利用胚胎實時觀測技術(shù)預(yù)測早期胚胎的發(fā)育潛能

鄭愛燕，孟慶霞，丁潔，蒲艷，廖桂芝，李紅，王瑋

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院，蘇州市立醫(yī)院生殖與遺傳中心，蘇州 215002)

隨著囊胚培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，通過囊胚培養(yǎng)可以選擇更具生長發(fā)育潛能的胚胎，提高胚胎種植率。但是，延長胚胎在體外培養(yǎng)和發(fā)育的時間，不僅會延長治療周期、增加治療成本，還會增加體外培養(yǎng)過程中可能導(dǎo)致的胚胎表觀遺傳學(xué)的改變和其它潛在風(fēng)險。因此，我們希望能找到一種預(yù)測早期胚胎發(fā)育潛能的新方法。

胚胎實時觀測技術(shù)(Time-lapse)是一種瞬間曝光連續(xù)拍攝的成像技術(shù)，可以對胚胎進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測。與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)評分比，不僅能夠保證胚胎觀察評估過程中培養(yǎng)環(huán)境的穩(wěn)定，而且可以獲得胚胎連續(xù)動態(tài)發(fā)育圖，觀測胚胎發(fā)育過程中的非正常發(fā)育行為，如多核、異常分裂、混亂分裂、逆分裂等，進(jìn)而為選擇高發(fā)育潛能胚胎提供更多參考信息。研究表明利用Time-lapse得到的早期胚胎發(fā)育分裂時間點和異常發(fā)育行為可以預(yù)測囊胚形成和種植[1-4]，但是受培養(yǎng)體系和培養(yǎng)環(huán)境的影響，這些研究建立的模型并不適用于所有實驗室。因此，我們亟需利用Time-lapse技術(shù)找出胚胎形態(tài)動力學(xué)圖譜的特異參數(shù)，建立自己的Time-lapse預(yù)測模型。

本研究回顧性分析了2016年7月至2017年6月101例IVF Time-lapse周期，共687枚胚胎，其中532枚進(jìn)行囊胚培養(yǎng)，分析了胚胎形態(tài)動力學(xué)圖譜和異常發(fā)育行為對可用囊胚及優(yōu)質(zhì)囊胚形成的影響，試圖利用Time-lapse尋找本中心培養(yǎng)體系和培養(yǎng)環(huán)境下預(yù)測早期胚胎發(fā)育潛能的指標(biāo)。

資料與方法

一、研究對象

本中心2016年7月到2017年6月101例IVF Time-lapse周期，共687個胚胎，532枚胚胎進(jìn)行囊胚培養(yǎng)，將這些養(yǎng)囊的胚胎根據(jù)發(fā)育速度和發(fā)育質(zhì)量分為以下三組。A組：D3細(xì)胞數(shù)≥6，且胚胎碎片≤20%的胚胎，共385枚；B組：D3細(xì)胞數(shù)≥6，且胚胎碎片>20%的胚胎，共57枚；C組：D3細(xì)胞數(shù)<6的胚胎，共90枚。

二、研究方法

1.取卵受精：取卵后行常規(guī)IVF，精子濃度為5×106/ml，受精后4 h去除顆粒細(xì)胞。

2.胚胎培養(yǎng)：脫顆粒細(xì)胞的卵子放入 Embryoslide培養(yǎng)皿(Vitrolife，丹麥)，置于Embryo Scope 時差培養(yǎng)箱(Vitrolife，丹麥)進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)液為Global Total(LifeGlobal，美國)，培養(yǎng)箱環(huán)境：6.0% CO2，5.0% O2，37℃。設(shè)置拍攝間隔為10 min，連續(xù)拍攝6 d。

