米根霉不同菌絲體形態(tài)對重復(fù)間歇發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的影響

鄭 志，杜 威，姜紹通*，吳學(xué)鳳，李興江，羅水忠，張任遠

(合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009)

米根霉不同菌絲體形態(tài)對重復(fù)間歇發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的影響

鄭 志，杜 威，姜紹通*，吳學(xué)鳳，李興江，羅水忠，張任遠

(合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009)

研究米根霉在3L發(fā)酵罐重復(fù)間歇發(fā)酵過程中，菌體形態(tài)對發(fā)酵強度的影響。結(jié)果表明：絮狀米根霉首批發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸為105.8g/L，葡萄糖轉(zhuǎn)化率88.12%，球狀米根霉產(chǎn)L-乳酸105.0g/L，葡萄糖轉(zhuǎn)化率87.50%；在重復(fù)間歇發(fā)酵過程中，球狀米根霉前6批產(chǎn)L-乳酸均保持在80.00g/L以上，第7批產(chǎn)L-乳酸78.60g/L，葡萄糖轉(zhuǎn)化率均高于87.33%，產(chǎn)酸效率最高可達到4.26g/(L·h)，而絮狀米根霉前4批產(chǎn)L-乳酸可保持在80.00g/L以上，第5批產(chǎn)L-乳酸78.30g/L，第6批產(chǎn)L-乳酸77.40g/L，第7批產(chǎn)L-乳酸70.20g/L，產(chǎn)酸效率最高可達4.07g/(L·h)。研究數(shù)據(jù)顯示，球狀米根霉更適于重復(fù)間歇發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸。

L-乳酸；米根霉；形態(tài)；重復(fù)間歇發(fā)酵

L-乳酸是一種重要的天然有機酸，在食品、醫(yī)藥、生物降解塑料的制造上有廣泛應(yīng)用[1]。L-乳酸經(jīng)聚合作用生成生物可降解塑料聚L-乳酸，可以解決大量廢棄塑料所造成的環(huán)境污染問題，對于農(nóng)副產(chǎn)品深加工及環(huán)境保護都具有重要的意義[2-4]。米根霉以其營養(yǎng)要求粗放，菌絲體大而易于分離，L-乳酸純度高，易于精制，有利于工業(yè)化生產(chǎn)高純度的L-乳酸，成為國內(nèi)外廣泛采用發(fā)酵生產(chǎn)的菌種[5]。

米根霉深層發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸過程中，菌體表現(xiàn)出多樣的形態(tài)，主要有絮狀體、菌球、塊狀聚結(jié)物[6]。不同的菌體形態(tài)，其發(fā)酵效率有很大區(qū)別。Yu等[7]在發(fā)酵過程中通過補充硫酸氨控制米根霉保持絮狀形態(tài)，達到109.0g/L，產(chǎn)酸效率2.73g/(L·h)。Kosakai等[8]在米根霉培養(yǎng)液中加入無機載體和聚乙烯氧化物形成菌絲絮凝體，L-乳酸的產(chǎn)量為103.6g/L，產(chǎn)酸效率1.70g/(L·h)。Park等[9]利用此種絮狀體在氣升式反應(yīng)器中發(fā)酵生產(chǎn)

L-乳酸，L-乳酸的產(chǎn)量為104.6g/L，產(chǎn)酸效率1.80g/(L·h)。Liu等[10]通過優(yōu)化發(fā)酵條件得到球狀菌體，L-乳酸的產(chǎn)量為92.00g/L，產(chǎn)L-乳酸效率0.70g/(L·h)。Bai等[11]通過控制米根霉的發(fā)酵條件使其為菌球形，在大大降低發(fā)酵液黏度的同時，產(chǎn)L-乳酸達到76.10g/L，產(chǎn)酸效率2.11 g/(L·h)。Zhou等[12]研究一種小球體形態(tài)的米根霉在泡罩塔反應(yīng)器中的發(fā)酵特性，產(chǎn)酸效率為2. 58g/(L·h)。塊狀的菌體形態(tài)在發(fā)酵過程中接種量難于控制，且極大限制了菌體內(nèi)部的傳氧、傳質(zhì)，產(chǎn)物產(chǎn)量明顯偏低，一般不選用[13]。正是由于米根霉發(fā)酵過程中菌體形態(tài)不同，影響了發(fā)酵過程中傳質(zhì)、溶氧等性能，致使發(fā)酵效率有很大不同。

