擬南芥自噬蛋白ATG8e的原核表達(dá)及多克隆抗體制備

劉 希，李遠(yuǎn)鳳，齊亞飛，郁 飛

(旱區(qū)逆境生物學(xué)國家重點實驗室/西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌712100)

自噬(autophagy)是真核生物中進(jìn)化保守的、對細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)如蛋白質(zhì)或細(xì)胞器進(jìn)行降解、促進(jìn)物質(zhì)循環(huán)利用的重要過程［1－2］。在自噬發(fā)生的過程中，生物體先形成1個自噬吞噬泡(phagophore)，將細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)包裹起來，吞噬泡逐漸形成1個雙層膜自噬體(autophagosome)，其外膜會與液泡膜融合，內(nèi)膜及其包裹物(autophagic body)進(jìn)入到液泡腔被水解酶分解［3］。研究表明，一系列自噬基因(autophagy－related genes，簡稱ATG)會組成功能單元參與自噬進(jìn)程，如其中參與成膜過程的2個類泛素化系統(tǒng)——ATG8耦合系統(tǒng)［4］和ATG12耦合系統(tǒng)［5－6］。ATG8蛋白在自噬中發(fā)揮作用是一個類泛素化的過程，ATG8蛋白前體的C端被ATG4剪切，使其C端甘氨酸殘基暴露，接著被剪切后的ATG8會在ATG7(E1類似酶)催化下結(jié)合 ATG3(E2類似酶)，然后在 ATG12－ATG5·ATG16(“－”代表共價結(jié)合，“·”代表非共價結(jié)合)復(fù)合物(E3類似酶)作用下，ATG8可以與磷脂酰乙醇胺(PE)連接組成ATG8－PE［4］。ATG8－PE錨定于自噬體膜上，參與自噬體膜的形成［7］。因此可根據(jù)ATG8－PE的積累量來衡量植物的自噬程度，從而比較不同基因型植物之間自噬發(fā)生的差異，篩選能參與自噬調(diào)控途徑的新基因，對于揭示植物自噬的分子途徑具有重要意義。

自噬在植物的生長發(fā)育和脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。研究表明，擬南芥中至少有36個基因與酵母ATG基因同源且具有相似作用，參與植物的免疫反應(yīng)［8］、葉片衰老及環(huán)境脅迫應(yīng)答等［9］。為了研究植物自噬，以 ATG8家族9個成員(ATG8a～ATG8i)［10］之一的 ATG8e作為切入點，構(gòu)建 ATG8e基因的原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，用異丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ－D－thiogalactoside，簡稱IPTG)誘導(dǎo)產(chǎn)生融合蛋白GST－ATG8e，最后用切去谷胱甘肽S移換酶(glutathione S－transferase，簡稱 GST)標(biāo)簽并純化過的ATG8e免疫家兔，心臟采血后收集血清，制備多克隆抗體。為證明制備的多克隆抗體的有效性，構(gòu)建重組質(zhì)粒pBI111LATG8e，利用花序侵染法［11］轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，得到ATG8e超表達(dá)植物，提取野生型擬南芥和ATG8e超表達(dá)植物葉片總蛋白，用于免疫印跡檢測。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物、細(xì)菌和載體 野生型擬南芥Columbia(Col)、大腸桿菌TOP10菌株、大腸桿菌BL21(DE3)菌株、野生型擬南芥 cDNA、農(nóng)桿菌 GV3101菌株、二元載體 pBI111L［12］、原核表達(dá)載體pGEX－4T－1均由筆者所在實驗室留存。

