras/ERK、P13激酶/AKt、應(yīng)激狀態(tài)誘導(dǎo)的p38 MAPK通路等的磷酸化底物，參與細(xì)胞形態(tài)變化[4]。Akt與Erk1/2均可以作用于p70S6K及真核啟動(dòng)因子調(diào)節(jié)下游蛋白質(zhì)的表達(dá)，與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[5]。在腫瘤炎性微環(huán)境中，Src家族激酶（Src family ki?nase，SFK）可通過激活 MAPK（包括 JNK、p38、ERK1/2等）通路上調(diào)STAT3的磷酸化水平[6]。

目前研究表明部分因子在銀屑病發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，但存在各種不同結(jié)果。本文以MAPK信號(hào)通路相關(guān)的9種因子p38、ERK1/2、Akt、STAT3、STAT5A/B、JNK、p70S6k、NF?кB、CREB 為研究對(duì)象，檢測(cè)它們?cè)阢y屑病皮損中的具體蛋白表達(dá)情況。

1 資料與方法

1.1 一般資料所有尋常型銀屑病皮損于2017年3-9月在哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院皮膚科收集，共27例（銀屑病組），其中女13例，男14例，年齡10～74歲，平均（36.3±17.2）歲。平均皮損面積和嚴(yán)重程度指數(shù)（PASI）評(píng)分為（6.46±3.7）分。局部麻醉（1%利多卡因）后，以手術(shù)切取法從每例患者皮損處取出至少4 mm的活檢組織，并將其儲(chǔ)存在液氮中。受試者在皮膚活檢前至少2周未接受局部治療，至少1個(gè)月未接受全身免疫抑制治療，3個(gè)月內(nèi)未接受系統(tǒng)維A酸類藥物治療。另外，同時(shí)收集哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院進(jìn)行整形手術(shù)的正常皮膚組織（4～10 mm）19例作為對(duì)照組。女13例，男6例，年齡13～68歲，平均（34.5±15.0）歲。本研究經(jīng)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)及所有患者或監(jiān)護(hù)人（18歲以下患者）簽署知情同意書。

1.2 主要試劑Multi?Pathway 9?plex Magnetic Bead Panel 96?well Plate（美國(guó)Luminex公司）；磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑，RIPA，BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)品等（羅氏和碧云天公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法從液氮中取出凍存的標(biāo)本，用組織研磨儀研磨，RIPA細(xì)胞裂解液冰上裂解細(xì)胞，BCA法測(cè)定蛋白濃度。嚴(yán)格按照Multi?Pathway 9?plex Magnetic Bead Panel 96?well Plate說明書進(jìn)行操作，制備10 000 pg/mL標(biāo)準(zhǔn)品、高濃度和低濃度質(zhì)控品及9種細(xì)胞因子混合磁珠，并將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋5倍制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，蛋白標(biāo)本于室溫融化混勻，離心（13 000 r/min、4℃、10 min、離心半徑6 cm）后取上清。將25 μL標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品及待測(cè)樣本分別與25 μL預(yù)混磁珠和25 μL緩沖液混合，4℃搖床過夜。將反應(yīng)體系置于磁板上60 s，清洗，加25 μL MILLIPLEX?MAP檢測(cè)抗體室溫下震蕩1 h，加25 μL顯色劑室溫下震蕩反應(yīng)30 min。將反應(yīng)體系置于磁板上60 s，清洗，加入150 μL鞘液并使用Luminex公司液相芯片分析系統(tǒng)進(jìn)行9種因子定量分析。樣本均采用復(fù)孔，結(jié)果取平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SAS 9.1.3軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，蛋白表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)描述采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（滿足正態(tài)分布）或中位數(shù)和四分位數(shù)間距（不滿足正態(tài)分布）表示，銀屑病組和對(duì)照組蛋白表達(dá)量的差異性分析采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，變量間的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)（滿足雙變量正態(tài)分布）或Spearman秩相關(guān)（不滿足雙變量正態(tài)分布）；采用Origin軟件繪制箱式圖。

2 結(jié)果

2.1 JNK、p38、ERK1/2、STAT3、STAT5的蛋白表達(dá)量比較t檢驗(yàn)和Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示，銀屑病組和對(duì)照組JNK、p38、ERK1/2、STAT3、STAT5的蛋白表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且均表現(xiàn)為銀屑病組的表達(dá)量高于對(duì)照組。見表1和圖1、2。

表1 蛋白表達(dá)量的差異性分析結(jié)果Tab.1 Analysis of protein expression levels

2.2 部分因子間的相關(guān)性分析結(jié)果Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果顯示，STAT5與p38、ERK1/2、JNK、STAT3之間均呈正相關(guān)。見表2。