本實驗在確定絮狀米根霉及球狀米根霉最優(yōu)發(fā)酵條件基礎(chǔ)上，對比研究絮狀米根霉和球狀米根霉在重復(fù)間歇發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸過程中的發(fā)酵狀態(tài)，穩(wěn)定性及產(chǎn)酸效率，以期為米根霉重復(fù)間歇發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的工業(yè)化實施提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

米根霉AS3.819，保藏在PDA培養(yǎng)基上，每兩個月轉(zhuǎn)接一次斜面。孢子由PDA培養(yǎng)基產(chǎn)生，用無菌蒸餾水洗下孢子制成懸液。

1.1.2 培養(yǎng)基

菌種保藏斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(P D A)。

絮狀米根霉發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖1 2 0、(NH4)2SO43.00、KH2PO40.10、MgSO4·7H2O 0.25、ZnSO4·7H2O 0.05、NaH2PO40.25、CaCO360.00。

球狀米根霉發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖1 2 0、(NH4)2SO43、KH2PO40.15、MgSO4·7H2O 0.2 5、ZnSO4·7H2O 0.25、NaH2PO40.15、CaCO360。

間歇補料培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 90、(NH4)2SO43、KH2PO40.075、MgSO4·7H2O 0.35、 ZnSO4·7H2O 0.22、CaCO345。

1.2 方法

1.2.1 斜面培養(yǎng)

將斜面置于32℃霉菌培養(yǎng)箱，培養(yǎng)時間3d。

1.2.2 發(fā)酵罐培養(yǎng)

3L發(fā)酵罐裝入2L的培養(yǎng)液，121℃滅菌15min，接種，發(fā)酵溫度32℃，發(fā)酵罐壓力0.05MPa，絮狀米根霉攪拌速率200r/min，球狀米根霉攪拌速率400r/min，培養(yǎng)40～55h。

1.2.33 L發(fā)酵罐半連續(xù)發(fā)酵

首批發(fā)酵結(jié)束后停止攪拌，5min后，球狀米根霉沉降于發(fā)酵罐底部，15min后，絮狀米根霉沉降于發(fā)酵罐底部。通氣使發(fā)酵罐保壓在0.1MPa左右，通過壓力將發(fā)酵液從取料裝置壓出總發(fā)酵液體積的4/5，加入滅菌后的間歇補料培養(yǎng)基，繼續(xù)發(fā)酵，發(fā)酵期間參數(shù)控制同1.2.2節(jié)。

產(chǎn)酸效率按式(1)計算。

所有實驗平行重復(fù)3次，實驗結(jié)果取平均值。

1.2.4 檢測方法

L-乳酸含量測定：高效液相色譜校正的EDTA定鈣法[14]；還原糖測定：3,5-二硝基水楊酸法(DNS法)[15]；生物量測定：菌體干質(zhì)量法[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 米根霉發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的菌體形態(tài)研究

米根霉在上述成絮狀和球狀菌絲體的發(fā)酵條件下培養(yǎng)48h，分別取其菌絲體，并進行顯微觀察，結(jié)果見圖1、2。

圖1 球狀米根霉(a)和絮狀米根霉(b)形態(tài)Fig.1 Morphology ofRhizopus oryzaestrains in pellet-form and flocs-form

圖 2 球狀米根霉(a)(×100)和絮狀米根霉(b)(×400)在顯微鏡下形態(tài)Fig.2 Micrograph ofRhizopus oryzaestrains in pellet-form and flocs-form

由圖1可看出，球狀菌絲體大小較均一，小球直徑1mm左右；絮狀菌絲體則為乳白色棉絮狀。圖2顯微觀察可知，絮狀菌體菌絲粗壯，無自溶現(xiàn)象，處于生長旺盛期；球狀菌體菌球中心菌絲致密，而邊緣較為松散，屬松散型菌球。文獻[13]報道此兩種米根霉菌體形態(tài)均可正常高效發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸。

2.2 米根霉發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的動力學(xué)研究

2.2.1 首批發(fā)酵動力學(xué)

測定發(fā)酵液中的米根霉生物量、葡萄糖質(zhì)量濃度和L-乳酸質(zhì)量濃度，即研究菌體生長、糖代謝和產(chǎn)酸的動力學(xué)，結(jié)果見圖3。

圖 3 首批球狀米根霉(a)和絮狀米根霉(b)發(fā)酵動力學(xué)曲線Fig.3 Kinetic curves of fermentations byRhizopus oryzaestrains in pellet-form and flocs-form during the first batch fermentation