1.1.2 試劑 高保真 DNA聚合酶(PrimeSTAR?HS DNA Polymerase)，Bam H I和Eco R I內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購于TaKaRa公司;DNA純化回收試劑盒(Universal DNA Purification Kit)、質(zhì)粒小提試劑盒(TIANprep Mini Plasmid Kit)購于天根生化科技(北京)有限公司;異丙基－β－D－硫代半乳糖苷(IPTG)、弗氏完全佐劑(Freund's adjuvant complete)和弗氏不完全佐劑(Freund's adjuvant incomplete)購于Sigma公司;GST標(biāo)簽蛋白純化柱填料protein Glutathione Sepharose 4 Fast Flow、凝血酶(Thrombin)、表面活性劑(SILWET?L －77)、0.45μm硝酸纖維素(Nitro Cellulose)膜購于GE Healthcare Life Science;辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白G(immunoglobulin G，簡稱IgG)購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;尿素購于Amresco公司;ECL工作液(Detection reagent 1，Detection reagent 2)購于 Bio－Rad公司;特異性引物由上海立菲生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 原核表達(dá)載體pGEX－4T－1－ATG8e的構(gòu)建 根據(jù)擬南芥官方網(wǎng)站TAIR(https://www.arabidopsis.org/)公布的ATG8e基因序列，設(shè)計引物:

F和R中下劃線的堿基序列為Bam HⅠ的酶切位點。以野生型擬南芥cDNA為模板，以F和R為上下游引物擴增ATG8e片段。PCR程序:94℃ 2 min;98℃ 10 s，53℃ 15 s，72℃ 30 s，40個循環(huán);72℃ 2 min。將PCR擴增產(chǎn)物ATG8e用Bam H I酶切后連至原核表達(dá)載體pGEX－4T－1，用轉(zhuǎn)化CaCl2法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞TOP10，挑取生長正常的單菌落搖菌，提質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗證，將鑒定結(jié)果正確的質(zhì)粒送華大基因測序。

1.2.2 融合蛋白GST－ATG8e的誘導(dǎo)表達(dá)和純化 將測序正確的重組質(zhì)粒pGEX－4T－1－ATG8e轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，挑取生長正常的單克隆于含有100μg/mL氨芐青霉素的2×YT(16 g/L胰蛋白胨，10 g/L酵母提取物，15 g/L NaCl)液體培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min培養(yǎng)至菌液D600nm約為0.8時，加誘導(dǎo)劑IPTG，使其在菌液中的終濃度為1 mmol/L，20℃、220 r/min誘導(dǎo)表達(dá)約20 h;4℃、8 000 r/min離心10 min收菌，菌體沉淀用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，簡 稱 PBS)(140 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4·7H2O，1.8 mmol/L KH2PO4，pH 值7.3)重懸;超聲破菌后，4℃、12 000 r/min離心30 min，分別收集上清液和沉淀，后者用PBS重懸。取誘導(dǎo)前菌液、誘導(dǎo)后菌液、破菌后上清液、破菌后沉淀各50μL，十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，簡稱SDS－PAGE)檢測融合蛋白GST－ATG8e的表達(dá)情況。電泳結(jié)束后，用半干轉(zhuǎn)膜儀將蛋白樣品轉(zhuǎn)到0.45μm NC膜上并用麗春紅對膜瞬時染色，之后用 TBST 緩沖液(20 mmol/L Tris－HCl，pH 值 7.5，150 mmol/L NaCl，0.1%Tween －20)洗去浮色，室溫條件下用封閉液(含0.05 g/mL脫脂奶粉的TBST緩沖液)封閉1 h，加入用封閉液稀釋的Anti－GST(1∶5 000)4℃過夜孵育，次日用TBST緩沖液洗膜3次，每次5 min，加入用封閉液稀釋的羊抗兔IgG(1∶10 000)室溫孵育1 h，用TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，加入ECL顯色液用化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)成像。

收集同樣條件下用 IPTG誘導(dǎo)的菌液400 mL，4℃、8 000 r/min離心10 min;菌體沉淀用20 mL PBS重懸;超聲破菌后，4℃、12 000 r/min離心 30 min，收集上清液并用0.45μm濾膜過濾;將過濾后的上清液與1 mL GST標(biāo)簽蛋白純化柱填料protein Glutathione Sepharose4 Fast Flow于室溫孵育1 h，4℃、3 000 r/min離心10 min;用10個柱體積的PBS洗滌柱上雜蛋白，4℃、3 000 r/min離心10 min;加入50μL凝血酶(1 U/μL)于950μL PBS中，柱上切除標(biāo)簽蛋白(室溫12～16 h)，4℃、3 000 r/min離心10 min收集酶切后的蛋白;用1 mL還原型谷胱甘肽(20 mmol/L)洗脫液洗脫標(biāo)簽蛋白。收集每步樣品50μL進(jìn)行SDS－PAGE鑒定［13］。為了得到更純凈的目的蛋白，后續(xù)對ATG8e進(jìn)行SDS－PAGE割膠純化，并以牛血清白蛋白(BSA，質(zhì)量濃度梯度依次為 1.0、0.5、0.25、0.125 mg/mL)為對照，對其濃度進(jìn)行分析評估［14］。