3 討論

圖1 對(duì)照組與銀屑病組p38、ERK1/2、JNK MAPK的蛋白表達(dá)Fig.1 Compare the p38，ERK1/2，JNK MAPK between PV patients and controls

圖2 對(duì)照組與銀屑病組SATA3、STAT5的蛋白表達(dá)Fig.2 Compare the SATA3，STAT5 between PV patients and controls

表2 部分因子間的相關(guān)性分析結(jié)果Tab.2 Correlation analysis between some factors

本實(shí)驗(yàn)的研究目的是定量分析9種因子在尋常型銀屑病中的蛋白表達(dá)情況，為以后更深入的研究提供更準(zhǔn)確的參考。已有研究發(fā)現(xiàn)9種因子在銀屑病中均有一定的相互作用，如ZHENG等[7]發(fā)現(xiàn)在銀屑病皮損中，p38表達(dá)明顯增高，并促進(jìn)炎癥反應(yīng)；銀屑病發(fā)病的重要炎癥因子：腫瘤壞死因子?α（TNF?α）和IL?1可激活NF?кB和MAPK通路，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖[8]；IL?22通過STAT3和ERK1/2途徑誘導(dǎo)角蛋白17（銀屑病相關(guān)性細(xì)胞角蛋白）表達(dá)，導(dǎo)致銀屑病炎癥反應(yīng)和角質(zhì)細(xì)胞異常增生等病理改變[9]；銀屑病角質(zhì)細(xì)胞中JNK受CREB調(diào)節(jié)表達(dá)增高[10]，參與炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)TNF?α、IL?17、IL?6表達(dá)[11]，這些炎癥因子也可被 p38通路調(diào)控[12-13]。因此，在銀屑病中這些因子共同作用，使角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖和凋亡，出現(xiàn)炎癥因子異常表達(dá)。

從蛋白定量看到銀屑病皮損處JNK、p38、ERK1/2、STAT3、STAT5的蛋白表達(dá)均較正常皮膚增高，在銀屑病皮損中含量較高且變化最大的是p38，提示p38在銀屑病發(fā)病進(jìn)程中發(fā)揮較為重要的作用。

很多銀屑病一線用藥也發(fā)現(xiàn)與這些因子相關(guān)，尤其是p38 MAPK。研究表明阿達(dá)木單抗可以抑制p38 MAPK和ERK1/2，可能是阿達(dá)木單抗治療銀屑病作用的機(jī)制之一[14]；這與復(fù)方甘草酸苷治療銀屑病的機(jī)制有相似之處，通過抑制p38 MAPK和ERK1/2及NF?кB來治療銀屑病皮損的炎癥反應(yīng)[15]；阿維A可能通過降低STAT1和STAT3依賴機(jī)制的表達(dá)抑制銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖[16]；芍藥甙能明顯抑制銀屑病JNK和p38 MAPK的表達(dá)[17]等等，為治療銀屑病提供一個(gè)更好的研究方向。

本研究首次發(fā)現(xiàn)STAT5在銀屑病皮損中表達(dá)增高，STAT3與STAT5同屬信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子，在細(xì)胞內(nèi)（T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等[18-19]）作用機(jī)制非常廣泛，可相互調(diào)節(jié)，但兩者有時(shí)介導(dǎo)不同甚至相反的生物效應(yīng)。例如IL?6介導(dǎo)激活STAT3與STAT5，驅(qū)動(dòng)Th9細(xì)胞的活化[20]，產(chǎn)生的IL?9能增加銀屑病患者皮膚損傷[21]。但也有研究表明，STAT5與STAT3有部分共同的基因位點(diǎn)，STAT5可抑制STAT3表達(dá)，從而抑制Th17細(xì)胞分化[22]（Th17細(xì)胞已知在銀屑病中發(fā)揮重要作用，其主要產(chǎn)生IL?17促進(jìn)銀屑病炎癥反應(yīng)[23]）。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明STAT3與STAT5的表達(dá)呈正相關(guān)性（P=0.003 2），表明兩者之間具有協(xié)同作用，或者協(xié)同作用大于拮抗作用，且與p38、ERK1/2、JNK表達(dá)正相關(guān)，推測(cè)在銀屑病中MAPK信號(hào)通路也可能影響STAT5和STAT3途徑而發(fā)揮炎性作用。

另外本研究發(fā)現(xiàn)p38與JNK、NF?кB、ERK1/2，ERK1/2與CREB、STAT3，Akt與p70S6K，STAT5與p38、ERK1/2、JNK、STAT3之間均呈正相關(guān)（P＜0.05），也系統(tǒng)地表明了9種因子相互作用，可能共同參與銀屑病發(fā)病機(jī)制，符合銀屑病多因子共同參與的發(fā)病機(jī)制，但其具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究探索。