由圖3a可以看出，發(fā)酵初期的12h，L-乳酸和生物量很少，即菌體生長與生產(chǎn)緩慢，處于生長階段的延滯期；18h至52h，菌體迅速增長的同時L-乳酸質(zhì)量濃度也隨之迅速增加，這段時間是米根霉生長與生產(chǎn)旺盛時期，處于對數(shù)生長期；52h后乳酸質(zhì)量濃度基本保持穩(wěn)定，生物量變化不大，發(fā)酵進入穩(wěn)定期。圖3b顯示結(jié)果基本與圖3a相同，發(fā)酵初期的18h菌體生長與生產(chǎn)緩慢，24h至48h是米根霉生長與生產(chǎn)旺盛期，48h后進入穩(wěn)定期。

綜合圖3可以得出，絮狀米根霉與球狀米根霉進入穩(wěn)定期后產(chǎn)L-乳酸和生物量相當(dāng)，球狀米根霉和絮狀米根霉產(chǎn)酸分別為105.0g/L和105.8g/L，生物量分別為8.055g/L和8.202g/L。球狀米根霉首批發(fā)酵36～42h，L-乳酸對基質(zhì)得率最大為2.914g/g，而絮狀米根霉首批發(fā)酵48～52h，L-乳酸對基質(zhì)得率最大為2.893g/g，由此可知，首批發(fā)酵中，球狀米根霉和絮狀米根霉發(fā)酵效率基本相同。

2.2.2 重復(fù)批次發(fā)酵動力學(xué)

首批發(fā)酵結(jié)束后，分別使球狀和絮狀米根霉菌絲體自然沉降于發(fā)酵罐底部。通過壓力將發(fā)酵液排出4/5后，再加入補料培養(yǎng)基進行重復(fù)批次的發(fā)酵。分別測定了第3批和第6批發(fā)酵液中的葡萄糖質(zhì)量濃度和L-乳酸質(zhì)量濃度，即研究糖代謝和產(chǎn)酸的動力學(xué)，結(jié)果見圖4、5。

圖4 第3批球狀米根霉(a)和絮狀米根霉(b)發(fā)酵動力學(xué)曲線Fig.4 Kinetic curves of fermentations byRhizopus oryzaestrains in pellet-form and flocs-form during the 3rdbatch fermentation

圖5 第6批球狀米根霉(a)和絮狀米根霉(b)發(fā)酵動力學(xué)曲線Fig.5 Kinetic curves of fermentations byRhizopus oryzaestrains in pellet-form and flocs-form during the 6thbatch fermentation

由圖4可以看出，第3批時，球狀米根霉發(fā)酵19h即達到發(fā)酵終點，葡萄糖質(zhì)量濃度為1.90g/L；絮狀米霉發(fā)酵20h達到發(fā)酵終點，葡萄糖質(zhì)量濃度為2.10g/L。

由圖5可以看出，第6批時，球狀米根霉和絮狀米根霉均發(fā)酵24h達到發(fā)酵終點，葡萄糖質(zhì)量濃度分別為2.10g/L和 3.20g/L。數(shù)據(jù)顯示，球狀米根霉和絮狀米根霉在第6批發(fā)酵時，發(fā)酵時間均較第3批長，剩余葡萄糖質(zhì)量濃度均較第3批含量高，說明球狀米根霉和絮狀米根霉的產(chǎn)酸效率隨批次的增加而下降。

球狀米根霉和絮狀米根霉在重復(fù)間歇發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸過程中糖耗和產(chǎn)酸都基本趨于線性，無延滯期。這是因為米根霉細胞在首批發(fā)酵主體已增殖完畢，形成了菌絲體在后續(xù)重復(fù)批次的發(fā)酵中，繼續(xù)發(fā)酵轉(zhuǎn)化葡萄糖為L-乳酸。這樣，既減少了碳源用于生物量擴增的消耗，提高了原料葡萄糖轉(zhuǎn)化率，又極大縮短了發(fā)酵周期，從而實現(xiàn)提高發(fā)酵強度的目的。本研究結(jié)果也表明，絮狀米根霉和球狀米根霉都符合重復(fù)間歇發(fā)酵的特點，二者均可重復(fù)間歇發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸。

2.3 米根霉菌體形態(tài)對重復(fù)間歇發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸穩(wěn)定性的影響

