基于HRM技術(shù)的小麥光周期基因功能標(biāo)記的開發(fā)和應(yīng)用

李立群，程 顯，殷 楠，鄭錦娟，任慧麗，南春芹，楊智全

(西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌712100)

小麥光周期反應(yīng)特性及春化作用直接影響小麥品種的利用、種植區(qū)劃、引種及栽培技術(shù)，間接影響產(chǎn)量、抗病、抗逆等許多重要的農(nóng)藝性狀［1］。挖掘小麥光周期基因及其春化特性，對于利用分子育種選育小麥新品種具有重大意義。

筆者所在課題組通過同源克隆得到與小麥春化作用和光周期密切相關(guān)的小麥光周期基因TaCO9－1A，該基因冬性品種較春性品種的第二外顯子在321 bp處有6個堿基的缺失，關(guān)聯(lián)分析表明，該等位變異與抽穗期及開花期顯著關(guān)聯(lián)，是一個與冬春性相關(guān)的基因［2］。

高分辨率熔解曲線分析技術(shù)(high resolution melting curve，簡稱HRM)是一種基于堿基熔解溫度差異所形成的不同熔解曲線的基因分析新技術(shù)。該分析技術(shù)因具有通量高、成本低、結(jié)果準(zhǔn)確、不受檢測位點(diǎn)限制等優(yōu)點(diǎn)得到普遍關(guān)注［3－5］。尤其對于多樣本基因分型、突變掃描、甲基化分析、序列匹配等檢測優(yōu)勢顯著［6－8］。目前，在醫(yī)學(xué)疾病診斷、蔬菜、果樹等作物種質(zhì)資源和新品種鑒定方面應(yīng)用較廣［9－11］，但在小麥中的應(yīng)用研究才剛剛起步。

本研究依據(jù)TaCO9－1A基因在冬春性品種中的序列差異，開發(fā)標(biāo)記，利用高分辨率熔解曲線分析技術(shù)對223份小麥品種及冬春品種雜交的F2代群體進(jìn)行基因分型，并采用傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)進(jìn)行分型驗(yàn)證。田間表型及基因型相關(guān)分析表明，該標(biāo)記及高通量分子檢測方法可以快速、簡單地區(qū)分小麥的冬春性。本研究對于分子標(biāo)記輔助選擇育種、品種冬春性檢測及品種區(qū)劃等具有重要的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)所用材料為典型的強(qiáng)冬性小麥品種中麥895和春性小麥品種寧春4號以及其他來自不同麥區(qū)的223份自然群體。2個分離群體，即春性品種揚(yáng)麥14與冬性品種中麥895雜交后代103株F2代及其對應(yīng)的F3代株系(群體Ⅰ);揚(yáng)麥14和冬性品種陜農(nóng)56雜交后代297株F2代及其對應(yīng)的F3代株系(群體Ⅱ)。

2個雜交組合的F2代于2014年10月種植在西北農(nóng)林科技大學(xué)斗口綜合試驗(yàn)站，對標(biāo)記的植株單株收獲，脫粒。F3代于2015年10月種植在楊凌榮華種業(yè)有限公司試驗(yàn)田，2行種植，行長1 m，行距25 cm，自然群體于2014年及2015年10月種植在西北農(nóng)林科技大學(xué)北校試驗(yàn)田，按常規(guī)田間管理。

試驗(yàn)所用的主要儀器包括羅氏熒光定量PCR儀LightCycler96、北京君意JY－5000電泳儀及JY－CX3B電泳槽、Bio－Rad C1000基因擴(kuò)增儀等。

1.2 方法

1.2.1 小麥DNA的提取 2014年11月對自然群體葉片進(jìn)行取材以提取基因組DNA;對標(biāo)記的F2代群體材料葉片進(jìn)行取樣，并提取葉片基因組DNA，每份材料取0.2～0.3 g新鮮葉片，用液氮預(yù)冷后粉碎并放入1.5 mL離心管中，按照十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyl trimethyl ammonium bromide，簡稱CTAB)方法提取小麥基因組DNA。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，簡稱NCBI)網(wǎng)站中公布的TaCO9基因序列(Gene登錄號:236233)參照設(shè)計(jì)引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，純化方式為聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，簡稱PAGE)。試驗(yàn)所用的 TWS［T代表小麥(Triticum aestivum L.)，W代表冬性(winter)，S代表春性(spring)］標(biāo)記擴(kuò)增引物，上游引物F:5'－GGAAGAGGCGGCGGTA CGAG－3';下游引物 R:5'－GAGCGGAACCACCCGAGGTC －3'。

