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    桉樹根系共生真菌的分離與鑒定

    2018-10-16 06:07:12王思佳賴文珍謝賢安胡文濤
    西北植物學報 2018年8期
    關(guān)鍵詞:尾葉菌根桉樹

    王思佳,賴文珍,謝賢安,陳 輝,唐 明,胡文濤

    (華南農(nóng)業(yè)大學 廣東省森林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點實驗室,林學與風景園林學院,廣州 510642)

    桉樹是桃金娘科(Myrtaceae)桉屬(Eucalyptus)植物的統(tǒng)稱,屬常綠高大喬木,具有生長速度快、樹干通直、適應(yīng)性強等特點,是中國南方主要的造林樹種[1]。南方酸性紅壤和磚紅壤中磷成分主要為磷酸鋁、磷酸鐵和磷酸鈣,有效磷含量低,引起桉樹生長緩慢,某些組織發(fā)生畸變等現(xiàn)象[2]。為此,大多桉樹栽培區(qū)通過施用化肥來提高桉樹生長量,而化肥又會導致土壤理化性質(zhì)不斷加劇惡化,土壤質(zhì)量下降。加之南方土壤呈酸性,磷肥很難被植物吸收,最終導致桉樹缺磷現(xiàn)象嚴重,長期使用化學肥料,不僅會對周圍環(huán)境造成污染,還會導致土壤肥力退化[1]。

    菌根(mycorrhiza)是土壤中某些真菌與植物根系形成的共生體,具有促進植物吸收水分和磷素等礦質(zhì)營養(yǎng),提高植物生長量,增強植物抗逆能力和改良森林土壤結(jié)構(gòu)特性等重要作用[3-5]。外生菌根(ectomycorrhizas,ECM)和叢枝菌根(arbuscular mycorrhiza,AM)是林木菌根的主要類型[5]。深色有隔內(nèi)生真菌(dark septate endophytic fungi,DSE)廣泛存在于植物根圍,是一類能夠定殖在植物根系的真菌類群,被認為是“特殊的菌根菌”[6],并且能夠與菌根真菌共同存在于植物根系中[7-8]。

    桉樹是既可以形成AM,又可以形成ECM的樹種[9]。AM真菌可以在一定程度上提高桉樹對磷的高效利用,并且能夠緩解桉樹受到土壤中鋁離子的毒害[5]。ECM真菌對桉樹青枯病的生物防治有重要意義[10]。朱天輝等[11]對四川省范圍內(nèi)的巨桉(Eucalyptusgrandis)、尾葉桉(Eucalyptusurophylla)、藍桉(Eucalyptusglobulus)、大葉桉(Eucalyptusrobusta)ECM真菌調(diào)查,發(fā)現(xiàn)9科11屬17種ECM真菌,梁洪萍[12]在四川省內(nèi)的巨桉發(fā)現(xiàn)7科、10屬、17種ECM真菌,但這些ECM真菌多為野外調(diào)查發(fā)現(xiàn),與桉樹的共生效應(yīng)研究很少。為發(fā)掘優(yōu)良的桉樹共生真菌資源,本研究通過對桉樹根系真菌侵染率的測定和真菌的分離鑒定,將真菌回接桉樹,經(jīng)柯赫氏法則(Koch's Rule)確定桉樹共生真菌,為進一步研究共生真菌促進桉樹生長、增加磷素營養(yǎng)吸收的機制,以及應(yīng)用共生真菌提高桉樹造林成活率、生物量和木材產(chǎn)量提供科學依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 樣品采集

    尾葉桉、窿緣桉(Eucalyptusexserta)和尾巨桉(E.urophylla×E.grandis)采自華南農(nóng)業(yè)大學樹木園和增城教學科研基地,位于N23°09′10″~23°14′22″,E113°20′22″~113°37′56″,屬于亞熱帶季風氣候和亞熱帶海洋性氣候,土壤為赤紅壤。2017年11月采集樣品,在樹冠的投影區(qū)內(nèi)取30~40 cm范圍內(nèi)土層的樹木側(cè)根作為根樣,將根上的大塊泥土輕輕抖掉,其余泥土連同根系一起裝入密封袋中,同種桉樹放入同一密封袋中,封口標記。根樣帶回實驗室后,一部分用于立即觀察根系的形態(tài)結(jié)構(gòu)和共生真菌的分離,另一部分用于侵染率的測定。