在上述重復(fù)批次發(fā)酵中，每批次均取樣檢測L-乳酸產(chǎn)量并計算產(chǎn)酸效率，結(jié)果見圖6、7。

圖 6 米根霉形態(tài)對重復(fù)間歇發(fā)酵穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect ofRhizopus oryzaemorphology on stability of repeated intermittent fermentation

圖 7 米根霉形態(tài)對重復(fù)間歇發(fā)酵產(chǎn)酸效率的影響Fig.7 Effect ofRhizopus oryzaemorphology on fermentation efficiency of repeated intermittent fermentation

由圖6可知，球狀米根霉在前6批產(chǎn)L-乳酸質(zhì)量濃度均保持在80.00g/L以上，葡萄糖轉(zhuǎn)化率高于88.80%，在第7批時略有下降但均高于87.33%；而絮狀米根霉前4批可保持在80.00g/L以上，第5批開始下降，且至第7批時下降趨勢尤為明顯。

由圖7可知，重復(fù)間歇發(fā)酵批次中，球狀米根霉產(chǎn)酸效率最高為4.26g/(L·h)，絮狀米根霉產(chǎn)酸效率最高為4.07g/(L·h)。且在各批次產(chǎn)酸效率比較中，球狀米根霉均高于絮狀米根霉。

綜合圖6、7可知，球狀米根霉的穩(wěn)定性優(yōu)于絮狀米根霉。結(jié)合圖4、5中重復(fù)間歇發(fā)酵批次的動力學(xué)發(fā)現(xiàn)，絮狀米根霉和球狀米根霉均可重復(fù)間歇發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸，但球狀米根霉在重復(fù)間歇發(fā)酵批次中，產(chǎn)酸效率高，穩(wěn)定性好，相對絮狀米根霉而言，更適合重復(fù)間歇發(fā)酵。

3 結(jié) 論

3.1 首批罐發(fā)酵絮狀米根霉產(chǎn)L-乳酸105.8g/L，葡萄糖轉(zhuǎn)化率88.12%，球狀米根霉產(chǎn)L-乳酸105.0g/L，葡萄糖轉(zhuǎn)化率87.50%。

3.2 重復(fù)間歇發(fā)酵批次中，球狀米根霉前6批產(chǎn)L-乳酸均保持在80.00g/L以上，葡萄糖轉(zhuǎn)化率高于88.89%，產(chǎn)L-乳酸速率最高可達到4.26g/(L·h)，在第7批時產(chǎn)L-乳酸略有下降，為78.60g/L，葡萄糖轉(zhuǎn)化率為87.33%；絮狀米根霉前4批產(chǎn)L-乳酸可保持在80.00g/L以上，產(chǎn)L-乳酸速率最高可達4.07g/(L·h)，在第5批時產(chǎn)酸開始下降，至第7批時產(chǎn)L-乳酸僅為70.20g/L，葡萄糖轉(zhuǎn)化率為78.00%。

3.3 米根霉重復(fù)間歇發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸過程中，菌體形態(tài)對其生長狀態(tài)，產(chǎn)酸效率和穩(wěn)定性有很大的影響，相對于絮狀米根霉，球狀米根霉具有穩(wěn)定性好，產(chǎn)酸效率高的優(yōu)點，故球狀米根霉更適于重復(fù)間歇發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸。

[1]佟明友, 方向晨, 劉樹臣, 等. L-乳酸和聚乳酸的研究進展[J]. 石油化工, 2003, 32(8)∶ 724-728.

[2]王博彥, 金其榮. 發(fā)酵有機酸生產(chǎn)與應(yīng)用手冊[M]. 北京∶ 中國輕工業(yè)出版社, 2000∶ 33-39.

[3]YIN P M, NISHINA N, KOSAKAI Y. Enhence production of L(+)-lactic acid from corn starch in a culture of Rhizopus oryzae using an air-lift Bioreactor[J]. J Ferment Bioeng, 1997, 84(3)∶ 249-253.

[4]YU R C, HANG Y D. Kinetics of direct fermentation of agricultural commodities to L(+)-lactic acid by Rhizopus oryzae[J]. Biotechnol Lett, 1989, 11(8)∶ 597-600.

[5]趙宏宇, 趙靖, 鄭春麗, 等. 米根霉乳酸發(fā)酵的研究進展[J]. 天津化工, 2007, 21(1)∶ 7-9.