1.2.3 ATG8e抗血清的制備及驗證 購買3只飼養(yǎng)2個月的健康成年家兔，初免家兔的抗原是等體積ATG8e蛋白與弗氏完全佐劑的混合物，免疫劑量為200μg/只。第14天后進(jìn)行第2次免疫，第28、第42天分別進(jìn)行第3、第4次免疫，第2、3、4次加強免疫家兔所用抗原是等體積ATG8e蛋白與弗氏不完全佐劑的混合物［15］，免疫劑量為100μg/只。3次加強免疫之后，對家兔心臟采血，將其血液于37℃放置1 h，4℃冰箱過夜，4℃、14 000 r/min離心10 min，收集血清并分裝，于 －80℃ 儲存?zhèn)溆谩?/p>

分別吸取0.3、3、30 ng純化后的ATG8e蛋白進(jìn)行SDSPAGE。以ATG8e兔抗血清(1∶1 000)為一抗，羊抗兔IgG(1∶10 000)為二抗，進(jìn)行免疫印跡檢測。

1.2.4 純化 ATG8e兔抗血清 取約 0.6 mg純化后的ATG8e進(jìn)行SDS－PAGE;電泳結(jié)束以后，用半干轉(zhuǎn)膜儀將蛋白樣品轉(zhuǎn)到 0.45μm NC膜上;在室溫條件下，用含0.05 g/mL 脫脂奶粉的 TBS緩沖液(20 mmol/L Tris－HCl，pH值 7.4，500 mmol/L NaCl，0.05%Tween －20)將抗原結(jié)合區(qū)域封閉1 h;之后將膜切成約為2 mm2小方塊，裝入含有ATG8e抗血清的離心管中，4℃過夜孵育;次日用TBS緩沖液洗膜3 次，每次 5 min;用PBS(20 mmol/L Na3PO4，pH 值 7.2，150 mmol/L NaCl)洗膜3次，每次5 min;加入500μL洗脫液(100 mmol/L甘氨酸，pH值2.5)，室溫孵育10 min;吸取洗脫液甘氨酸于新的1.5 mL離心管中，加入50μL 1 mol/L Tris－HCl(pH值8.0)，彈甩混勻，測濃度并分裝后于－80℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 ATG8e超表達(dá)植物的獲得

1.2.5.1 構(gòu)建pBI111L－ATG8e重組載體 用限制性內(nèi)切酶Bam HⅠ從pGEX－4T－1－ATG8e上切下ATG8e基因片段，連接到同樣用Bam HⅠ酶切的載體pBI111L上，用轉(zhuǎn)化CaCl2法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞TOP10，挑取生長正常的單菌落搖菌，提質(zhì)粒酶切驗證。

1.2.5.2 花序侵染法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥植株 將重組質(zhì)粒pBI111L－ATG8e電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101菌株，挑取單克隆于加入50μg/mL慶大霉素、50μg/mL卡那霉素、25μg/mL利福平的LB液體培養(yǎng)基中，28℃、220 r/min培養(yǎng)，至D600nm約為1.2時收菌;菌體用500 mL滲透緩沖液［5%蔗糖(質(zhì)量濃度)，0.05%(體積分?jǐn)?shù))SILWET?L －77］重懸;將側(cè)枝豐富的野生型擬南芥植株進(jìn)行蘸花，時間約為45 s;蘸花后植物上收取的種子為轉(zhuǎn)基因T1代。