    1.2 試驗方法

    1.2.1共生真菌的侵染率統(tǒng)計將采集的根樣沖洗干凈,采用透明壓片法對根系進行透明、酸化、臺盼藍染色和脫色后,在顯微鏡下統(tǒng)計菌根侵染情況[13],參照Trouvelot 等[14]的方法統(tǒng)計AM真菌和ECM真菌的侵染率及侵染強度。

    1.2.2共生真菌的分離培養(yǎng)采用組織分離法分離真菌。將根系洗去泥土,剪成1~2 cm根段,在體式顯微鏡下找出帶有共生真菌結(jié)構(gòu)的根尖,經(jīng)3%次氯酸鈉表面消毒2~3 min,無菌水中沖洗后,剪成0.5~1 cm的根段,置入PDA培養(yǎng)基內(nèi),25 ℃恒溫倒置培養(yǎng)[5]。

    待培養(yǎng)基內(nèi)長出菌絲后進行純化,經(jīng)過純化后的菌株一部分進行插片培養(yǎng)[15],待菌絲長到玻片中部,用于真菌的形態(tài)學鑒定。另一部分純化菌株接種到PDA斜面,4 ℃冰箱保存,用于分子鑒定。

    1.2.3真菌的形態(tài)學鑒定觀察菌落的表面特征、形狀、顏色、大小、光滑度等菌落特征,記錄其生長狀況。顯微鏡下觀察菌絲的顏色、是否分隔、分枝情況;觀察分生孢子的形狀、顏色、大小、細胞壁特征、有無子囊(擔子)及子囊孢子(擔孢子)等特征。根據(jù)真菌分類文獻,并參閱近幾年有關(guān)真菌鑒定的文獻對分離菌株進行形態(tài)學鑒定[16-18]。

    1.2.4真菌的分子生物學鑒定將純化的真菌在25 ℃培養(yǎng)2周后,收集新鮮菌絲進行ITS序列分析。參照Zhou等[19]研究方法,采用真菌DNA微量提取試劑盒(Omega公司,D3195-01)提取DNA。ITS序列擴增引物選擇真菌ITS區(qū)通用引物ITS1-F和ITS4(ITS1-F: CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA;ITS4: TCCTCCGCTTATTGATATGC)[20],由生工生物技術(shù)有限公司合成。

    通過PCR反應(yīng)擴增真菌ITS rDNA基因。反應(yīng)體系20 μL[10 μL Premix Tap(Sangon Biotech)、0.5 μL ITS4、0.5 μL IFS1-F、1 μL PCR產(chǎn)物和8 μL ddH2O]。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火25 s,72 ℃延伸1 min,35個循環(huán);最終72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳(100 V,40 min),采用膠回收試劑盒(OMEGA公司,D2500)進行PCR產(chǎn)物回收?;厥债a(chǎn)物采用TaKaRa公司pMD18-T試劑盒進行T/A連接并克隆轉(zhuǎn)化。連接反應(yīng)體系5 μL(2 μL pMD18-T、0.5 μL Insert DNA和2.5 μL Solution Ⅰ),37 ℃培養(yǎng)過夜,送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進行雙向測序。

    將真菌測序所得的ITS序列在NCBI中運用BLAST工具進行比對分析,并從NCBI中下載已知同源序列,用軟件MEGA(Version 5.1)進行比對,用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。使用Maximum Composite Likelihood 方法計算Bootstrap值,估測系統(tǒng)發(fā)育樹的置信度。

    1.2.5共生真菌的回接將沙子、蛭石(體積比為1∶1)在121 ℃滅菌60 min,裝滿體積為0.3 L的花盆中,參考劉茂軍等[21]的方法并做適當修改,將分離出的共生真菌回接到巨桉組培苗(來自中國林業(yè)科學研究院熱帶林業(yè)研究所),每株接種20個直徑5 mm的菌餅,每組3個重復。將接種好的植株套袋,在組培室內(nèi)培養(yǎng)(溫度25 ℃,濕度60%,光強5 000 Lux),半個月后取下套袋;定期澆水,2個月后,收獲接種苗,檢測根系共生真菌的定殖情況并測定侵染率。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 共生真菌侵染率統(tǒng)計

