UFLC-MS/MS法測定中毒患者血清中氨氯地平的濃度

目的：利用快速高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（UFLC-MS/MS）建立血清中氨氯地平的快速定性定量分析方法，為臨床中毒患者的快速診治提供依據(jù)。方法：選用Shim-pack XR-ODS色譜柱，以乙腈10 mmol/L醋酸銨為流動相，采用梯度洗脫進(jìn)行分離，流速：0.3 ml/min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：10μl。樣品用乙腈進(jìn)行蛋白沉淀后進(jìn)樣，選用3200型質(zhì)譜儀的多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM）掃描方式進(jìn)行檢測。結(jié)果：氨氯地平的線性范圍為0.078～500 ng/ml，定量下限和最低檢測限分別為0.05 ng/ml和0.005 ng/ml。日內(nèi)精密度為2.5%，日間精密度為3.1%。結(jié)論：本研究所建立的方法快速、靈敏，重復(fù)性好，適用于氨氯地平中毒患者血液標(biāo)本的快速定性定量檢測。

氨氯地平；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；中毒

[Abstrractbjecttiive：To develop an method for the determination of the amlodipine in human serum by ultra fast liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UFLC-MS/MS）and provide proof for the poisoners′fast diagnosis.Meetthod：Amlodipine was extracted from serum by acetonitrile which was used as deproteinated solvent，and separated on a Shim-pack XR-ODS column maintained at 40℃with acetonitrile and 10 mmol/L ammonium acetate as mobile phase by gradient elution.The flow rate was 0.30 mL/min-and 10μL aliquot of residues were injected.Detection was carried out by multiple reaction monitoring on a 3200 MRM system.Ressullttss：The assay was linear over the range 0.078-500 ng/mL with a limit of quantitation of 0.05ng/mL and a limit of detection of 0.005ng/mL.The relative deviation of intra-and inter-day were 3.1%and 2.5%.Conclussiion：The method was rapid，sensitive and reliable for the determination of amlodipine in human blood serum.The assay was applied to a fast qualitative and quantitative determination of amlodipine poisoners.

氨氯地平（Amlodipine），分子式：C20H25CLN2O5，分子量：408.1，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下。

氨氯地平是一種1，4－二氫吡啶類的長效降壓藥，其終末消除半衰期約為35～50 h，7～8天后血藥濃度可達(dá)穩(wěn)態(tài)。因其具有服藥劑量低、藥效維持時間長等特點(diǎn)，目前已成為臨床一線用藥。因此，血液中氨氯地平濃度的測定顯得尤為重要。血清中氨氯地平濃度的測定主要采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，酶聯(lián)吸附免疫分析法等方法[1-2]。本實驗利用快速高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（UFLC-MS/MS）建立了一種檢測血清氨氯地平的方法，為臨床急慢性中毒患者的快速診斷和搶救提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要儀器與試劑3200型液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Applied Biosystem公司產(chǎn)品）：配有電噴霧離子化源（ESI）以及Analyst 1.5數(shù)據(jù)處理軟件；UFLC快速高效液相色譜系統(tǒng)（日本島津公司產(chǎn)品）：包括二元輸液泵、自動進(jìn)樣器、切換閥和柱溫箱；GL-88B振蕩器：江蘇海門醫(yī)療器械廠。氨氯地平對照品由中國標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心提供；乙腈、乙酸銨均為色譜純；其他試劑均為分析純；實驗用水為經(jīng)0.22μm水膜濾過的重蒸水。空白血清由解放軍第307醫(yī)院血庫提供；中毒患者血液標(biāo)本由北京市各醫(yī)院急診科提供，4 ml全血，不加抗凝劑。

1.2 溶液的配制 儲備液的配制：精密稱取1 mg氨氯地平對照品，置于100 ml容量瓶中，加入乙腈溶解，稀釋至刻度，配制成10μg/ml的儲備液。標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制：取氨氯地平儲備液適量，用65%乙腈稀釋至0.08、0.31、2.50、5.00、10.00、31.25、62.50、125.00、250.00、500.00 ng/ml待用。