1.2.3 HRM分析技術(shù)反應(yīng)體系及程序 PCR和HRM分析過程均在羅氏LightCycler@96上進(jìn)行，反應(yīng)條件見表1。HRM的反應(yīng)體系為 20μL:80 ng模板 DNA，上下游引物各0.4 μmol/L，10 μL LightCycler HRM Master Mix(Roche)，1.5 mol/L Mg2+(Roche)，其余用ddH2O補(bǔ)足。HRM分析反應(yīng)程序中首先是普通PCR反應(yīng)程序，得到PCR產(chǎn)物后進(jìn)行HRM分析。

表1 HRM分析技術(shù)反應(yīng)條件

1.2.4 HRM擴(kuò)增產(chǎn)物的序列分析 本研究采用品種中麥895和寧春4號的HRM反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離，將目標(biāo)片段切膠回收，用pMD18－T載體進(jìn)行克隆，由生工生物工程(上海)股份有限公司測序。每個品種至少測定10個克隆，以確保核苷酸序列的準(zhǔn)確性。引物的擴(kuò)增產(chǎn)物序列等位變異采用DNAMAN軟件進(jìn)行分析，并在NCBI數(shù)據(jù)庫上進(jìn)行比對。

1.2.5 小麥TaCO9－1A基因功能標(biāo)記檢測群體的多態(tài)性利用TWS引物對樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)采用25μL體系:10×PCR 緩沖液(含 Mg2+)2.5 μL，dNTP Mix(各2.5 mmol/L)2.0 μL，10 μmol/L 上、下游引物各 1 μL，模板DNA 1 μL，5 U/μL Taq DNA 聚合酶0.125 μL，用ddH2O 補(bǔ)至25μL。擴(kuò)增程序:94℃ 5 min;94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃30 s，32個循環(huán);72℃ 10 min。用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，記錄帶型。

1.2.6 田間性狀調(diào)查及其關(guān)聯(lián)分析 對田間種植材料的抽穗期和開花期進(jìn)行調(diào)查，記錄日期。小區(qū)60%以上的穗部露出2/3記為抽穗，小區(qū)60%以上的穗中部小穗開花記為開花。其中F2∶3群體抽穗期和開花期以平均值替代。用Excel 2007對田間表型數(shù)據(jù)進(jìn)行初步處理，然后使用SPSS軟件對不同基因型所對應(yīng)表型平均值進(jìn)行t檢驗(yàn)和Duncan's檢驗(yàn)(由于表型數(shù)據(jù)為日期且多為4月份，因此以4月1日為參考標(biāo)準(zhǔn)，將其換算成具體時(shí)間，例如4月16日等同于16 d，5月3號等同于33 d)。

2 結(jié)果與分析

2.1 HRM技術(shù)分析中麥895和寧春4號的基因型

用特異TWS標(biāo)記引物對材料中麥895和寧春4號進(jìn)行HRM分析，結(jié)果顯示，這2個材料的高分辨率熔解曲線差異明顯(圖1)，這是由于中麥895的擴(kuò)增產(chǎn)物有6 bp堿基的缺失，而寧春4號有6 bp堿基的插入，因此產(chǎn)生了2種截然不同的熔解曲線，將寧春4號命名為春性小麥(TS)基因型材料，將中麥895命名為冬性小麥(TW)基因型材料。

2.2 擴(kuò)增產(chǎn)物的序列分析

通過比對TWS引物擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)寧春4號的擴(kuò)增產(chǎn)物序列比中麥895的序列多6個堿基的插入(圖2)。說明HRM分析的熔解曲線的差異是由TaCO9－1A基因6 bp堿基的插入/缺失引起的。

2.3 HRM技術(shù)對自然群體的基因分型

將中麥895與寧春4號作為對照，利用HRM技術(shù)分析自然群體材料的TS基因型與TW基因型，高分辨率熔解曲線與寧春4號相近的材料為TS基因型，與中麥895相近的材料為TW基因型。結(jié)果顯示，在223份材料中有99份材料的熔解曲線與寧春4號的熔解曲線相近，124份材料的熔解曲線與中麥895的熔解曲線相近(具體材料未列表)，由此得出供試材料中TS基因型材料有99份，TW基因型材料有124份(圖3)，表明HRM分析技術(shù)能夠用于基因堿基缺失/插入等位變異的高通量分子檢測。

2.4 自然群體中TaCO9－1A基因型多態(tài)性檢測

利用特異TWS標(biāo)記對223份供試小麥品種TaCO9－1A基因多態(tài)性進(jìn)行檢測，聚丙烯酰氨凝膠電泳結(jié)果顯示，99份小麥帶型與寧春4號的TS型一致，124份小麥帶型與中麥895的TW型一致(圖4)。該檢測結(jié)果與HRM基因分型結(jié)果完全相同，說明HRM技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)高通量分子檢測。