1.2.5.3 ATG8e超表達(dá)T3代植物的獲得 T1代植株用含有50μg/mL卡那霉素的MS培養(yǎng)基初篩，將挑出的綠色植物移栽到基質(zhì)土上繼續(xù)生長，待植物果莢成熟后，單顆收取T2代種子;T2代轉(zhuǎn)基因植株的鑒定主要從蛋白水平上檢測ATG8e的表達(dá)，挑選出ATG8e高表達(dá)植株單株收取T3代種子;對T3代植株分別從ATG8e RNA轉(zhuǎn)錄水平以及蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測。

1.2.6 ATG8e多克隆抗體特異性檢測 取在基質(zhì)土上生長3周齡的野生型擬南芥和ATG8e超表達(dá)T3代植株葉片于1.5 mL離心管內(nèi)并稱質(zhì)量。將各組植物樣品研磨成粉末，1 mg植物量加入10μL蛋白提取液(125 mmol/L Tris－HCl，pH 值6.8，20%甘油，4%SDS，1% β － 巰基乙醇)，65 ℃干浴處理2 h，14 000 r/min離心10 min，吸上清液于新的1.5 mL離心管內(nèi)，－80℃儲存?zhèn)溆谩Ｈ?0μL植物蛋白樣品進(jìn)行尿素－SDS－PAGE(6 mol/L尿素)，用已制備的ATG8e多克隆抗體進(jìn)行免疫印跡檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 鑒定pGEX－4T－1－ATG8e原核表達(dá)載體

將構(gòu)建的原核表達(dá)載體pGEX－4T－1－ATG8e用Bam HⅠ酶切鑒定插入，得到5 000 bp的載體骨架和約為370 bp的目的片段(圖1的泳道1和泳道2)。之后用Eco RⅠ鑒定插入方向，瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)5 000 bp的載體骨架以及為約為300 bp的片段插入(圖1的泳道3和泳道4)，對插入方向為正向的2號重組質(zhì)粒測序。測序結(jié)果完全準(zhǔn)確，表明成功構(gòu)建了pGEX－4T－1－ATG8e載體。

2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化

對誘導(dǎo)前菌液、誘導(dǎo)后菌液、破菌后上清液、破菌后沉淀4個樣品進(jìn)行SDS－PAGE(圖2)。在誘導(dǎo)后菌液和破菌后的上清液樣品中均檢測到高表達(dá)量的蛋白條帶(37～50 ku)(圖2的泳道2和泳道3)，說明該蛋白在試驗條件下是可誘導(dǎo)的，且大部分是以可溶性形式存在的。已知GST－ATG8e分子量理論值為40 ku，根據(jù)膠圖結(jié)果推測極有可能成功誘導(dǎo)表達(dá)了融合蛋白GST－ATG8e;為進(jìn)一步確定誘導(dǎo)高表達(dá)的為融合蛋白GST－ATG8e，用Anti－GST做免疫印跡，檢測到大小和融合蛋白GST－ATG8e分子量吻合的特異性條帶，說明融合蛋白GST－ATG8e在大腸桿菌中成功表達(dá)。

將融合蛋白GST－ATG8e經(jīng)谷胱甘肽瓊脂糖凝膠樹脂親和純化，用凝血酶酶切去除GST標(biāo)簽，之后對ATG8e進(jìn)行SDS－PAGE割膠再純化。用 BSA(質(zhì)量濃度依次為1.0、0.5、0.25、0.125 mg/mL)定量，測得 ATG8e 質(zhì)量濃度約為0.3 mg/mL(圖3)。

2.3 ATG8e多克隆抗體的效價檢測和制備

用分離純化得到的ATG8e蛋白免疫家兔，收集免疫4次后的兔抗血清做免疫印跡檢測。結(jié)果顯示，1∶1 000稀釋后的ATG8e兔抗血清能清晰檢測到3 ng ATG8e蛋白(圖4)。證明兔抗血清效價比較高，后續(xù)可以純化抗血清制備高質(zhì)量的ATG8e多克隆抗體。