    觀察到尾葉桉、窿緣桉和尾巨桉均能被菌根真菌侵染,其中窿緣桉的AM真菌侵染率最高,達到58.75%,侵染強度14.54%;其次是尾巨桉,AM真菌侵染率為51.33%,侵染強度15.74%;尾葉桉最低,侵染率為48.67%,侵染強度為11.03%(表1)。與AM真菌侵染率相比,ECM真菌的侵染率相對較低,尾葉桉、尾巨桉和窿緣桉3種桉樹的ECM真菌侵染率依次為11.03%、13.02%和15.00%,侵染強度為1.64%、1.60%和0.81%(表1)。經(jīng)方差分析,尾葉桉、窿緣桉和尾巨桉3種桉樹AM真菌總侵染率差異不顯著(P>0.05),ECM真菌總侵染率差異也不顯著(P>0.05)。

    對3種桉樹共生真菌侵染特征觀察,發(fā)現(xiàn)尾葉桉(圖1,A~C)和尾巨桉(圖1,D~F)都同時具有AM真菌結(jié)構(gòu)、ECM真菌結(jié)構(gòu)和DSE結(jié)構(gòu),窿緣桉具有AM真菌結(jié)構(gòu)(圖1,G)和ECM真菌結(jié)構(gòu)(圖1,H、I)。3種桉樹的AM真菌結(jié)構(gòu)和ECM真菌結(jié)構(gòu)都比較明顯,典型的深色有隔內(nèi)生真菌結(jié)構(gòu)在尾葉桉和尾巨桉都有觀察到。

    尾葉桉、窿緣桉和尾巨桉3種桉樹根尖均存在外生菌根的菌套結(jié)構(gòu)(圖2)。但3種桉樹的外生菌根形態(tài)不同,其中尾巨桉為單軸分枝狀(圖2,A),窿緣桉為單軸分枝和二叉分枝(圖2,B、C),尾葉桉的菌根形態(tài)呈二叉分枝狀(圖2,D~F)。外生菌根的菌根形態(tài)特征是鑒定外生菌根真菌的依據(jù)之一,說明外界自然環(huán)境下,本研究采樣點的尾巨桉和尾葉桉分別與1種外生菌根真菌形成菌根,窿緣桉與2種外生菌根真菌形成菌根。

    表1 桉樹根系菌根真菌侵染狀況

    A~C.尾葉桉;D~F. 尾巨桉;G~I.窿緣桉;a. 菌套結(jié)構(gòu);b. 深色有隔內(nèi)生真菌;c. 根內(nèi)菌絲;d. 叢枝結(jié)構(gòu);e. 泡囊;f. 根外菌絲圖1 桉樹根系中的菌絲結(jié)構(gòu)A-C. Eucalyptus urophylla;D-F. E. urophylla × E. grandis;G-I.Eucalyptus exserta; a. Mantle;b. Dark septate endophytes;c. Internal hyphae;d. Arbuscule;e. Vesicle;f. External hyphaeFig.1 Mycelium structure in Eucalyptus roots

    圖2 桉樹根系外生菌根真菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)Fig.2 Ectomycorrhizas in Eucalyptus roots

    2.2 桉樹共生真菌的形態(tài)特征

    從3種桉樹根系共分離出6株共生真菌,標記為WY1、WY3、WY9、LY1、WJ1、WJ5。在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d,形成的菌落顏色呈白色、淡黃色或者深灰色;形狀為圓形或橢圓形;菌絲致密或稀疏(圖3);其中WY1生長速度最快,25℃恒溫培養(yǎng)20 d菌落直徑為9 cm,最快長滿平板;其次為WY3、WJ5和LY1,菌落直徑分別為8.5 cm、8.6 cm和9 cm;WY9和WJ1則生長比較緩慢,菌落直徑為5.4 cm和4.4 cm。插片培養(yǎng)的蓋玻片置于載玻片上,顯微鏡觀察的菌絲形態(tài)(圖4),菌落特征和形態(tài)特征描述見表2。

    從PDA培養(yǎng)基的菌落特征(圖3)以及顯微鏡下的菌絲形態(tài)觀察(圖4),可以看出WJ5、WY3、WY9和LY1的菌落顏色呈深色,菌絲有隔,都具有典型的深色有隔內(nèi)生真菌的特征,初步推斷為DSE。而WY1和WJ1的菌落呈白色,菌絲無色,推測屬于擔子菌亞門(Basidiomycotina)。參照真菌形態(tài)和分類描述的特征,鑒定出WY3為莖點霉屬(Phomasp.),WY9為鐮刀霉屬(Fusariumsp.),LY1為擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsis),WY1為小皮傘屬(Marasmiussp.),WJ1為裸腳傘屬(Gymnopussp.),WJ5為傘狀霉屬(Umbelopsissp.)。