[6]白冬梅, 趙學(xué)明, 李鑫鋼, 等. 米根霉發(fā)酵生產(chǎn)L(+)-乳酸研究進展

[J]. 現(xiàn)代化工, 2002, 22(6)∶ 9-13.

[7]YU Meiching WANG Ronchi,WANG Chungyih, et al. Enhanced production of L(+)-lactic acid by floc-form culture of Rhizopus oryzae[J]. Journal of the Chinese Institute of Chemical Engineers, 2007, 38(3/4)∶223-228.

[8]KOSAKAI Y, PARK Y S, OKABE M. Enhancement of L(+)-lactic acid production using mycelial flocs of Rhizopus oryzae[J]. Biotechnol Bioeng, 1997, 55(3)∶ 461-470.

[9]PARK Y S, KOSAKAI Y, OKABE M. Efficient production of L(+)-lactic acid using mycelial catton-like flocs of Rhizopus oryzae in an airlift bioreactor[J]. Biotechnol Prog, 1998, 14(5)∶ 699-704.

[10]LIU Yan, LIAO Wei, LIU Chuanbin, et al. Optimization of L(+)-lactic acid production using pelletized gilamentous Rhizopus oryzae NRRL359 [J]. Appl Biochem Biotechnol, 2006,131(1/3)∶ 844-853.

[11]BAI Dongmei, JIA Minze. L(+)-lactic acid production by pellet-form Rhizopus oryzae R1021 in a stirred tank fermentor[J]. Chemical Engineering Science, 2003, 58(3/6)∶ 785-791.

[12]ZHOU Y, DOMINGUEZ J M, CAO N. Optimization of L(+)-lactic acid production from glucose by Rhizopus oryzae ATCC 52311[J]. Appl Biochem Biotechnol, 1999, 78(1/3)∶ 401-407.

[13]徐晴, 黃和, 李霜, 等. 深層發(fā)酵中絲狀真菌菌球形態(tài)控制的策略[J].食品科技, 2009, 34(2)∶ 13-17.

[14]鄭志, 姜紹通, 潘麗軍, 等. EDTA定鈣法測定發(fā)酵液中乳酸含量的探討[J]. 食品科學(xué), 2003, 24(3)∶ 102-105．

[15]陳毓荃. 生物化學(xué)試驗方法和技術(shù)[M]. 北京∶ 科學(xué)出版社, 2002∶ 83-86.

[16]賈士儒. 生物工藝與工程實驗技術(shù)[M]. 北京∶ 中國輕工業(yè)出版社, 2002∶ 1-4.

Effect of Mycelia Morphology of Rhizopus oryzae on Repeated Intermittent Fermentation of L-lactic Acid

ZHENG Zhi，DU Wei，JIANG Shao-tong*，WU Xue-feng，LI Xing-jiang，LUO Shui-zhong， ZHANG Ren-yuan
(School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

The effect of Rhizopus oryzae strain on fermentation intensity of L-lactic acid during repeated intermittent fermentation in a 3 L fermentor were investigated. Results demonstrated that the yields of L-lactic acid were 105.8 g/L and 105.0 g/L through in the first batch fermentation by Rhizopus oryzae strain in flocs-form and pellet-form, and glucose conversion rates were 88.12 % and 87.50%, respectively. The average yield of L-lactic acid fermentation through Rhizopus oryzae strain in pellet-form was more than 80.00 g/L during the first 6 repeated intermittent fermentations. The glucose conversion rate was higher than 87.33%, and the highest L-lactic acid productivity was 4.26 g/(L·h). However, the yield of L-lactic acid was decreased to 78.60 g/L in the 7th batch fermentation. The average yield of L-lactic acid fermentation through Rhizopus oryzae strain in flocs-form was more than 80.00 g/L during the first 4 repeated intermittent fermentations. But the yield of L-lactic acid was decreased to 78.30, 77.40 g/L and 70.20 g/L in the following 3 batches of fermentation. The highest productivity for L-lactic acid reached up to 4.07 g/(L·h).

L-lactic acid；Rhizopus oryzae；morphology；repeated intermittent fermentation

TQ921. 3

A

1002-6630(2010)09-0166-05

2009-09-02

國家“863”計劃重點項目(2007AA10Z361)

鄭志(1971—)，男，副教授，博士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。E-mail：zhengzhi@hfut.edu.cn

*通信作者：姜紹通(1954—)，男，教授，博士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品資源綜合利用。E-mail：jianshaotong@yahoo.com.cn