1.3 色譜條件 色譜柱：Shim-pack XR-ODS色譜柱（長度100 mm，直徑3 mm，膜厚0.25μm）。流動相：乙腈10 mmol/L醋酸銨梯度洗脫，梯度條件是時間為0.1、8.0、9.0、16.0 min，乙腈濃度分別為10%、95%、95%、10%。流速：0.30 ml/min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：10μl。

1.4 質(zhì)譜條件 離子源：離子噴霧離子化源，正離子方式檢測；離子噴射電壓（IS）：5500V；溫度：550℃；源內(nèi)氣體（1Gas1）壓力：60psi；氣體（2Gas2）壓力：65 psi；氣簾氣體（CUR）壓力：30 psi；掃描方式為多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；用于定量分析的離子反應(yīng)分別為選擇m/z409.1→m/z238.0（DP電壓：27 eV；CE電壓：16 eV）和m/z409.1→m/z294.0（DP電壓：27 V；CE電壓：14 eV）

1.5 樣品的提取及凈化 取全血4 ml，離心取上層血清用0.1 mol/L NaOH調(diào)至pH=9。取血清0.5 ml加乙腈1 ml，振蕩器混勻1 min。離心分離上清液，0.25μm濾器過濾至進(jìn)樣瓶待測。

2 結(jié)果

2.1 優(yōu)化方式 取氨氯地平儲備液，用65%乙腈配制稀釋至1000 ng/L，采用針泵進(jìn)樣模式，進(jìn)行母離子、碎片離子分析，選擇4對離子反應(yīng)定性，分別為m/z409.1→m/z238.0、m/z409.1→m/z294.0、m/z409.1→m/z377.2、m/z409.1→m/z320.3。優(yōu)化離子源參數(shù)及各對DP、CE電壓參數(shù)，相應(yīng)的母離子掃描圖，見圖1；二級全掃描質(zhì)譜圖，見圖2；氨氯地平標(biāo)準(zhǔn)液的保留時間為8.97 min，見圖3。

2.2 線性范圍 取空白血清，加入標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制成對照品血清，血清經(jīng)處理后，進(jìn)樣10 ml進(jìn)行UFLC-MS/MS分析。每個濃度5個樣本，連續(xù)測量3天。以待測物峰面積（X）對濃度（Y，ng/ml）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程為Y=0.0027X-1.4598，r=0.9999。

圖1 氨氯地平母離子掃描圖

圖2 氨氯地平二級全掃描質(zhì)量圖

圖3 UFLC-MS/MS測定人全血中氨氯地平的典型色譜圖

2.3 檢出限 選擇m/z409.1→m/z238.0（DP電壓：27eV；CE電壓：16eV）和m/z409.1→m/z294.0（DP電壓：27 V；CE電壓：14 eV）為定量分析的離子反應(yīng)，信噪比（S/N）取30:1，標(biāo)準(zhǔn)液最低檢出限可達(dá)到0.005 ng/ml。

2.4 回收率及精密度測定 取0.1、10.0、500.0 ng/ml對照品血清，用乙腈提取。每濃度5樣本，連續(xù)測定3天。根據(jù)當(dāng)日的工作曲線，計算樣品的測得濃度，進(jìn)行回收率及精密度測定分析。三個濃度的平均回收率依次為109.7%、100.8%、99.6%。日內(nèi)精密度為2.5%，日間精密度為3.1%。

3 討論

在實踐工作中，氨氯地平中毒患者主要以自殺為目的主動服用者居多；其次是長期服用或未嚴(yán)格依照醫(yī)囑服用而造成的氨氯地平蓄積性中毒。氨氯地平中毒患者輕者多伴有頭暈、惡心、嘔吐等胃腸道癥狀，嚴(yán)重者會導(dǎo)致昏迷。因此，還要與胃腸道疾病和腦病進(jìn)行鑒別診斷。本方法采用的梯度洗脫條件，在保證靈敏度的前提下，能檢出大多數(shù)臨床常見藥品毒物，為臨床快速救治提供參考。據(jù)本實驗室檢測記錄統(tǒng)計，2008年至2012年間，氨氯地平中毒檢測出46例。臨床上，氨氯地平的治療量應(yīng)小于2 ng/ml。兒童的中毒劑量應(yīng)該更低。氨氯地平因其分子量大，血液透析不易清除，一般采用血液灌流或血液置換[3]。