    A. WY1;B. WY3;C. WY9;D. WJ1;E. WJ5;F. LY1圖3 分離菌株在PDA培養(yǎng)基上生長20 d后的菌落形態(tài)Fig.3 The isolated fungus colonies on PDA medium after 20 days

    A. WY1;B. WY3;C~D. WJ5;E~G. LY1;H. WJ1;I. WY9圖4 分離的真菌的菌絲和孢子形態(tài)Fig.4 The mycelium and spore morphology of isolated fungi

    2.3 共生真菌的分子鑒定

    提取根系共生真菌DNA后,利用引物ITS1-F和ITS4,對提取的DNA菌液進行PCR擴增,在凝膠成像系統(tǒng)中看到清晰的條帶(圖5)。將真菌測序所得的ITS序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫后,在線運用BLAST工具進行比對,結(jié)果顯示:WY1和WJ1與GenBank中的JN943601.1和MF100988.1菌株有95%以上的相似度,結(jié)合形態(tài)特征確定它們?yōu)閾泳鷣嗛T中不同屬的2種外生菌根真菌,分別為三色小皮傘菌(M.tricolor)和黑柄裸腳傘(G.melanopus);WY3、WY9、WJ5和LY1分別與GenBank中莖點霉屬、鐮刀霉屬、二型傘霉(U.dimorpha)和芒弗里亞擬盤多毛孢(P.mangifolia)有94%以上的相似度(表3)。

    將真菌測序所得的ITS序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫,運用BLAST工具進行比對,并從NCBI下載GenBank數(shù)據(jù)庫內(nèi)已知同源序列,用軟件MEGA(Version 5.1)進行對比分析,用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖6),可以看到,6株真菌(紅色☆標出)分為3個類群,隸屬于擔子菌亞門、接合菌亞門(Zygomycotina)和半知菌亞門(Deuteromycotina)。其中擔子菌亞門單獨成一類群,包括WY1和WJ1;接合菌亞門包括WJ5;WY3、WY9和LY1同屬半知菌亞門,其中LY1和WY9有極高的相似度。

    表2 真菌菌落特征和形態(tài)特征

    表3 桉樹根系共生真菌rDNA ITS序列Blast比對結(jié)果

    圖5 分離真菌DNA的PCR產(chǎn)物1%瓊脂凝膠電泳Fig.5 PCR products of isolated fungi on 1% agar gel electrophoresis

    綜合形態(tài)特征和ITS序列分析,確定6種真菌隸屬3亞門5目6科6屬。其中,半知菌亞門、瘤座孢菌目(Tuberculariales)、瘤座孢菌科(Tuberculariaceae)、鐮刀霉屬,分離自尾葉桉;球殼孢目(Sphaeropsidales)、球殼孢科(Sphaerioidaceae)、莖點霉屬,分離自尾葉桉;黑盤孢菌目(Melanconiales)、黑盤孢菌科(Melanconiaceae)、擬盤多毛孢屬、芒弗里亞擬盤多毛孢,分離自窿緣桉。擔子菌亞門、傘菌目(Agaricales)、小皮傘科(Marasmiaceae)、裸腳傘屬、黑柄裸腳傘,分離自尾巨桉;白蘑科(Tricholomataceae),小皮傘屬、三色小皮傘菌,分離自尾葉桉。接合菌亞門、毛霉目(Mucorales)、傘狀霉科(Mucoraceae)、傘狀霉屬、二型傘霉,分離自尾巨桉。

    圖6 基于18S rDNA ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Neighbor-joining phylogenetic tree based on 18S rDNA ITS sequences

    A~B. 三色小皮傘菌;C~D. 芒弗里亞擬盤多毛孢;E~F. 二型傘霉;G. 鐮刀霉屬;H. 黑柄裸腳傘;I. 莖點霉屬a. 根外菌絲;b. 深色有隔內(nèi)生真菌;c. 微菌核;d. 根內(nèi)菌絲圖7 分離的真菌在回接根系上形成的菌絲結(jié)構(gòu)A-B. M. tricolor;C-D. P. mangifolia;E-F. U. dimorpha;G. Fusarium sp.;H. G. melanopus;I. Phoma sp.a. External hyphae;b. Dark septate endophytes;c. Microsclerotia;d. Internal hyphaeFig.7 Mycelium structures of isolated fungi formed in re-inoculated roots after 60 days