3.Time-lapse監(jiān)測系統(tǒng)和胚胎評分：運用Viewer D圖像分析軟件，收集2PN 胚胎資料，記錄每個胚胎的原核消失時間(tPNf)和2細(xì)胞、3細(xì)胞、4細(xì)胞、5細(xì)胞、8細(xì)胞的細(xì)胞分裂時間點(t2、t3、t4、t5、t8)，同時觀察胚胎發(fā)育異常行為，包括多核(Multi Nucleation，MN)、異常分裂(Abnormal Cleavage，AC)和逆分裂(Reverse Cleavage，RC)。本研究用以評價胚胎形態(tài)動力學(xué)的變量包括：發(fā)育至2細(xì)胞、3細(xì)胞、4細(xì)胞、5細(xì)胞和8細(xì)胞的時間(t2、t3、t4、t5和t8)、cc2(t3-t2)、cc3(t5-t3)、s2(t4-t3)和s3(t8-t5)。囊胚評分用Gardner評分體系[5]，本中心的可用囊胚標(biāo)準(zhǔn)為3BC及以上級別胚胎；優(yōu)質(zhì)囊胚為3BB以上級別胚胎；非優(yōu)質(zhì)囊胚為不夠優(yōu)質(zhì)囊胚標(biāo)準(zhǔn)的可用囊胚； 廢棄胚胎為未長成可用囊胚的胚胎。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，組間均數(shù)比較采用t檢驗，率的比較采用卡方檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、D3不同發(fā)育速度和發(fā)育質(zhì)量胚胎的囊胚形成

A組無論是可用囊胚形成率，還是優(yōu)質(zhì)囊胚形成率，均顯著高于B組和C組(P均<0.05)；B組的可用囊胚形成率顯著高于C組(P<0.05)，但是優(yōu)質(zhì)囊胚形成率在兩組間無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

二、D3不同發(fā)育速度和不同發(fā)育質(zhì)量胚胎的形態(tài)動力學(xué)指標(biāo)和異常發(fā)育行為

對于A組的胚胎，可用囊胚的t5、cc2和cc3顯著大于廢棄胚胎(P<0.05)，而t2、s2、s3、AC和RC

顯著小于廢棄胚胎(P<0.05)，其余指標(biāo)在兩者間無顯著性差異(P>0.05)(表2)；進(jìn)一步，在可用囊胚中，優(yōu)質(zhì)囊胚的t5、cc2、cc3顯著大于非優(yōu)質(zhì)囊胚(P<0.05)，s2、s3、AC和RC顯著小于非優(yōu)質(zhì)囊胚(P<0.05)，其余指標(biāo)在兩者間無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

表1 D3不同發(fā)育速度和發(fā)育質(zhì)量胚胎的囊胚形成率[n(%)]

注：與其他兩組比較，*P<0.05；與C組比較，#P<0.05

表2 A組不同質(zhì)量胚胎的發(fā)育速度及異常行為發(fā)生率[h，(x-±s),n(%)]

注：與廢棄胚胎組比較，*P<0.05。

表3 A組不同等級囊胚的發(fā)育速度及異常行為發(fā)生率[h，(x-±s),n(%)]

注：與非優(yōu)囊胚組比較，*P<0.05

表4 B組不同質(zhì)量胚胎的發(fā)育速度及異常行為發(fā)生率[h，(x-±s),n(%)]

注：與廢棄胚胎組比較，*P<0.05

對于B組，可用囊胚的cc2顯著大于廢棄胚胎(P<0.05)，其余指標(biāo)在兩組間均無顯著性差異(P>0.05)(表4)。由于可用囊胚僅20枚，未對可用囊胚進(jìn)一步分組比較。

對于C組，由于部分胚胎存在發(fā)育停滯，因此形態(tài)動力學(xué)時間點僅分析到t4。所有指標(biāo)在兩者間均無顯著性差異(P>0.05)(表5)。同B組原因，也未對可用囊胚行進(jìn)一步分組比較。

表5 C組不同質(zhì)量胚胎的發(fā)育速度及異常行為發(fā)生率[h，(x-±s),n(%)]