氨氯地平血液含量很低，以往的檢測方法多采用高效液相色譜法，并不能滿足臨床需求。因氨氯地平見光易分解，整個實驗操作應(yīng)盡量避光[4]。本實驗采用UFLC-MS/MS方法快速定量血清含量，選用MRM模式定量氨氯地平藥物濃度，選用較有特異性且豐度相對較高的4對反應(yīng)離子，減少了非目標(biāo)化合物的干擾，具有選擇性好，靈敏度高，分析時間短，重復(fù)性好等特點(diǎn)。應(yīng)用此方法也可檢測尿液中氨氯地平的濃度，有利于臨床觀察不同治療方法的效果。

利用所建方法檢測了15例疑似氨氯地平急、慢性中毒患者的血清標(biāo)本。結(jié)果10例中毒患者血清中檢測到氨氯地平，濃度范圍為0.5～280 ng/ml。病例1：女，76歲。不明原因昏迷入院，初期血壓降低不明顯，6 h急送篩查鎮(zhèn)靜安眠類藥物及降血壓類藥物，血清氨氯地平濃度為280.0 ng/ml，30 h后復(fù)測降至165 ng/ml，血液灌流治療后54 h降至74 ng/ml， 7天后血清中檢測不到氨氯地平?；颊哐鍣z測全掃描圖，見圖4，與氨氯地平標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保留時間一致。病例2：男，51歲，長期服用氨氯地平6個月后送檢血液，利用本方法檢測血清氨氯地平濃度為6.9 ng/ml。病例3：女，2歲，誤服氨氯地平4 mg，3 h送檢，血清氨氯地平濃度為1.8 ng/ml。

圖4 氨氯地平中毒患者血清全掃描色譜圖

本方法針對中毒患者血清標(biāo)本，采用乙腈提取，操作簡單。利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測，建立了一種快速檢測氨氯地平的方法，為氨氯地平急慢性中毒患者的快速診斷和搶救提供了科學(xué)依據(jù)。

[1]Hotha KK，Roychowdhury S，Mullangi R，et al.Rapid quantification of amlodipine enantiomers in human plasma by LC-MS/MS：application to a clinical pharmacokinetic study[J].Biomed Chromatogr，2013，27（9）：1192-1199.

[2]王 燕，李鵬飛，馬 萍，等.LC-MS/MS法測定人血漿中氨氯地平的濃度[J].質(zhì)譜學(xué)報，2012，33（3）：181-185.

[3]梁 超，程曉華，張 紅，等.LC-MS法評價兩種苯磺酸氨氯地平片的人體生物等效性[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2007，28（3）：299-301.

[4]李金鳳.血液凈化治療氨氯地平過量中毒一例報告[J].臨床合理用藥雜志，2012，5（6c）：161-162.

（收稿：2014-03-03修回：2014-03-14編校：齊 彤）

UFLC-MS/MS法測定中毒患者血清中氨氯地平的濃度

李嘉琳，邱澤武，孫愛麗，孫成文

UFLC-MS/MS determination of amlodipine in poisoned human blood serum

LI Jia-lin，QIU Ze-wu，SUN Ai-li，SUN Cheng-wen.Poisoning treatment center,PLA 307 Hospital,Beijing 100071,China
Corresponding author：SUN Cheng-wen，E-mail：suncw163@163.com

amlodipine；UFLC-MS/MS；poison

R 994.3；O 657.7

A

2095-3496（2014）02-0087-03

100071北京，解放軍第307醫(yī)院全軍中毒救治中心（李嘉琳，邱澤武，孫愛麗，孫成文）

孫成文，E-mail：suncw163@163.com