    A~D.三色小皮傘菌;E、F.黑柄裸腳傘圖8 回接根系上的外生菌根形態(tài)A-D. M. tricolor; E-F. G. melanopusFig.8 Ectomycorrhizas formed in re-inoculated roots of Eucalyptus after 60 days

    2.4 真菌回接桉樹的侵染效應(yīng)

    2.4.1真菌與桉樹共生效應(yīng)6種真菌回接巨桉組培苗后菌絲侵染情況顯示,莖點霉屬、鐮刀霉屬、二型傘霉和芒弗里亞擬盤多毛孢4種真菌形成深色有隔菌絲和微菌核(microsclerotia)結(jié)構(gòu)(圖7),推測它們?yōu)镈SE,微菌核豐富度分別為46.8%、42.3%、56.7%和62.3%。三色小皮傘菌和黑柄裸腳傘2種真菌形成外生菌絲及菌套結(jié)構(gòu),確定為桉樹外生菌根真菌(圖8)。

    2.4.2回接后侵染率統(tǒng)計6種真菌回接無菌巨桉組培苗,測定侵染率發(fā)現(xiàn),6種真菌均能在巨桉根內(nèi)侵染,其中莖點霉屬的侵染率最高(52.2%),其次為黑柄裸腳傘(侵染率為45.3%),三色小皮傘菌、鐮刀霉屬、二型傘霉和芒弗里亞擬盤多毛孢的侵染率分別為30%、32.2%、33.2%和22.1%。

    3 討 論

    桉樹是典型的既可以形成叢枝菌根(AM),又可以形成外生菌根(ECM)的樹種[5],甚至外生菌根、叢枝菌根和兩者混合菌根同時存在[22],本研究在尾葉桉、窿緣桉和尾巨桉3種桉樹除了觀察到有ECM結(jié)構(gòu)和AM真菌結(jié)構(gòu),同時,在尾葉桉和尾巨桉中還觀察到典型的深色有隔內(nèi)生真菌結(jié)構(gòu),說明桉樹菌根真菌具有多樣性,不僅是前人報道的可以與AM真菌、ECM真菌形成混合菌根,還可以和DSE形成共生體系。

    本研究在桉樹根系中首次報道2種ECM真菌,三色小皮傘菌和黑柄裸腳傘。弓明欽等[23]對華南地區(qū)桉樹ECM真菌的調(diào)查發(fā)現(xiàn)11種,優(yōu)勢菌為多根硬皮馬勃(SclerodermapolyrhizumPers);朱天輝等[11]和梁洪萍[12]分別發(fā)現(xiàn)四川桉樹有17種ECM真菌,都與本次分離到的2種ECM真菌不同,不同樹種、不同生態(tài)環(huán)境會影響菌根真菌的種類和多樣性。三色小皮傘菌具有產(chǎn)漆酶的特性,漆酶屬于木質(zhì)素降解酶類,可參與植物細胞壁的形成,還可去木質(zhì)素,在環(huán)境修復、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域用途廣泛[24];黑柄裸腳傘為中國新紀錄種[25],其生物學特性有待進一步研究。

    在桉樹根系中分離得到4種內(nèi)生真菌,回接后均觀察到DSE典型的深色有隔菌絲和微菌核結(jié)構(gòu),推測它們?yōu)殍駱涓抵械腄SE,有待于進一步的研究。莖點霉屬、擬盤多毛孢屬和鐮刀霉屬是桉樹中具有一定抗菌作用的內(nèi)生真菌[26],謝玲等[27]在甘蔗(Saccharumofficinarum)根圍發(fā)現(xiàn)深色有隔內(nèi)生真菌莖點霉屬,韋繼光[28]從南山茶(Camelliasemiserrata)和短葉羅漢松(Podocarpusmacorphyllus)中分離出芒弗里亞擬盤多毛孢;格希格圖等[29]在桉樹根系中發(fā)現(xiàn)鐮刀菌(Fusarium)的存在,徐超等[30]發(fā)現(xiàn)二型傘霉可提高鐵皮石斛生長速度和增強抗旱能力。

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