2.4 ATG8e多克隆抗體對擬南芥內(nèi)源ATG8e蛋白的特異性檢測

提取3周齡野生型擬南芥和2#、3#ATG8eOE(OE表示基因過表達(dá))T3代植株葉片cDNA，做半定量PCR檢測ATG8e在2種基因型植株中的表達(dá)水平(圖5)，以UBQ10作為內(nèi)參。結(jié)果顯示，2#、3#ATG8eOET3代植株ATG8e的表達(dá)量相較于野生型擬南芥植株明顯增多。之后提取野生型擬南芥和2#、3#ATG8eOET3代植株葉片蛋白，每孔上樣10μL進(jìn)行Urea－SDS－PAGE(6 mol/L Urea)電泳，Anti－ATG8e多克隆抗體免疫印跡檢測結(jié)果如圖6所示。以野生型擬南芥為對照，2#、3#ATG8eOET3代植株葉片蛋白樣品中 ATG8e和ATG8e－PE的積累量明顯上調(diào)，盡管ATG8e－PE分子質(zhì)量比ATG8e大，但是由于ATG8e－PE疏水性極強，其遷移率較ATG8e快［16］;對應(yīng)的是其考馬斯亮藍(lán)染液染膠結(jié)果，表明樣品上樣量一致性很高。這說明制備的ATG8e多克隆抗體能夠特異性識別擬南芥內(nèi)源ATG8e。

3 討論與結(jié)論

已有報道表明，自噬相關(guān)基因在真核生物進(jìn)化中高度保守［10］，說明自噬對于機體正常有序的生命活動具有重要意義。在動物中，自噬與癌癥、神經(jīng)衰退型疾病、長壽有關(guān)［17］。在植物體中，自噬與脅迫響應(yīng)［8］、病原體侵害［18］、衰老［19］相關(guān)。ATG8基因在細(xì)胞自噬過程中發(fā)揮了重要作用，由于ATG8家族的ATG8e在細(xì)胞內(nèi)主要以ATG8e和ATG8e－PE這2種形式存在，后者可以通過PE基團錨定在自噬體膜上，參與自噬體成膜過程［7］，ATG8e－PE的積累量能夠表征植物個體自噬發(fā)生的程度。通常檢測植物體自噬的分子標(biāo)記有2種，一是單丹磺酰尸胺染色［20］，它的缺點是可以使自噬體及所有酸性液泡都被染色，屬于非特異性的，不是最佳自噬檢測方法。二是ATG8蛋白的N端加綠色熒光蛋白GFP［20－22］，可以在熒光顯微鏡下觀察ATG8的定位，也可以利用GFP多克隆抗體做免疫印跡檢測GFP－ATG8和剪切后游離的GFP積累量，間接估計自噬的程度，還可以用ATG8e蛋白多克隆抗體檢測植物內(nèi)源ATG8e和ATG8e－PE積累量，這對于研究自噬很有價值。另外，利用制備的ATG8e多克隆抗體做免疫印跡，可檢測不同基因型擬南芥植株在非生物脅迫響應(yīng)，如營養(yǎng)饑餓、氧脅迫、干旱等條件下，不同藥物如刀豆素 A(concanamycin A)、E－64d、BTH 等處理時 ATG8e和ATG8e－PE的積累量，從而表征植物自噬發(fā)生的程度，是研究植物體自噬的有效工具。

本研究構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX－4T－1－ATG8e，在大腸桿菌系統(tǒng)下誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白GST－ATG8e，但引進(jìn)標(biāo)簽GST所占比例過大，可能會影響目的蛋白活性，決定用切除標(biāo)簽GST的ATG8e蛋白免疫健康成年家兔制備多克隆抗體。本試驗采用凝血酶酶切40 ku融合蛋白GST－ATG8e，將其分為14 ku的ATG8e和26 ku的GST 2個部分，14 ku的ATG8e因無GST結(jié)合位點，故從GST柱上流穿，而帶有26 ku GST標(biāo)簽的融合蛋白會結(jié)合在柱子上，這樣就可以將目的蛋白ATG8e與融合蛋白GST－ATG8e成功分離［23］。為了得到高效價的ATG8e蛋白，不僅先用GST柱親和純化，還將凝血酶處理的目的蛋白進(jìn)行SDS－PAGE割膠再純化。最后在檢測植物內(nèi)源ATG8e表達(dá)量時，不僅用了野生型擬南芥植株，還采用ATG8e過表達(dá)材料ATG8eOET3代充分證實制備的ATG8e多克隆抗體有效。