討 論

本研究將胚胎根據(jù)D3形態(tài)學(xué)進(jìn)行分組，探討不同類型D3胚胎的形態(tài)動力學(xué)和異常發(fā)育行為對囊胚形成的影響。結(jié)果顯示，就形態(tài)動力學(xué)而言，A組中，t5、cc2、cc3、s2和s3不僅能夠反映囊胚形成率，而且可以預(yù)測囊胚質(zhì)量；在B組，僅cc2能提示囊胚形成；而在C組，并沒找到預(yù)測囊胚形成的有效指標(biāo)。Conaghan等[6]將D3胚胎的形態(tài)學(xué)評分結(jié)合cc2、cc3，更好地預(yù)測了囊胚形成結(jié)局。Meseguer等[2]建立了一套預(yù)測胚胎種植能力的體系，在這套體系中，t5是主要指標(biāo)，然后依次是s2、cc2。而Desai等[7]則認(rèn)為tPNf、t2、t4、t8、s1、s2、s3和cc3均是預(yù)測囊胚形成的指標(biāo)?？梢钥闯?，目前預(yù)測囊胚形成的形態(tài)動力學(xué)指標(biāo)并不一致，我們推測可能原因是：(1)不同實驗室間培養(yǎng)液和培養(yǎng)環(huán)境存在差異。研究已證實胚胎培養(yǎng)液對Time-lapse數(shù)據(jù)存在影響[8]；(2)本研究將D3胚胎根據(jù)發(fā)育速度和發(fā)育質(zhì)量進(jìn)行了分組，發(fā)現(xiàn)各組間差異比較大，而已有文獻(xiàn)并未分組，因此可能研究的樣本間存在差異。值得一提的是，盡管s2和s3在B組中無顯著性差異，但是其值的變化趨勢與A組存在一致性。分析原因可能是B組樣本量不足所導(dǎo)致，如果將樣本量擴(kuò)大，s2和s3可能會出現(xiàn)顯著性差異。

在異常分裂行為方面，A組中，AC和RC影響了囊胚形成與囊胚質(zhì)量，而MN無此影響。這與以往大多數(shù)研究[9-11]結(jié)果一致。盡管如此，存在異常卵裂行為的胚胎，若發(fā)育至囊胚也具有一定種植能力，并可能出生健康嬰兒[12]。原因考慮AC1和AC2出現(xiàn)在胚胎發(fā)育的不同階段，在胚胎發(fā)育中排除異常細(xì)胞的階段不同，故而對整個胚胎發(fā)育的影響也不同。關(guān)于MN的影響，有研究認(rèn)為在胚胎發(fā)育的早期階段，絕大多數(shù)MN胚胎具有自我修復(fù)能力，可以發(fā)育為正常二倍體囊胚[13]。另一些研究表明，兩細(xì)胞階段的MN會影響胚胎種植率和胎兒出生率[14]。我們認(rèn)為這種不一致可能是收集MN的細(xì)胞階段和細(xì)胞內(nèi)存在MN數(shù)量的不同引起的。一個卵裂球中出現(xiàn)兩個細(xì)胞核比出現(xiàn)多個細(xì)胞核染色體正常的概率更大[15]。本研究中，B組和C組的MN、AC和RC均不影響囊胚形成能力，但是由于這兩組樣本數(shù)量較少，要確定異常分裂行為是否對其囊胚形成存在影響，還有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行研究。

綜上，本研究中，利用Time-lapse技術(shù)可以預(yù)測6細(xì)胞以上碎片少的形態(tài)學(xué)優(yōu)質(zhì)胚胎的發(fā)育潛能；而對于D3細(xì)胞數(shù)少或碎片多的形態(tài)學(xué)非優(yōu)質(zhì)胚胎，需擴(kuò)大樣本進(jìn)一步研究。另外，本文僅探討了Time-lapse系統(tǒng)中，胚胎形態(tài)動力學(xué)參數(shù)和異常發(fā)育行為對胚胎發(fā)育潛能的影響，關(guān)于這些指標(biāo)是否影響胚胎種植率以及胚胎染色體核型，還需要進(jìn)一步探討。