2.5 F2代群體的TaCO9－1A基因型分析

利用HRM分析技術(shù)對揚(yáng)麥14/中麥895、揚(yáng)麥14/陜農(nóng)56 2個組合的F2代群體進(jìn)行檢測，得到與圖3相似的基因分型圖。再利用傳統(tǒng)的PAGE技術(shù)進(jìn)行TaCO9－1A的遺傳多態(tài)性分析，PAGE結(jié)果顯示3種帶型:1種199 bp的條帶(TS型)、1種193 bp的條帶(TW型)和既有199 bp也有193 bp的條帶(TS/W型)。103株群體Ⅰ中，22株為TS型，50株為TS/W型，31株為TW型;297株群體Ⅱ中，60株為TS型，157株為TS/W型，80株為TW型(圖5)，分型結(jié)果與HRM分型結(jié)果完全一致。且F2代基因型TS型 ∶TS/W型 ∶TW型=1∶2∶1的分離比例，表明利用該標(biāo)記的2種方法都可以在育種的分離群體中進(jìn)行基因分型。

2.6 自然群體基因型與田間表型的相關(guān)性

根據(jù)苗期、抽穗期和開花期的生長發(fā)育情況綜合判斷小麥品種冬春性。由表2可知，供試材料的抽穗期、開花期在2015年及2016年整體差別不大。具有TS型TaCO9－1A基因的小麥品種抽穗期或開花期較早［(14±2.14)d～(23±1.86)d］，而具有TW型TaCO9－1A基因的小麥品種抽穗期或開花期較晚［(22±2.47)d～(29±2.80)d］，且 TS型品種的平均抽穗期、開花期分別比TW型品種提早8、6 d，該標(biāo)記與抽穗期及開花期顯著關(guān)聯(lián)(p＜0.01)。

表2 部分小麥品種在不同年份的抽穗期和開花期

2.7 F2代群體的基因型與F2∶3群體田間表型的相關(guān)性

對2個F2∶3群體的小麥材料抽穗期和開花期進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，用SPSS軟件分別對2個群體不同基因型的表型數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，2個群體中均檢測到各基因型間抽穗期和開花期的差異達(dá)到了極顯著水平?？梢奣aCO9－1A基因中6 bp堿基的插入/缺失突變會使小麥春冬性相關(guān)性狀的日期顯著提前。由TWS標(biāo)記判定的冬春性小麥品種與田間表現(xiàn)及資料記載的基本一致，說明利用該分子標(biāo)記檢測的小麥的冬春性具有較高的準(zhǔn)確性。

3 討論

HRM分析是一種高度靈敏、快速掃描PCR擴(kuò)增產(chǎn)物內(nèi)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，簡稱SNP)變異的簡單有效的方法［12］，該技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于同源四倍體植物苜蓿和馬鈴薯的SNP基因分型和多態(tài)性檢測［13－14］。筆者所在課題組前期利用HRM技術(shù)進(jìn)行TaGW2－6A基因“T”插入突變的分子檢測，準(zhǔn)確區(qū)分籽粒大小基因型，并通過常規(guī)的Sanger測序驗(yàn)證了該方法的可靠性［15－16］。本研究利用HRM分析技術(shù)將小麥材料的冬春性明確分型?？梢姡琀RM是一種準(zhǔn)確而高效的SNP檢測和基因分型技術(shù)，解決了小麥基因位點(diǎn)單堿基突變和小片段插入/缺失高通量檢測的難題，為小麥分子標(biāo)記輔助選擇育種奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

本研究同時(shí)利用HRM分析和特異的SSR標(biāo)記的PAGE對223份不同小麥品種及2個雜交組合F2代群體進(jìn)行了TaCO9－1A基因分型，分型結(jié)果一致，TS型材料99份，TW型材料124份。相比而言，HRM操作簡單，靈敏快速、結(jié)果直觀，是一種高通量的檢測方法。

目前已報(bào)道的小麥春化基因主要有Vrn－A1、Vrn－B1和Vrn－D1，且對冬春性作用大小依次為Vrn－A1＞Vrn－B1＞Vrn－D1［17］，可根據(jù)這3種基因的不同顯隱性組成來預(yù)測小麥品種的冬春性［18－19］。但也有其他調(diào)控因子參與影響小麥的冬春性［20］。本研究結(jié)果表明，小麥光周期基因TaCO9－1A明顯影響小麥品種的抽穗期和開花期，針對該基因開發(fā)的標(biāo)記可用于小麥品種的冬春性鑒定。本研究開發(fā)的高分辨率熔解曲線分析方法為高通量分子檢測及標(biāo)記輔助選擇育種奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。